铁皮石斛DoSMT2基因的功能分析.pdf

西北植物学报 2 0 2 1 4 1 4 0 5 5 8 0 5 6 4 Acta Bot Boreal Occident Sin doi 1 0 7 6 0 6 j i s s n 1 0 0 0 4 0 2 5 2 0 2 1 0 4 0 5 5 8 h t t p x b z w x b a l l j o u r n a l n e t 收稿日期 2 0 2 1 0 1 1 4 修改稿收到日期 2 0 2 1 0 3 1 9 基金项目 福建省自然科学基金 2 0 1 8 J 0 1 1 1 9 作者简介 林江波 1 9 7 6 男 硕士 副研究员 从事农业生物技术研究 E m a i l 3 4 5 9 5 3 2 5 7 q q c o m 通信作者 戴艺民 博士 研究员 从事农业生物技术研究 E m a i l d y m t t c n 1 6 3 c o m 铁皮石斛DoSMT2基因的功能分析 林江波 王伟英 邹 晖 戴艺民 福建省农业科学院 亚热带农业研究所 福建漳州 3 6 3 0 0 5 摘 要 为了揭示铁皮石斛 Dendrobium officinale 甾醇C 2 4甲基转移酶2基因 DoSMT2 在甾醇代谢过程的功 能 该研究通过根癌农杆菌介导法将来源于铁皮石斛的DoSMT2基因转化烟草 Nicotiana tabacum 并采用q R T P C R技术检测DoSMT2基因在转基因烟草叶片中的表达 采用气相色谱质谱法分析菜油甾醇和谷甾醇的含量 结果显示 1 成功获得DoSMT2基因的开放阅读框 1 1 1 9 b p 并成功构建正义植物表达载体质粒p C X S N DoSMT2 经农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化烟草并鉴定 获得4株阳性转基因烟草植株 2 S o u t h e r n b l o t结 果表明 4株转基因烟草植株都有1条杂交信号带 而非转基因烟草植株没有 说明外源DoSMT2基因都以单拷贝 整合到4株转基因烟草基因组中 3 q R T P C R检测显示 非转基因烟草未检测到外源DoSMT2基因的表达 4 株转基因烟草都能检测到DoSMT2基因的表达 且表达水平差异极显著 各株系表达量高低依次为P 3 P 1 P 2 P 4 4 气相色谱质谱分析显示 转DoSMT2基因烟草叶片的菜油甾醇含量均极显著低于非转基因烟草叶片 而谷甾醇含量均极显著高于非转基因烟草叶片 研究表明 D o S M T 2具有催化2 4 亚甲基胆甾烯醇转化形成2 4 亚 乙基胆甾烯醇活性 关键词 铁皮石斛 甾醇C 2 4甲基转移酶 烟草 遗传转化 功能 中图分类号 Q 7 8 5 Q 7 8 6 Q 7 8 9文献标志码 A Functional Analyses of DoSMT2 Gene Isolated from Dendrobium officinale L I N J i a n g b o W A N G W e i y i n g Z O U H u i D A I Y i m i n F u j i a n A c a d e m y o f A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s S u b t r o p i c a l A g r i c u l t u r e R e s e a r c h I n s t i t u t e Z h a n g z h o u F u j i a n 3 6 3 0 0 5 C h i n a Abstract I n o r d e r t o r e v e a l t h e f u n c t i o n o f t h e s t e r o l C 2 4 m e t h y l t r a n s f e r a s e 2 g e n e DoSMT2 i n t h e s t e r o l m e t a b o l i s m p r o c e s s o f Dendrobium officinale w e f i r s t l y t r a n s f o r m e d t h e DoSMT2 g e n e i n t o t o b a c c o Nicotiana tabacum b y Agrobacterium tumefaciens m e d i a t e d m e t h o d q R T P C R w a s t h e n a p p l i e d t o d e t e c t e d t h e DoSMT2 g e n e e x p r e s s i o n i n t r a n s g e n i c t o b a c c o l e a v e s a n d t h e c o n t e n t s o f b r a s s i n o s t e r o l a n d s i t o s t e r o l w e