对韭菜迟眼蕈蚊高活性的苏云金芽胞杆菌JQD117发酵培养基及摇瓶发酵条件优化.pdf

38 2 333 341 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2022 年 4 月 收稿日期 2020 12 18 基金项目 河北省重点研发项目 19226510D 21326505D 河北省农村科学院现代农业科技创新工程 2019 1 03 河北省农林科学院科技创 新专项课题 2022KJCXZX ZBS 6 作者简介 宋健 研究员 E mail sj3250 通信作者 研究员 E mail cwplx751209 DOI 10 16409 ki 2095 039x 2021 07 013 对韭菜迟眼蕈蚊高活性的苏云金芽胞杆菌 JQD117发酵培养基 及摇瓶发酵条件优化 宋 健 张海剑 丰 硕 程佳旭 柳健虎 郭玮冰 曹伟平 河北省农林科学院植物保护研究所 河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心 农业农村部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室 保定 071000 摘要 为了提高苏云金芽胞杆菌的芽胞产量 应用响应面设计对苏云金芽胞杆菌 Bacillus thuringiensis Bt JQD117 进行发酵培养基和摇瓶发酵条件的优化 本研究在单因素试验基础上 采用响应面试验设计 方法优化培养基组分和发酵条件参数 最佳发酵培养基为棉籽饼粉 2 00 大豆饼粉 1 00 酵母粉 1 50 可溶性淀粉 2 00 CaCO 3 0 30 MnSO 4 0 04 MgSO 4 0 18 K 2 HPO 4 0 04 最佳发酵条件 接种量 3 装液量 60 mL 温度 30 转速 150 r min 初始 pH 7 5 在最佳发酵条件下理论活芽胞产量可以达 到 6 75 10 9 个 mL 试验验证后实际活芽胞产量为 5 97 10 9 个 mL 运用响应面法对 Bt 的发酵条件进行 优化 获得了提高芽胞产量的关键参数 为该菌株产业化 规模化应用奠定了基础 为韭菜迟眼蕈蚊的绿 色防控和蔬菜的安全生产提供了理论基础 关 键 词 韭菜迟眼蕈蚊 苏云金芽胞杆菌 发酵 单因素试验 响应面法 中图分类号 S476 1 文献标识码 A 文章编号 1005 9261 2022 02 0333 09 Optimization of Fermentation Culture Medium and Flask Fermentation Conditions for Bacillus thuringiensis Strain JQD117 with High Toxicity against Bradysia odoriphaga SONG Jian ZHANG Haijian FENG Shuo CHENG Jiaxu LIU Jianhu GUO Weibing CAO Weiping Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences IPM Center of Hebei Province Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China Ministry of Agriculture and Rural Affairs Baoding 071000 China Abstract Aiming to increase living spore production of a Bacillus thuringiensis Bt strain JQD117 we employed response surface analysis methods to optimize the culture medium and the flask fermentation conditions Based on preliminary results from single factor experiments we used response surface analysis to model and optimize the components of culture medium and parameters of flask fermentation conditions The best ratios of each single factors for the strain Bt JQD117 were 2 00 cotton seed cake meal 1 00 soybean meal 1 50 yeast extract 2 00 soluble starch 0 30 CaCO 3 0 04 MnSO 4 0 18 MgSO 4 and 0 04 K 2 HPO 4 For fermentation conditions the optimum