海藻渣复配微生物菌剂防治黄瓜苗期枯萎病的协同增效作用.pdf

38 1 97 107 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2022 年 2 月 收稿日期 2021 10 08 基金项目 山东省重点研发计划 2019JZZY020707 上海市科委重点研究计划重点 18391902400 作者简介 郝大志 硕士研究生 E mail 574642689 通信作者 教授 E mail jiechen59 DOI 10 16409 ki 2095 039x 2021 08 005 海藻渣复配微生物菌剂防治黄瓜苗期枯萎病的协同增效作用 郝大志 1 王咏坤 1 陈 捷 1 辛舟生 2 高永东 3 1 上海交通大学农业与生物学院 上海 200240 2 山东洁晶集团股份有限公司 日照 276826 3 上海市农业技术推广服务中心 上海 201100 摘要 海藻渣资源化高效利用对环境保护具有重要意义 通过比较海藻渣与棘孢木霉菌剂 解淀粉芽胞杆 菌菌剂单一和复配使用对黄瓜苗期枯萎病的防效和寄主防御反应的影响 明确海藻渣和复合菌剂协同增效 作用 结果表明 1 海藻渣 3 0 10 5 cfu g 棘孢木霉菌剂 2 0 10 8 cfu g 解淀粉芽胞杆菌菌剂 T1 拌 土处理对枯萎病防效达 93 39 较单独使用棘孢木霉 解淀粉芽胞杆菌混合菌剂 T3 提高 11 71 接 种镰孢菌 9 d 后 T1 处理的叶片 POD SOD CAT PPO PAL 活性均显著高于 T3 T1 处理的叶片和根 部 SA 含量也显著高于 T3 证明了海藻渣的添加增强了木霉和芽胞杆菌对黄瓜枯萎病的防效 T1 诱导黄 瓜 SA 防御反应基因表达也有类似变化规律 相关性分析表明 添加海藻渣与木霉和芽胞杆菌诱导黄瓜抗 枯萎病相关信号物质产生和基因及酶活表达呈正相关 综合上述研究结果 证明了三种组分的复合制剂协 同产生的微生态效应和系统诱导抗性作用是防治黄瓜苗期枯萎病协同增效的主要原因 关 键 词 木霉菌 芽胞杆菌 海藻渣 黄瓜枯萎病 系统诱导抗性 中图分类号 S476 文献标识码 A 文章编号 1005 9261 2022 01 0097 11 Synergistic Effect of Seaweed Residue Combined with Microbial Inoculum on Cucumber Fusarium Wilt Control HAO Dazhi 1 WANG Yongkun 1 CHEN Jie 1 XIN Zhousheng 2 Gao Yongdong 3 1 College of Agriculture and Biology Shanghai Jiaotong University Shanghai 200240 China 2 Shandong Jie Jing Group Co Ltd Rizhao 276826 China 3 Shanghai Agricultural Technology Extension Service Center Shanghai 201100 China Abstract The efficient utilization of seaweed residue is of great significance to environmental protection This study aimed to understand the synergistic effects of seaweed residue Trichoderma asperellum and Bacillus amyloliquefaciens against cucumber Fusarium wilt by comparing seaweed residue and Trichoderma Bacillus in single or in combination The results showed that soil treatment with 1 seaweed residue 3 0 10 5 cfu g Trichoderma asperellum 2 0 10 8 cfu g