r e a n a l y z e d b y G C M S T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t 1 a 1 1 1 9 b p o p e n r e a d i n g f r a m e O R F o f DoSMT2 g e n e w a s s u c c e s s f u l l y o b t a i n e d t h e r e a f t e r t h e s e n s e p l a n t e x p r e s s i o n v e c t o r p C X S N DoSMT2 w a s s u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e d t o o F o u r p o s i t i v e t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s w e r e o b t a i n e d a n d i d e n t i f i e d b y t o b a c c o l e a f d i s c t r a n s f o r m a t i o n t h r o u g h A tumefaciens m e d i a t e d m e t h o d 2 S o u t h e r n b l o t r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r e w a s a h y b r i d i z a t i o n s i g n a l b a n d i n a l l t h e f o u r t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s w h i l e i t w a s n o t f o u n d i n n o n t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s w h i c h i n d i c a t e d t h a t t h e f o r e i g n g e n e DoSMT2 w a s i n t e g r a t e d i n t o t h e g e n o m e o f t h e t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s i n a s i n g l e c o p y m o d e 3 T h e DoSMT2 g e n e e x p r e s s i o n w a s n o t d e t e c t e d i n n o n t r a n s g e n i c t o b a c c o w h i l e t h e e x p r e s s i o n o f DoSMT2 g e n e c o u l d b e d e t e c t e d i n a l l f o u r t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s b y q R T P C R a n d t h e d i f f e r e n c e o f e x p r e s s i o n l e v e l w a s s i g n i f i c a n t T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f e a c h l i n e w a s P 3 P 1 P 2 P 4 i n t u r n 4 T h e G C M S a n a l y s i s r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e c o n t e n t o f c a m p e s t e r o l i n t r a n s g e n i c t o b a c c o l e a v e s w a s s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h a t i n n o n t r a n s g e n i c t o b a c c o l e a v e s w h i l e t h e c o n t e n t o f s i t o s t e r o l i n t r a n s g e n i c t o b a c c o l e a v e s w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i n n o n t r a n s g e n i c t o b a c c o l e a v e s T h i s s t u d