parameters were 3 inoculation amount 60 mL liquid volume in flask 150 r min at 30 C and pH 7 5 Theoretically the living spore can reach 6 75 10 9 spore mL under this optimized condition The verification experiment showed that the living spore yield was 5 97 10 9 spore mL Our results have placed a critical foundation and theoretical basis for large scale application of strain JQD117 for green control of Bradysia odoriphaga and the safe production of vegetables such as leeks Key words Bradysia odoriphaga Bacillus thuringiensis fermentation single factor experiment response surface analysis 334 中 国 生 物 防 治 学 报 第 38 卷 韭菜迟眼蕈蚊 Bradysia odoriphaga Yang et Zhang 属双翅目 长角亚目 眼蕈蚊科 迟眼蕈蚊属 幼虫 俗称 韭蛆 韭菜迟眼蕈蚊是我国特有的昆虫 目前国外尚无相关的报道 1 它严重为害百合科 菊科 藜科 十字花科 葫芦科 伞形花科等 7 科 30 多种蔬菜的地下嫩茎 主根 地面附近的皮下组织等 对 韭菜的为害最为严重 2 4 目前生产上对韭菜迟眼蕈蚊的防治主要以化学防治为主 5 由于韭菜是多年生宿 根植物 长期大量使用化学农药 导致 毒韭菜 事件时有发生 随着高毒农药的禁用 寻找环境友好 安全有效的防治措施 成为防治韭菜迟眼蕈蚊急待解决的问题 苏云金芽胞杆菌 Bacillus thuringiensis Bt 属革兰氏阳性细菌 在生长代谢过程中 能够在芽胞中 形成伴胞晶体 也称为杀虫晶体蛋白 insectidal crystal proteins ICPs 或 内毒素 6 Bt 主要是经过虫口 进行感染 通过杀虫蛋白晶体杀死昆虫 一般认为其杀虫作用过程要经过溶解 酶解活化 与受体结合 插入以及孔洞或离子通道的形成等环节 7 最后导致幼虫麻痹死亡或引起败血症死亡 8 据报道 Bt 还具 有抑制作用的杀菌蛋白或多肽 9 如 Bt entomocidus HD110 产生的 Entomocin 110 能够有效的抑制单增李 斯特菌 Listeria monocytogenes 10 Bt 对环境友好 对人畜无害 目前已成为世界上产量最大的微生物农药 被广泛用于防治农业 森林 果树等害虫防治中 11 13 虽然苏云金芽胞杆菌的发酵培养对营养物质的要求不高 14 但不同的 Bt 菌株所需营养条件不尽相同 不能使用某一特定配方作为所有 Bt 菌株的发酵培养基 15 17 因此 进行 Bt 菌株发酵培养基组分和发酵条 件的选择和配比优化对提高菌株发酵产量极其重要 Bt 菌株 JQD117 是本试验室前期筛选到的一种对韭蛆具有较强杀虫活性作用的菌株 18 本研究采用单 因素和响应面分析法 以发酵液中活芽胞含量作为评价指标 对该菌株的发酵培养基进行筛选与优化 以 提高该菌株产生量 从而提高其杀韭蛆效率 为该菌株今后的工业化生产及其在农业生产上的应用提供初 步指导 1 材料与方法 1 1 供试菌株 BtJQD117 菌株保存于河北省农林科学院植物保护研究所微生物杀虫剂课题组 1 2 Bt 发酵培养基及摇瓶发酵条件优化 1 2 1 发酵培养基和发酵条件单因素爬坡试验 在初始培养条件 培养基 大豆饼粉 3 50 棉籽饼粉 1 50 可溶性淀粉 1 50 酵母粉 1 00 CaCO 3 0 20 MnSO 4 0 04 MgSO 4 0 02 K 2 HPO 4 0 05 培养条件 30 接种量 1 250 mL 三角瓶装液量 100 mL 温度 30 转速 200 r min 初始 pH 7 0 的基础上 固定其他因子 对其中一个因子的量设梯度 进行振荡培养 采用平板菌落计数 法计算活芽胞数 每个处理重复 3 次 1 2 2 响应面试验设计及数据分析 在单因素爬坡试验的基础上 得到 13 个因素的最佳值 以最佳值作 为中心点 以 Bt 芽胞产量作为响应值 采用 Box Behnken Design BBD 进行试验设计 每个因素取 1 0 1 三个水平输入 Design Expert 响应面分析软件设计 13 因素 3 水平响应面试验 表 1 分别按照试 验安排进行振荡培养 采用平板菌落计数法计算活芽胞数 将试验数据进行数据分析 获得回归方程 最 终确定因素的最佳组合 1 2 3 平板菌落计数法 根据稀释梯度计算每毫升发酵液中活菌数量 