Bacillus amyloliquefaciens T1 could effectively improve the control effect against cucumber Fusarium wilt with the efficacy of 93 39 Compared with Trichoderma Bacillus T3 T1 increased the contol efficacy by 11 71 After 9 days of inoculation with Fusarium oxysporum compared with T3 T1 was more effective in the induction of POD SOD CAT PPO and PAL enzyme activities in leaves and the accumulation of endogenous salicylic acid in roots and leaves indicating that the addition of seaweed residue enhanced the control effect of Trichoderma and Bacillus on cucumber Fusarium wilt The qPCR results showed that the addition of seaweed residue enhanced the ability of Trichoderma and Bacillus to induce defense response and the expression level of SA pathway gene increased Correlation analysis showed that the addition of seaweed residue was positively correlated with Trichoderma and Bacillus to induce the production of signal substances related to cucumber Fusarium wilt resistance and the expression of genes and enzyme activities In conclusion the major reason that the micro ecological effect and systemic induced resistance effect against the cucumber Fusarium 98 中 国 生 物 防 治 学 报 第 38 卷 wilt was significantly generated by the synergistic action among seaweed residue Trichoderma and Bacillus Key words Trichoderma Bacillus seaweed residue cucumber Fusarium wilt induced systemic resistance 国内外对于海藻渣的综合利用已有大量的研究 1 3 海藻渣含粗蛋白约 20 粗纤维约 50 灰分约 3 此外还富含水杨酸 茉莉酸 脱落酸 赤霉素等 10 余种生物刺激素及超氧化物歧化酶等 4 6 因此海 藻渣所制备有机肥可以提高植物的光合作用 抗逆能力及耐盐碱性 从而提高作物产量和品质 7 11 木霉 及芽胞杆菌是常见的植物促生菌及植物土传病害生物防治微生物 主要通过拮抗 竞争 重寄生和诱导抗 性等机制来保护植物免受病原菌侵袭 12 13 在黄瓜枯萎病防治方面 季倩茹等 14 研究表明 巨大芽胞杆菌 B213 多粘类芽胞杆菌 B207 和枯草芽胞杆菌 B204 三菌联合对黄瓜枯萎病的防治及防御反应酶系的诱导 有明显协同增效作用 朱森林等 15 创制的深绿木霉水分散粒剂的防效超过化学药剂 叶片抗性氧化酶活性 叶绿素和脯氨酸含量明显增加 廉华等 16 研究表明 木霉菌分生孢子和厚垣孢子均能增加黄瓜幼苗叶片过 氧化物酶 peroxidase POD 