y i n d i c a t e d t h a t t h e D o S M T 2 p r o t e i n h a d t h e c a t a l y t i c a c t i v i t y i n t h e t r a n s f o r m a t i o n f r o m 2 4 m e t h y l e n e l o p h e n o l t o 2 4 e t h y l i d e n e l o p h e n o l Key words Dendrobium officinale s t e r o l C 2 4 m e t h y l t r a n s f e r a s e t o b a c c o g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n f u n c t i o n 植物甾醇是一类甾体类植物天然活性物质 具 有延缓衰老 1 抗氧化 2 和抗肿瘤 3 等功效 植物 甾醇根据侧链C 2 4位上烷基的有无分为无烷基甾 醇 甲基甾醇和乙基甾醇 菜油甾醇和菜籽甾醇属于 甲基甾醇 豆甾醇和 谷甾醇属于乙基甾醇 4 5 周 海玥等 6 研究发现 豆甾醇和 谷甾醇具有改善非 酒精性脂肪肝肝细胞脂肪变性程度及减轻氧化应激 反应的作用 张硕等 7 研究发现白花蛇舌草豆甾醇 具有抑制肝癌细胞增殖 促进癌细胞凋亡的作用 周 玲玉等 8 研究发现 谷甾醇可以诱导人肺癌A 5 4 9 细胞G 2 M期细胞周期阻滞 引起癌细胞凋亡 甾 醇C 2 4甲基转移酶2 S M T 2 催化2 4 亚甲基胆甾 烯醇合成2 4 亚乙基胆甾烯醇 9 1 0 是乙基甾醇合成 关键酶 开展SMT2基因功能研究对研究植物甾醇 的代谢和调控具有重要意义 目前 已经从多种植 物中克隆到SMT2基因 1 1 1 3 但是开展SMT2基 因功能研究的还少有报道 铁皮石斛 Dendrobium officinale 是兰科 O r c h i d a c e a e 石斛属 Dendrobium S w 的名贵中药 材 位列 中华九大仙草 之首 其功效成分主要有多 糖 石斛碱 黄酮和甾醇类等 1 4 1 8 具有提高免疫力 和抗肿瘤等生理活性 1 9 2 2 本课题组基于对铁皮 石斛茎和叶的转录组测序 分析了铁皮石斛植物甾 醇的代谢途径 分3个阶段 5 0个u n i g e n e s 3 0种 酶 参与 铁皮石斛甾醇C 2 4甲基转移酶2基因 DoSMT2 在叶的表达量高于茎 生长期高于成熟 期 2 3 克隆了铁皮石斛DoSMT2基因的全长c D N A序列 生物信息学分析结果表明D o S M T 2蛋白 属于A d o M e t M T a s e s超级家族 含有4个S 腺苷 蛋氨酸结合位点 1个甲基转移酶保守结构域和1 个甾醇甲基转移酶C末端保守结构域 与深圳拟兰 Apostasia shenzhenica 的S M T 2亲缘关系最 近 2 4 本研究构建了DoSMT2基因正义植物表达 载体 利用农杆菌介导遗传转化烟草 分析 DoSMT2基因功能 以期为进一步了解铁皮石斛植 物甾醇代谢机理奠定基础 1 材料和方法 1 1 试验材料 大肠杆菌 Esherichia coli D H 5 菌株 根癌 农杆菌 Agrobacterium tumefaciens E H A 1 0 5菌 株 P c x S N植物表达载体和烟草 Nicotiana taba cum N C 8 9无菌试管苗由本实验室保存 Xcm 购自N E B公司 2 A c c u r a t e T a q M a s t e r M i x d y e p l u s S t e a d y P u r e植物R N A提取试 剂盒和S Y B R G r e e n Pro Taq H S 预混型q P C R试 剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司 D N A L i g a t i o n K i t V e r 2 1和P r i m e S c r i p t T M 逆转录酶购 自宝生物工程 大连 有限公司 头孢噻肟钠 c e f o t a x i m e s o d i u m 特泯菌 t i m e n t i n 乙酰丁香酮 a c e t o s y r i n g o n e 潮霉素 B 溶液 h y g r o m y c i n B s o l u t i o n D N A胶回收试剂盒 U N I Q 1 0柱式质粒 小量抽提试剂盒购自生工生物工程 上海 股份有限 公司 菜油甾醇 L o t B 0 4 0 8 A S 和谷甾醇 L o t N 0 6 1 5 A S 标准品购自上海源叶生物科技有限公司 1 2 方 法 1 2 1 DoSMT2基因开放阅读框的克隆 以重组 的克隆载体质粒p M D 1 9 T DoSMT2 2 4 为模板 利 用引物SMT F和SMT R 表1 扩增DoSMT2基 因的开放阅读框 P C R扩增体系5 