将被测样品用无菌蒸馏水稀释至 10 7 和 10 8 两个稀释梯度 将稀释后的待测样品定量均匀涂布到灭菌的细菌培养平板上 每个处理重复 3 次 30 恒温培养箱培养 24 h 进行菌落计数 并根据稀释倍数和取样量计算样品的活芽胞数 19 1 2 4 模型验证 用软件分析得出的最佳发酵培养基配方和最佳发酵条件进行 4 次平行验证试验 采用平板 菌落计数法计算活芽胞数 取得平均值 与预测值进行比较以验证模型的可靠性 进而得出最终优化结果 2 结果与分析 2 1 单因素爬坡试验结果 芽胞产量同培养基浓度和发酵条件的关系研究表明 Bt 芽胞产量随着培养基浓度增加呈先增加后减少 第 2 期 宋健等 对韭菜迟眼蕈蚊高活性的苏云金芽胞杆菌 JQD117 发酵培养基及摇瓶发酵条件优化 335 表 1 响应面试验因素与水平 Table 1 Factors and levels of response surface experiment 水平 Levels 编号 No 试验因子 Factor 1 0 1 A 大豆饼粉 Soybean meal 0 5 1 0 1 5 B 棉籽饼粉 Cotton seed cake meal 1 0 2 0 3 0 C 可溶性淀粉 Soluble starch 1 0 2 0 3 0 D 酵母粉 Yeast extract 0 5 1 5 2 5 E CaCO 3 0 1 0 3 0 F MnSO 4 0 02 0 04 0 06 G K 2 HPO 4 0 02 0 04 0 06 H MgSO 4 0 13 0 18 0 23 J 温度 Temperature 28 30 32 K 转速 Speed r min 120 150 180 L 装样量 Liquid volume in flask mL 30 60 90 M 初始 Initial pH 7 0 7 5 8 0 N 接种量 Inoculation amount 1 0 3 0 5 0 的趋势 发酵培养基各因素的最佳值 棉籽饼粉 2 00 大豆饼粉 1 00 酵母粉 1 50 可溶性淀粉 2 00 CaCO 3 0 30 MnSO 4 0 04 MgSO 4 0 1 K 2 HPO 4 0 04 Bt 芽胞产量随着发酵条件的变化呈先增加后 减少的趋势 发酵条件各因素的最佳值 接种量 3 装液量 60 mL 温度 30 转速 150 r min 初始 pH 7 59 图 1 2 2 2 响应面试验结果与分析 以芽胞产量为响应值 应用回归分析对方程和各因子进行方差分析 表 2 结果表明回归方程显著 性检测 P 0 0001 说明该方程模型属于极显著 失拟项 P 0 05 失拟项不显著 回归方程模型与实际试 验拟合性较好 实验误差小 模型是可行的 数据是可信的 证明应用响应面法优化菌株 Bt JQD117 的发 酵培养基及摇瓶发酵条件是可行的 具有参考性 各因素对 Bt 芽胞产量的影响次序为 棉籽饼粉 装样 量 K 2 HPO 4 转速 大豆饼粉 温度 pH 接种量 MnSO 4 酵母粉 CaCO 3 可溶性淀粉 MgSO 4 经回归拟合后 根据回归方程 考察拟合相应曲面的形状 通过分析碳源 氮源 无机盐和发酵条件等 13 个因素对产芽胞量的影响 发现棉籽饼粉与其他 12 项因素交互作用均显著 其中 棉籽饼粉和装样量对 Bt 的产芽胞量影响最显著 等高线较其他因素的等高线陡峭 K 2 HPO 4 转速和大豆饼粉次之 图 3 通过 Design Expect 8 0 软件分析确定最优点 当 Bt 芽胞产量最大时 可求得各因素水平 A 1 5 B 3 C 2 94 D 0 5 E 0 496 F 0 021 G 0 035 H 0 215 J 30 85 K 122 23 r min L 30 mL M 7 93 N 1 28 进行编码转化后得到最佳固体发酵培养基成分为 大豆饼粉 1 5 棉 籽饼粉 3 可溶性淀粉 2 94 酵母粉 0 5 CaCO 3 0 496 MnSO 4 0 021 K 2 HPO 4 0 035 MgSO 4 0 215 最佳发酵条件为培养温度 30 85 转速 122 23 r min 装量 30 mL 250 mL 三角瓶 起始 pH 7 93 接种量 1 28 在此理论最佳发酵条件下 回归方程预测 Bt JQD117 理论芽胞产量可达到 6 75 10 9 芽胞 mL 2 3 模型验证结果 为了检验模型预测的可靠性 在上述理论最佳发酵条件下进行 4 次重复平行验证试验 发现 Bt JQD117 菌株实际芽胞产量平均值为 5 97 10 9 个 mL 与模型预测值 6 75 10 9 个 mL 无显著差异 这证明了方程 模型数据的可靠性 证明响应面分析法优化 Bt 发酵培养基和发酵条件是有效的 相比于初始培养基的芽 胞产量 2 5 10 9 个 mL 优化后的工艺发酵水平提高 138 8 3 讨论 在微生物发酵生产过程中 发酵培养基的优化起着至关重要的作用 其不仅对发酵水平的提高有着举 336 中 国 生 物 防 治 学 报 第 38 卷 40 80 