过氧化氢酶 catalase CAT 抗坏血酸过氧化物酶 ascorbic acid peroxidase APX 超氧化物歧化酶 superoxide dismutase SOD 活性 提高对黄瓜枯萎病的防治效果 尽管木霉 菌与芽胞杆菌的组合使用在防治植物土传病害方面具有明显的协同增效作用 17 19 但关于海藻渣与木霉 芽胞杆菌复合菌剂在防治病害中的协同增效作用研究并不多见 苏东海等 20 用枯草芽胞杆菌 乳酸菌 酵 母菌等混合菌株对海藻渣进行发酵 其粗纤维含量大幅提高 赵忠祥等 21 利用绿色木霉固体发酵海带渣 发酵过程中纤维素被显著分解 还原糖含量提高 说明了海藻渣可以被木霉菌 芽胞杆菌分解利用 目前 大部分的微生物菌剂主要选用硅藻土 高岭土等惰性物质为营养和孢子载体 而海藻渣则可作为很好的菌 剂营养载体及促生物质来源 周莹等 22 制备了以海藻渣为载体的枯草芽胞杆菌菌剂 有效防治了丹参根腐 病 但海藻渣与木霉菌的复配使用未有报道 实验室前期研究已经证实了海藻渣复配木霉菌剂 芽胞杆菌 菌剂对黄瓜幼苗促生作用的协同增效 因此研究海藻渣与木霉和芽胞杆菌复合菌剂间在防治黄瓜苗期枯萎 病中的协同作用机制 对高效利用海藻渣 开发添加海藻渣的新型复合生物农药或生防菌剂具有重要意义 本研究将棘孢木霉 Trichoderma asperellum 解淀粉芽胞杆菌 Bacillus amyloliquefaciens 与海藻渣制备 成复合制剂 通过与单一海藻渣制剂 单一混合菌制剂比较 明确三者防治黄瓜枯萎病 促进幼苗生长的 协同增效作用 为海藻渣资源化利用探索一条新途径 1 材料与方法 1 1 供试材料 1 1 1 供试作物 黄瓜 申青一号 购买于上海富农种业有限公司 1 1 2 供试海藻渣 平均粒径 0 25 mm 由山东结晶集团股份有限公司提供 1 1 3 供试菌剂 棘孢木霉 Trichoderma asperellum GDFS1009 菌剂 2 亿 cfu g 载体硅藻土 由本实验 室提供 解淀粉芽胞杆菌 Bacillus amyloliquefaciens FS1841 菌剂 2000 亿 cfu g 载体麦芽糊精 由四川 龙蟒福生科技有限公司提供 1 1 4 供试病原菌 黄瓜枯萎病菌 Fusarium oxysporum 由本实验室提供 1 1 5 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基 potato pextrose agar PDA 马铃薯 200 g 葡萄糖 20 g 琼脂 20 g 蒸馏水 1000 mL pH 自然 马铃薯葡萄糖液体培养基 potato pextrose PD 马铃薯 200 g 葡萄糖 20 g 蒸馏水 1000 mL pH 自然 1 1 6 供试栽培基质与土壤 蔬菜栽培有机基质 有机质含量 55 2 购买于丹阳市茂禾有机肥料有限公司 自然田土 有机质含量 2 76 自然田土壤过 1 mm 筛后与有机基质 1 1 混合 121 高温蒸汽灭菌 1 h 1 1 7 供试化学试剂 水杨酸 Sigma Aldrich CAS No 69 72 7 茉莉酸 Sigma Aldrich CAS No 77026 92 7 多酚氧化酶 PPO 检测试剂盒 雷根生物技术有限公司 Cat TE0427 超氧化物 歧化酶 SOD 检测试剂盒 雷根生物技术有限公司 Cat TE0720 过氧化物酶 POD 检测试剂盒 雷根生物技术有限公司 Cat TE0423 过氧化氢酶 CAT 检测试剂盒 雷根生物技术有限公司 Cat TE0740 苯丙氨酸解氨酶 PAL 检测试剂盒 雷根生物技术有限公司 Cat TE0401 第 1 期 郝大志等 海藻渣复配微生物菌剂防治黄瓜苗期枯萎病的协同增效作用 99 1 2 试验方法 1 2 1 病原菌孢子悬浮液的制备 将黄瓜枯萎病病原菌在 PDA 培养基上 28 活化培养 3 d 转接到 PD 培养基上 28 200 r min 培养 5 d 发酵液经 8 层纱布过滤后获得孢子悬浮液 用血细胞计数器检测孢 子悬液的孢子数 并将孢子悬浮液稀释至 1 10 6 cfu mL 1 2 2 盆栽处理与方法 将海藻渣 木霉菌剂 芽胞杆菌菌剂 载体分别按照不同处理与土壤混匀 