0 L 质粒 p M D 1 9 T DoSMT2 1 L 引物 1 0 m m o l L 1 各 1 L 2 A c c u r a t e T a q M a s t e r M i x 2 5 L d d H 2 O 2 2 L P C R反应程序为 9 4 预变性5 m i n 9 4 变性3 0 s 5 8 退火3 0 s 7 2 延伸2 m i n 3 0个循 环 最后7 2 延伸1 0 m i n P C R产物经1 2 琼脂 糖凝胶电泳验证后 胶回收目的片段 1 2 2 植物表达载体的构建 植物表达载体p C X S N经Xcm 酶切 酶切产物经1 2 琼脂糖凝胶 电泳验证后 胶回收载体片段 回收产物与 DoSMT2基因的胶回收产物在1 6 连接2 h 连接 9554期 林江波 等 铁皮石斛DoSMT2基因的功能分析 体系1 0 L p C X S N酶切回收产物2 L DoSMT2基 因胶回收产物3 L S o l u t i o n I 5 L 连接产物转化 大肠肝菌D H 5 感受态细胞后 在1 0 5 r m i n 1 3 7 条件下振荡培养1 h后 菌液涂布于含卡那霉素 1 0 0 m g L 1的L B固体培养基上 3 7 倒置培养 过夜 挑取单克隆在含卡那霉素1 0 0 m g L 1的 液体L B培养基中 3 7 条件下2 0 0 r m i n 1振荡 培养过夜 提取经P C R鉴定为阳性克隆的质粒 委 托生工生物工程 上海 有限公司测序 通过序列比 对获得重组的正义植物表达载体质粒p C X S N DoSMT2 图1 1 2 3 农杆菌介导重组质粒pCXSN DoSMT2遗 传转化烟草 采用 冻融法 将重组正义植物表达载 体质粒p C X S N DoSMT2导入农杆菌E H A 1 0 5中 利用农杆菌介导的烟草叶盘转化法 2 5 将p C X S N DoSMT2基因遗传转化烟草 获得抗潮霉素的抗性 转化植株 烟草转化植株种植于温室大棚 表1 PCR引物 T a b l e 1 P C R p r i m e r s 引物P r i m e r序列S e q u e n c e 5 3 SMT F C C G G A A T T C A T G G A T A C G G C T G C G C T G C T SMT R C C G C T C G A G C T C G C C T C C A T A C T A T G A G C Hpt1 G A T G T T G G C G A C C T C G T A T T Hpt2 T C G T T A T G T T T A T C G G C A C T T T SMTB o l t F T T T C T T A T G A A T G G G T T A C G A C T G SMTB o l t R A A T T G G C T T G C G G C A G A G T SMT2 F T C A A C G A G T A C C A G G T C A G C SMT2 R T A G C C T C G A T T G A G T A A G C C NtACT F A T C C T C G C A T C C C T T A G C A C NtACT R G C C C C A C C T T C A A A G A C T C C 图1 植物表达载体p C X S N DoSMT2的构建 F i g 1 C o n s t r u c t i o n o f p l a n t e x p r e s s i o n v e c t o r p C X S N DoSMT2 1 2 4 转基因烟草的分子检测 以C T A B法提取 的烟草抗性转化植株叶片基因组D N A为模板 用 引物Hpt1和Hpt2进行P C R扩增潮霉素基因片 段 筛选抗性转化植株 产物长度为5 1 7 b p 用引 物SMTB o l t F和SMTB o l t R进行 P C R法制备地 高辛标记探针 经P C R检测为阳性的烟草植株基因 组D N A用Hind 酶切后用于S o u t h e r n b l o t S o u t h e r n b l o t委托生工生物工程 上海 股份有限 公司完成 用S t e a d y P u r e植物R N A提取试剂盒提取转 DoSMT2基因烟草叶片总R N A 用P r i m e S c r i p t T M 逆转录酶合成c D N A第1链 将合成的c D N A第1 链浓度定量为2 0 0 n g L 1 以烟草Actin基因作 为内参基因 根据S Y B R G r e e n Pro Taq H S 预混 型q P C R试剂盒的说明书进行实时荧光定量P C R 扩增 R o c h e L i g h t C y c l e r 9 6 检测外源DoSMT2 基因在不同转基因烟草中的表达情况 DoSMT2 基因引物为SMT2 F和SMT2 R 烟草Actin基因 引物为NtACT F和NtACT R 1 2 5 