120 160 0 50 1 00 1 50 2 00 2 50 A 0 100 200 300 400 500 1 00 2 00 3 00 4 00 5 00 100 200 300 400 0 80 1 20 1 60 2 00 2 40 100 200 300 400 500 600 0 60 0 90 1 20 1 50 1 80 0 20 40 60 80 100 0 05 0 08 0 10 0 18 0 20 0 50 100 150 200 0 01 0 02 0 03 0 04 0 05 10 20 30 40 50 60 0 05 0 10 0 20 0 30 0 50 0 100 200 300 400 500 0 01 0 02 0 03 0 04 0 05 活芽胞数 L ivi ng bacterium n u mber 0 00 0 B 活芽胞数 L ivi ng bacterium n u mber C 活芽胞数 L ivi ng bact erium n u mber D 活芽胞数 L ivi ng bact erium n u mber E 活芽胞数 Li vin g b a ct eri u m nu mb er F 活芽胞数 Li vin g b a ct eri u m nu mb er G 活芽胞数 L ivi ng bacterium n u mber H 活芽胞数 L ivi ng bacterium n u mber 浓度 Concentration浓度 Concentration A 大豆粉 Soybean meal B 棉籽粉 Cotton seed cake meal C 可溶性淀粉 Soluble starch D 酵母粉 Yeast extract E 碳酸钙 CaCO3 F 硫酸 锰 MnSO 4 G 磷酸氢二钾 K 2 HPO 4 H 硫酸镁 MgSO 4 图 1 发酵培养基各成分不同浓度对 Bt 产芽胞量的影响 Fig 1 Effect of different concentration of components in fermentation medium on the number of Bt spores 足轻重的作用 而且也是决定该微生物能否成功商业化的关键所在 由于微生物发酵过程是十分复杂 高 度非线性和非结构化的 建立一个准确适合的模型指导其发酵过程存在着许多困难 20 因而选择合理的试 验设计和优化方法对培养基的优化十分关键 响应面分析法是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据 采用多元二次回归方程来拟合因 素与响应值之间的函数关系 通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数 解决多变量问题的一种统计方 法 相较于传统利用回归正交试验设计对菌株培养条件进行优化 不仅克服了后者不能排除交互作用混杂 影响的缺点 而且同时对试验各单因子及其交互作用做评价 建立连续变量曲面模型 能快速准确地确定 各发酵条件的最优值 相较于同类研究中的实验设计 对最优发酵条件筛选更加精确 优化后的发酵水平 提升也更加明显 Sumant 等 21 利用响应面分析法对一株产碱性蛋白酶的芽胞杆菌发酵培养基进行优化 使其碱性蛋白 酶产量提高了 2 6 倍 周虓等 22 将单因子优化与响应面结合 优化了产耐高温蛋白酶 Bt FZ62 的发酵培养 基 发酵水平比初始设计提高了 3 22 倍 郑毅等 23 将二水平 Plackett Burman 设计与响应面相结合优化了 产耐高温蛋白酶 Bt FS140 的发酵培养基 FS140 最终发酵产酶水平达 918 91 U mL 杨梅等 24 应用上述方 法对 Bt LLB19 的培养基进行了优化 较初始培养基芽胞产量提高了 24 6 陈宇熹等 15 应用此法优化了 第 2 期 宋健等 对韭菜迟眼蕈蚊高活性的苏云金芽胞杆菌 JQD117 发酵培养基及摇瓶发酵条件优化 337 0 50 100 150 200 250 0 30 0 50 1 00 3 00 5 00 接种量 Inoculation amount 活芽胞数 Liv i n g bacteriu m number N 0 20 40 60 80 100 120 28 29 30 31 32 0 20 40 60 80 100 120 120 150 180 210 240 0 10 20 30 40 50 60 20 40 60 80 100 0 50 100 150 200 250 6 06 57 07 58 0 温度 Temperature 转速 Speed r min 装样量 Liquid volume in flask mL pH 活芽胞数 Liv i n g bacteriu m number J 活芽胞数 Liv i n g bacteriu m number K 活芽胞数 L ivi ng bacterium n u mber L 活芽胞数 L ivi