使得 土壤中的海藻渣含量为 1 木霉含量为 3 0 10 5 cfu g 芽胞杆菌含量为 2 0 10 8 cfu g 共 4 个处理 海 藻渣 木霉菌剂 芽胞杆菌菌剂 T1 海藻渣 T2 木霉菌剂 芽胞杆菌菌剂 T3 和空白载体处理 CK 上述制剂与土壤均匀混合 每个处理播种 3 个育苗盘 随机区组设计 处理方法 将不同处理的土壤装入 21 孔塑料育苗盘 34 5 cm 24 cm 11 cm 中 每孔栽入催芽 黄瓜种子 2 粒 播种后充分浇水 直至穴盘底部排水孔有水溢出 在人工气候室内培育 育苗光照时间 为 16 h 光照 8 h 黑暗 室内温度控制 24 25 每 3 d 浇施 1000 mL 无菌水 3 d 后每穴只保留一 棵苗生长 病菌接种与取样 栽种 15 d 后灌根接种黄瓜枯萎病菌 1 10 6 cfu mL 每穴 5 mL 分别于接种病菌 0 3 6 和 9 d 后取黄瓜第二片真叶与主根系 用锡箔纸包好 在接种病原菌当天取主根表面土壤 放入黑色 离心管 置于 80 冰箱中保存 用于后续试验测定 1 3 黄瓜根系防御反应物质测定 1 3 1 水杨酸和茉莉酸的提取 称取 0 1 g 黄瓜 二叶期幼苗 根系与第二片真叶 液氮中研磨至粉碎 向粉末中加入 1 mL 提取缓冲液 甲醇 水 甲酸 70 29 1 4 振震荡 30 min 后于 4 13000 r min 离心 20 min 取上清液 再经离心浓缩仪浓缩 6 h 残渣用 200 L 甲醇溶解 获得茉莉酸 JA 和水杨酸 SA 粗提样 保存于棕色瓶 1 3 2 标准曲线绘制 将水杨酸 茉莉酸标品配置成 0 5 1 5 10 50 100 500 和 1000 ng mL 的混合 标品 制备标准曲线 根据峰面积与浓度的线性关系 y 1 1e 003x 4 65e 004 r 0 9995 计算水杨酸 浓度 y 2 54e 003x 1 17e 003 r 0 9995 计算茉莉酸浓度 1 3 3 茉莉酸 jasmonic acid JA 和水杨酸 salicylic acid SA LC MS MS 分析 超高效液相色谱 三 重四极杆质谱联用仪 Nexera LC30AD SCIEX SelexION Triple Quad 5500 System 日本岛津公司 Sciex 公司 色谱条件 色谱柱为 ACQUITY BEH C18 液相柱 2 1 mm 100 mm 1 7 m 进样量为 5 L 流动相 为 0 1 质量分数 甲酸水溶液 A 相 和甲酸乙腈 B 相 柱温为 40 质谱条件 ESI 负离子模式 气帘气 35 psi 离子化电压 4500 V 去溶剂温度 500 雾化气 55 psi 辅助加热气 55 psi 多重反应监测 multiple reaction monitoring MRM 分析 1 3 4 茉莉酸 JA 和水杨酸 SA 含量计算 C样 A 样 C 标 V 标 A 标 V 样 其中 A 峰面积 C 浓度 V 体积 标 JA SA 标样 样 待测样品 单位鲜重样品 JA SA 含量 ng g C 样 定容体积 样品鲜重 1 4 黄瓜叶片抗氧化酶系活性测定 叶片酶活测定方法 多酚氧化酶 polyphenol oxidase PPO 超氧化物歧化酶 superoxide dismutase SOD 过氧化物酶 peroxidase POD 过氧化氢酶 catalase CAT 苯丙氨酸解氨酶 L phenylalanin ammo nialyase PAL 活性测定方法参照试剂盒说明书 PPO 活性单位为每 1 min 吸光度变化 0 01 所需酶 量为一个活性单位 U SOD 活性单位以抑制氮蓝四唑 nitroblue tetrazolium NBT 光化还原的 50 为一个酶活性单位 U POD 活性单位为每 1 min 吸光度变化 0 01 所需酶量为一个活性单位 U CAT 活性单位为在 37 1 min 催化水解 1 moL 过氧化氢量为一个 CAT 酶活力单位 U PAL 活性单位为 每 1 h 吸光度变化 0 01 所需酶量为一个酶活性单位 U 1 5 黄瓜叶片防御反应相关基因表达分析 RNA 提取与 cDNA 反转录合成 按照总 RNA 提取试剂盒说明书提取总 RNA 