转基因烟草植物甾醇含量测定 转基因烟 草叶片菜油甾醇和谷甾醇的含量委托青岛科创质量 检测有限公司测定 参考李涛等 2 6 的方法 1 样品前处理 取0 5 g转基因烟草叶片粉 末 于取样瓶中 以非转基因烟草叶片为对照 加入5 m L二氯甲烷 超声波萃取2 0 m i n 6 0 0 0 r m i n 1离 心5 m i n 分离取出二氯甲烷 再加入5 m L二氯甲 烷超声波萃取1 0 m i n 离心分离取出二氯甲烷 合 并2次萃取液 用二氯甲烷定容至1 0 m L 过0 4 5 m滤膜后 进样分析 2 色谱条件 T h e r m o T G 5 M S色谱柱 3 0 m 0 2 5 m m 0 2 5 m 进样量2 L 升温程序 8 0 保持2 m i n 以2 0 m i n 1的速率升温至3 0 0 保持1 5 m i n 进样口温度为3 0 0 载气为H e 载气流速为0 8 m L m i n 1 分流比为4 0 1 3 质谱条件 离子源温度2 0 0 传输线温度 2 5 0 溶剂延迟时间3 0 0 m i n 扫描范围3 0 4 5 0 m z 离子源为E I源7 0 e V 1 3 数据处理 方差分析采用D P S软件 2 7 差异显著性用最 小显著差数法 L S D 进行平均数的多重比较 2 结果与分析 2 1 DoSMT2基因开放阅读框克隆 以重组克隆载体质粒p M D 1 9 T DoSMT2为 065西 北 植 物 学 报 4 1卷 模板 利用引物SMT F和SMT R扩增DoSMT2 基因的开放阅读框 扩增产物在1 1 1 9 b p处有1条 特异性条带 图2 胶回收目的条带 获得DoSMT2 基因的开放阅读框 2 2 植物表达载体的构建与鉴定 胶回收Xcm 酶切后植物表达载体p C X S N片段 与DoSMT2基因胶回收产物连接后转化D H 5 感受 态细胞 挑取单克隆于含有1 0 0 m g L 1卡那霉素的 液体L B培养基扩繁 经菌液P C R鉴定 图3 后 提 取阳性克隆菌株的质粒并进行测序 通过序列比对分 析 获得正义植物表达载体质粒p C X S N DoSMT2 2 3 转基因烟草基因组DNA的PCR检测 利用农杆菌介导的烟草叶盘转化法将重组正义 植物表达载体p C X S N DoSMT2遗传转化烟草 通 过潮霉素抗性筛选 共获得6株抗潮霉素烟草植株 提取6株抗潮霉素烟草植株基因组D N A 以Hpt1 和Hpt2作为引物 P C R扩增潮霉素基因片段 其 中4株能扩增到1条5 1 7 b p特异条带 图4 分别 M D L 2 0 0 0 1 2 DoSMT2 图2 DoSMT2基因开放阅读框P C R产物电泳 F i g 2 P C R p r o d u c t e l e c t r o p h o r e s i s o f DoSMT2 g e n e O R F M D L 2 0 0 0 1 3 4 DoSMT2 2 5 阴性克隆 图3 重组质粒p C X S N DoSMT2的P C R检测 M D L 2 0 0 0 1 3 4 DoSMT2 2 5 N e g a t i v e c l o n e F i g 3 P C R d e t e c t i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d p C X S N DoSMT2 用代号P 1 P 2 P 3和P 4表示 以4株能扩增到潮 霉素基因片段的烟草植株基因组D N A为模板 以 SMT F和SMT R为引物 扩增DoSMT2基因 4 株转基因烟草植株在1 1 1 9 b p处能扩增出1条特 异条带 图5 而非转基因植株没有该条带 说明外 源DoSMT2基因已经整合到烟草基因组中 2 4 转DoSMT2基因烟草基因组DNA的South ern blot检测 经过潮霉素基因和DoSMT2基因的P C R检测 为阳性的4株转基因烟草植株和非转基因烟草植株 的基因组D N A用Hind 酶切 以D I G标记的 DoSMT2基因为探针进行S o u t h e r n杂交 以 p M D 1 9 T DoSMT2为阳性对照 结果表明 4株 转基因烟草植株都有1条杂交信号带 非转基因烟 草植株没有杂交信号带 图6 说明外源DoSMT2 基因都以单拷贝整合到4株转基因烟草基因组中 M D L 2 0 0 0 1 6 潮霉素抗性植株 图4 潮霉素基因片段的P C R检测 M D L 2 0 0 0 1 6 H y g r o m y c i n r e s i s t a n t p l a n t l e t F i g 4 P C R d e t e c t i o n o f h y g r o m y c i n g e n e f r a g m e n t M D L 2 0 0 0 P 1 P 4 潮霉素抗性植株 C K 非转基因植株 C K p M D 1 9 T DoSMT2 图5 DoSMT2基因的P C R检测 M D L 2 0 0 0 P 1 P 4 H y g r o m y c i