ng bacterium n u mber M J 温度 Temperature K 转速 Speed L 装样量 Liquid volume in flask M 酸碱度 pH N 接种量 Inoculation amount 图 2 不同发酵条件对 Bt 产芽胞量的影响 Fig 2 Effect of different flask fermentation conditions on the number of Bt spores 400 300 200 100 0 400 300 200 100 0 400 300 200 100 0 400 300 200 100 0 90 84 78 72 66 60 54 48 42 36 30 10 15 20 25 30 10 15 20 25 30 1 8 0 1 7 4 1 6 2 1 5 6 1 5 0 1 4 4 1 3 8 1 3 2 1 2 6 1 2 0 1 6 8 10 15 20 25 30 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 5 7 9 11 13 15 10 15 20 25 30 活芽胞数 Liv ing bacterium n u mber 活芽胞数 Liv ing bacterium n u mber 活芽胞数 L ivi ng bact eri u m nu mb er 活芽胞数 L ivi ng bact eri u m nu mb er L mL B B K r min G B A B A 大豆粉 Soybean meal B 棉籽粉 Cotton seed cake meal G 磷酸氢二钾 K 2 HPO 4 K 转速 Speed L 装样量 Liquid volume in flask 图 3 二因素交互影响 Bt 产芽胞量等高线图 Fig 3 Contour chart of two factors interaction affects Bt spores 338 中 国 生 物 防 治 学 报 第 38 卷 表 2 响应面试验回归方程方差分析 Table 2 Analysis of variance of regression equation in response surface test 来源 Source 平方和 Sum of squares 自由度 df 均方 Mean squares F 值 F value P 值 P value 显著性 Significance Model 2000000 104 19216 75 3 35 0 0001 A 5377 07 1 5377 07 0 94 0 3352 Ns B 902000 1 902000 156 99 0 0001 C 124 9 1 124 9 0 022 0 883 Ns D 349 82 1 349 82 0 061 0 8055 Ns E 301 44 1 301 44 0 052 0 8192 Ns F 475 22 1 475 22 0 083 0 7741 Ns G 28641 85 1 28641 85 4 99 0 0275 H 41 1 41 7 14 10 3 0 9328 Ns J 1750 41 1 1750 41 0 3 0 5819 Ns K 21024 69 1 21024 69 3 66 0 0582 Ns L 38319 76 1 38319 76 6 67 0 011 M 777 13 1 777 13 0 14 0 7136 Ns N 685 27 1 685 27 0 12 0 7304 Ns AB 12647 26 1 12647 26 2 2 0 1405 Ns AC 1200 97 1 1200 97 0 21 0 6483 Ns AD 163 2 1 163 2 0 028 0 8664 Ns AE 37 02 1 37 02 6 45 10 3 0 9361 Ns AF 10258 13 1 10258 13 1 79 0 184 Ns AG 1121 84 1 1121 84 0 2 0 6593 Ns AH 12304 49 1 12304 49 2 14 0 146 Ns AJ 660 03 1 660 03 0 11 0 7352 Ns AK 812 85 1 812 85 0 14 0 7074 Ns AL 4535 69 1 4535 69 0 79 0 376 Ns AM 11027 63 1 11027 63 1 92 0 1685 Ns AN 25 03 1 25 03 4 36 10 3 0 9475 Ns BC 6819 95 1 6819 95 1 19 0 2781 Ns BD 2243 44 1 2243 44 0 39 0 5332 Ns BE 4567 39 1 4567 39 0 8 0 3743 Ns BF 11 65 1 11 65 2 03 10 3 0 9641 Ns BG 4885 66 1 4885 66 0 85 0 