n r e s i s t a n t t o b a c c o C K N o n t r a n s g e n i c t o b a c c o C K p M D 1 9 T DoSMT2 F i g 5 P C R d e t e c t i o n o f DoSMT2 g e n e 1654期 林江波 等 铁皮石斛DoSMT2基因的功能分析 M D N A 分子量标记 P 1 P 4 转基因烟草植株 C K 非转基因烟草植株 C K p M D 1 9 T DoSMT2 图6 转DoSMT2基因烟草植株的S o u t h e r n b l o t杂交结果 M D N A m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r P 1 P 4 T r a n s g e n i c t o b a c c o C K N o n t r a n s g e n i c t o b a c c o C K p M D 1 9 T DoSMT2 F i g 6 S o u t h e r n b l o t o f t r a n s g e n i c t o b a c c o w i t h DoSMT2 g e n e C K 非转基因烟草 P 1 P 4 转基因烟草 柱上不同大写字母 表示差异极显著 P P 1 P 4 P 2 3 讨 论 植物甾醇是生物膜的组成成分 具有调节膜流 动性和渗透性的作用 甾醇C 2 4甲基转移酶 s t e r o l C 2 4 m e t h y l t r a n s f e r a s e S M T 分为S M T 1和 S M T 2两个家族 S M T 1催化C 2 4位的第一次甲 基化 完成甲基从S 腺苷甲硫氨酸到环阿屯醇的转 移 形成C 2 4甲烯基环阿屯醇 S M T 2催化C 2 4位 的第二次甲基化 形成2 4 亚乙基胆甾烯醇 2 8 S M T 2位于植物甾醇合成途径中甲基甾醇和乙 基甾醇的一个分支点 已有研究结果表明 以 C a M V 3 5 S或T E T 1作为组成型启动子 利用根癌 农杆菌把拟南芥SMT2基因转化烟草 对转基因烟 草叶片甾醇测定发现 菜油甾醇的含量下降 同时谷 甾醇的含量增加 其他甲基甾醇 乙基甾醇和总甾醇 含量与对照差异不大 说明SMT2基因主要调节植 物细胞中甲基甾醇菜油甾醇和乙基甾醇谷甾醇的含 量和比例 不改变植物细胞中总甾醇的含量 2 9 3 1 因此 通过检测转基因植株中菜油甾醇和谷甾醇含 量的变化 可以验证SMT2基因的功能 本研究以 C a M V 3 5 S作为组成型启动子 通过根癌农杆菌介 导 把DoSMT2基因遗传转化烟草 经过基因组水 平检测 获得了4株在组成型启动子C a M V 3 5 S控 制下的转DoSMT2基因烟草植株 q R T P C R技术 检测表明 DoSMT2基因在4株转基因烟草叶片中 都有表达 且表达量存在极显著的差异 通过分析 转基因烟草叶片菜油甾醇和谷甾醇的含量发现 265西 北 植 物 学 报 4 1卷 DoSMT2基因在烟草叶片中的表达量与菜油甾醇 含量呈负相关 与谷甾醇含量呈正相关 转基因烟 草植株叶片菜油甾醇含量是非转基因烟草的0 6 2 0 7 9倍 极显著降低 谷甾醇含量是非转基因烟 草的1 5 4 2 2 2倍 极显著升高 综上所述 D o S M T 2具有催化2 4 亚甲基胆甾 烯醇合成2 4 亚乙基胆甾烯醇的酶活性 本研究结 果为后续调控铁皮石斛植物甾醇生物合成及开发利 用铁皮石斛叶片植物甾醇打下了基础 参考文献 1 R U D K O W S K A I P l a n t s t e r o l s a n d s t a n o l s f o r h e a l t h y a g e i n g J Maturitas 2 0 1 0 66 2 1 5 8 1 6 2 2 吴时敏 吴谋成 马 莉 植物甾醇在菜籽高级烹调油中的抗 氧化作用 高温下抗氧化作用的研究 J 中国油脂 2 0 0 3 28 5 3 2 3 3 W U S M W U M C M A L A n t i o x i d a n t e f f e c t o f p h y t o s t e r o l s i n h i g h g r a d e r a p e s e e d c o o k i n g o i l a n t i o x i d a n t e f f e c t a t h i g h t e m p e r a t u r e J China Oils and Fats 2 0 0 3 28 5 3 2 3 3 3 曹 玫 欧阳露 植物甾醇的抗肿瘤作用及其机制研究进展 J 实用药物与临床 2 0 1 5 18 9 1 1 0 4 1 1 0 7 C A O M O U Y A N G L S t u d y o n d e v e l o p m e n t o f a n t i t u m o r e f f e c t o f p h y t o s t e r o l s J Practical Pharmacy and Clinical Remedies 2 0 1 5 18 9 1 1 0 4 1 1 0 7 4 耿敬章 梁加敏 许璐璐 等 植物甾醇的生理功能及其开发 前景 J 饮料工业 2 0 1 5 18 5 7 0 7 3 G E N G J Z L I A N G J M X U L L et al T h e p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s o f p h y t o s t e r o l a n d i t s d e v e l o p m e n t p r o s p e c t s J Beverage Industry 2 0 1 5 18 5 7 0 7 3 5 林江波 王伟英 邹 晖 等 植物甾醇生物合成与关键酶基 因研究进展 J 农业科学 2 0 1 8 3 5 7 L I N J B W A N G W Y Z O U H et al R e s e a r c h p r o g r e s s i n b i o s y n t h e s i s a n d k e y s y n t h a s e g e n e o f p h y t o s t e r o l J Agri cultural Science 2 0 1 8 3 5 7 6 周海玥 汤 威 姜 婧 等 谷甾醇与豆甾醇对非酒精性 脂肪肝作用的体外研究 J 营养学报 2 0 1 6 38 5 4 5 6 4 6 1 Z H O U H Y T A N G W J I A N G J et al E f f e c t s o f s i t o s t e r o l a n d s t i g m a s t e r o l o n n o n a l c o h o l i c f a t t y l i v e r d i s e a s e in vitro J Acta Nutrimenta Sinica 2 0 1 6 38 5 4 5 6 4 6 1 7 张 硕 岳 旺 王 蕾 等 白花蛇舌草豆甾醇对肝癌细胞 的体内外抑制作用及对其增殖周期 凋亡的影响 J 现代生 物医学进展 2 0 0 8 8 1 1 2 0 1 6 2 0 1 7 Z H A N G S Y U E W W A N G L et al I n h i b i t i v e e f f e c t o f s t i g m a s t e r o l f r o m Hedyotis diffusa W i l l d o n h e p a t o m a c e l l s in vitro vivo a n d i t s i n f l u e n c e o n t r a n s p l a n t e d H 2 2 t u m o r c e l l s m u l t i p l i c a t i o n c y c l e a p o p t o s i s J Progress in Modern Biomedicine 2 0 0 8 8 1 1 2 0 1 6 2 0 1 7 8 周玲玉 徐 彩 王乐琴 等 谷甾醇对人肺癌A 5 4 9细胞 增殖及凋亡的影响 J 国际检验医学杂志 2 0 1 6 37 7 8 6 5 8 6 7 Z H O U L Y X U C W A N G L Q et al E f f e c t o f s i t o s t e r o l o n p r o l i f e r a t i o n a n d a p o p t o s i s o f l u n g c a n c e r c e l l l i n e A 5 4 9 J International Journal of Laboratory Medicine 2 0 1 6 37 7 8 6 5 8 6 7 9 B E N V E N I S T E P B i o s y n t h e s i s a n d a c c u m u l a t i o n o f s t e r o l s J Annual Review of Plant Biology 2 0 0 4 5 5 4 2 9 4 5 7 1 0 G R E B E N O K R J G A L B R A I T H D W D E L L A P E N N A D C h a r a c t e r i z a t i o n o f Zea mays e n d o s p e r m C 2 4 s t e r o l m e t h y l t r a n s f e r a s e O n e o f t w o t y p e s o f s t e r o l m e t h y l t r a n s f e r a s e i n h i g h e r p l a n t s J Plant Molecular Biology