3583 Ns BH 2340 99 1 2340 99 0 41 0 5244 Ns BJ 39 25 1 39 25 6 84 10 3 0 9343 Ns BK 450 53 1 450 53 0 078 0 7799 Ns BL 30698 08 1 30698 08 5 35 0 0226 BM 27612 47 1 27612 47 4 81 0 0303 BN 457 43 1 457 43 0 08 0 7783 Ns CD 2133 19 1 2133 19 0 37 0 5434 Ns CE 3261 27 1 3261 27 0 57 0 4526 Ns CF 605 78 1 605 78 0 11 0 7459 Ns 第 2 期 宋健等 对韭菜迟眼蕈蚊高活性的苏云金芽胞杆菌 JQD117 发酵培养基及摇瓶发酵条件优化 339 续表 2 来源 Source 平方和 Sum of squares 自由度 df 均方 Mean squares F 值 F value P 值 P value 显著性 Significance CG 717 26 1 717 26 0 12 0 7244 Ns CH 5820 13 1 5820 13 1 01 0 3162 Ns CJ 186 2 1 186 2 0 032 0 8574 Ns CK 9 8 1 9 8 1 71 10 3 0 9671 Ns CL 424 35 1 424 35 0 074 0 7862 Ns CM 895 91 1 895 91 0 16 0 6936 Ns CN 14075 45 1 14075 45 2 45 0 1202 Ns DE 2529 74 1 2529 74 0 44 0 5082 Ns DF 7124 63 1 7124 63 1 24 0 2677 Ns DG 1526 66 1 1526 66 0 27 0 6071 Ns DH 783 49 1 783 49 0 14 0 7125 Ns DJ 2968 54 1 2968 54 0 52 0 4736 Ns DK 2057 45 1 2057 45 0 36 0 5506 Ns DL 1136 81 1 1136 81 0 2 0 6572 Ns DM 17925 76 1 17925 76 3 12 0 0799 Ns DN 19484 37 1 19484 37 3 39 0 068 EF 978 15 1 978 15 0 17 0 6806 Ns EG 36 15 1 36 15 6 30 10 3 0 9369 Ns EH 23 3 1 23 3 4 06 10 3 0 9493 Ns EJ 2313 7 1 2313 7 0 4 0 5268 Ns EK 789 63 1 789 63 0 14 0 7115 Ns EL 37453 11 1 37453 11 6 52 0 012 EM 6582 06 1 6582 06 1 15 0 2866 Ns EN 25 03 1 25 03 4 36 10 3 0 9475 Ns FG 42758 38 1 42758 38 7 45 0 0074 FH 6633 29 1 6633 29 1 16 0 2847 Ns FJ 1491 31 1 1491 31 0 26 0 6113 Ns FK 1125 28 1 1125 28 0 2 0 6588 Ns FL 16372 36 1 16372 36 2 85 0 094 Ns FM 4715 42 1 4715 42 0 82 0 3667 Ns FN 11181 85 1 11181 85 1 95 0 1656 Ns GH 4864 92 1 4864 92 0 85 0 3593 Ns GJ 2558 84 1 2558 84 0 45 0 5058 Ns GK 110 57 1 110 57 0 019 0 8899 Ns GL 23687 94 1 23687 94 4 13 0 0446 GM 25391 87 1 25391 87 4 42 0 0377 GN 9 32 1 9 32 1 62 10 3 0 9679 Ns HJ 721 05 1 721 05 0 13 0 7237 Ns HK 5386 09 1 5386 09 0 94 0 3348 Ns HL 6565 05 1 6565 05 1 14 0 2872 Ns HM 29743 1 29743 5 18 0 0247 340 中 国 生 物 防 治 学 报 第 38 卷 续表 2 来源 Source 平方和 Sum of squares 自由度 df 均方 Mean squares F 值 F value P 值 P value 显著性 Significance HN 49 33 1 49 33 8 59 10 3 0 9263 Ns JK 29531 18 1 29531 18 5 14 0 0252 JL 11431 35 1 11431 35 1 99 0 161 Ns JM 513 59 1 513 59 0 089 0 7654 Ns JN 2405 23 1 2405 23 0 42 0 5188 Ns KL 4394 06 1 4394 06 0 77 0 3835 Ns KM 6916 83 1 6916 83 1 2 0 2747 Ns KN 3384 04 1 3384 04 0 59 0 4443 Ns LM 32241 49 1 32241 49 5 61 0 0195 LN 409 56 1 409 56 0 071 0 7899 Ns MN 9449 69 1 9449 69 1 65 0 2021 Ns A 2 18877 9 1 18877 9 3 29 0 0724 Ns B 2 318000 1 318000 55 32 0 0001 C 2 3188 96 1 3188 96 0 56 0 4577 Ns D 2 3 75 1 3 75 6 53 10 4 0 9797 Ns E 2 578 08 1 578 08 0 1 0 7516 Ns F 2 99 54 1 99 54 0 017 0 8955 Ns G 2 719 73 1 719 73 0 13 0 724 Ns H 2 1567 47 1 1567 47 0 27 0 6024 Ns J 2 6031 91 1 6031 91 1 05 0 3076 Ns K 2 2 49 1 2 49 4 34 10 4 0 9834 Ns L 2 401 09 1 401 09 0 07 0 792 Ns M 2 2677 22 1 2677 22 0 47 0 4961 Ns N 2 689 25 1 689 25 0 12 0 7296 Ns 残差 Residual 660000 115 5742 37 失拟项 Lack of fit 632000 104 6077 24 2 36 0 0576 Ns 纯误差 Pure error 28339 82 11 2576 35 总和 Cor Total 2660000 219 注 差异显著 P 0 05 差异极显著 P 0 001 Ns 不显著 Note and indicated significant difference at 0 05 and 0 01 level Ns indicated there was no significant difference 高效杀蚊 Bt BRC LLP29 的发酵培养基 张群林等 25 采用此法优化了 Bt BRC ZQL3 的发酵培养基 比初始 发酵培养基产孢水平提高了 60 66 成飞雪等 16 采用此法优化了 Bt YC 10 的发酵培养基 比优化前提高 了 29 5 李姝江等 26 利用响应面法优化贝莱斯芽胞杆菌 ZJ20 发酵参数 菌落数达 769 10 7 CFU mL 比 优化前提高了 17 71 倍 本试验利用单因素试验和响应面试验相结合的方法 优化出 Bt JQD117 菌株最佳 培养基和发酵条件 大豆饼粉 1 5 棉籽饼粉 3 可溶性淀粉 2 94 酵母粉 0 5 CaCO 3 0 496 MnSO 4 0 021 K 2 HPO 4 0 035 MgSO 4 0 215 最佳发酵条件为培养温度 30 85 转速 122 23 r min 装量 30 mL 250 mL 三角瓶 起始 pH 7 93 接种量 1 28 优化后发酵理论芽胞产量达到 6 75 10 9 个 mL 验证后实际为 5 97 10 9 个 mL 产生此情况的原因可能是由于发酵培养基在实际发酵过程中 随着细菌的 生长和芽胞数量的逐渐增加 影响了发酵 pH 和氧气浓度变化 造成最终芽胞产量的变化 但两者无显著 性差异 说明利用响应面分析法进行 Bt 菌株 JQD117 发酵培养基的优化是合理可靠的 优化后发酵水平相 比于初始培养基的芽胞产量 2 5 10 9 个 mL 提高了 38 8 第 2 期 宋健等 对韭菜迟眼蕈蚊高活性的苏云金芽胞杆菌 JQD117 发酵培养基及摇瓶发酵条件优化 341 目前 有关 Bt 培养优化方面的研究已有不少文献报道 基本都以发酵液中菌体浓度或活芽胞产量作 为评价指标 本文在 Bt 培养条件优化的研究中 也是以发酵液中活芽胞产量为评价指标来进行衡量的 该方法简便 快捷 易操作 同时 Bt 菌株在发酵过程中芽胞的产生与晶体蛋白含量具有一定的相关性 因此在今后菌株的开发和生产中以及对该菌株在农业生产上的应用具有一定的指导作用 参 考 文 献 1 王哲 钟涛 刘培斌 等 韭菜迟眼蕈蚊发生规律及防治方法研究进展 J 环境昆虫学报 2017 39 6 1397 1406 2 Zhang P Zhao Y H Wang Q H et al Lethal and sublethal effects of the chitin synthesis inhibitor chlorfluazuron on Bradysia odoriphaga Yang and Zhang Diptera Sciaridae J Pesticide Biochemistry and