使用 NanoDrop 超微量 分光光度计检测其纯度和浓度后 保存于 80 以总 RNA 为反转录模板 按照试剂盒说明书进行基因 100 中 国 生 物 防 治 学 报 第 38 卷 组 DNA 去除与反转录 16 L 基因组 DNA 去除体系 50 ng L 终浓度模板 4 g DNA wiper Mix 4 L RNase free ddH 2 O 补足至 16 L 42 反应 2 min 20 L 反转录体系 16 L 去除基因组 DNA 模板 5 HiScript qRT SuperMix 4 L PCR 反应程序 37 孵育 15 min 85 加热失活 5 s 将反转录获得 cDNA 于 20 保存备用 实时荧光定量 PCR 分析 20 L 反应体系 50 ng L cDNA 2 0 L 10 mol L 正反向引物 表 1 各 0 4 L 2 ChamQ Universal SYBR qPCR Super Mix 10 0 L ddH 2 O 补足至 20 L 反应程序 95 预变性 300 s 95 变性 10 s 60 退火 30 s 40 个循环 95 熔解 10 s 65 熔解 60 s 97 熔解 1 s 37 冷却 30 s 以 EF1 为内参 设 3 个生物学重复 反应结束后 观察熔解曲线趋势是否正确 根据实时荧光 定量 PCR 仪检测到的 CT 值 按照 2 CT 法 计算不同处理时间下黄瓜叶片中目的基因的相对表达量 表 1 实时荧光定量 PCR 引物 Table 1 The primers of the quantitative real time PCR 引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence 5 3 目的片段名称 Amplification EF1 F EF1 R CTGTGCTGTCCTCATTATTG AGGGTGAAAGCAAGAAGAGC 内参基因 PR1 F PR1 R TGCTCAACAATATGCGAACC TCATCCACCCACAACTGAAC 水杨酸途径 PAD4 F PAD4 R AGAACAGCAAGCAGAATAGGAC CTTGAAGCAATCGTAGTAACCC 水杨酸途径 LOX1 F LOX1 R TTGGAGGAAACAAAATCAAAGGGA TGGCACTAATGAGTTGGAAAGAAA 茉莉酸途径 LOX2 F LOX2 R CCTAAGAGCAAACTTGACCCA CAATGCCTCAGCAACTGTAAG 茉莉酸途径 EIN2 F EIN2 R ACAAAAGGGGCACCAGC CCAACTCTCAGTAGAAGGCAA 乙烯途径 ACC F ACC R AGAACACATAGCCAGCAAAGG GGAGATGACGGAGGAAGAAAG 乙烯途径 NPR1 F NPR1 R TTACTGATAAGGGCAAGAAGGCC AAAGTTCACAAAGAGCAGGATGG 水杨酸途径 1 6 黄瓜苗期枯萎病防效 病原菌接种 9 d 后统计黄瓜苗期枯萎病病情指数 黄瓜苗期枯萎病的分级标准参照方中达 23 的分级标 准 0 级 无症状 1 级 真叶 子叶黄化或萎蔫面积不超过总面积的 50 2 级 真叶 子叶黄化或萎蔫 面积超过总面积的 50 3 级 叶片萎蔫或枯死 仅生长点存活 4 级 全株严重萎蔫 以致枯死 病情 指数参照宗兆锋和康振生 24 的计算方法 病情指数 病级数 该病级植株数 最大病级数 植株总 株数 100 防治效果 对照组病情指数 处理组病情指数 对照病情指数 100 1 7 相关性分析 将海藻渣 木霉菌剂 芽胞杆菌菌剂 T1 与木霉菌剂 芽胞杆菌菌剂 T3 所测的各项酶活 SA 含 量 JA 含量 基因相对表达量进行相关性分析 相关系数越接近 1 说明 T1 与 T3 在该项为协同增效 1 8 数据统计与分析 利用 GraphPad Prism 9 0 软件进行图表制作 数据采用 SAS 9 4 软件通过最小显著差异法 LSD 比较 不同处理间的差异显著性 2 结果与分析 2 1 海藻渣对木霉 芽胞杆菌混合菌剂防治黄瓜苗期枯萎病 海藻渣 木霉 芽胞杆菌混合菌剂 T1 海藻渣单独使用 T2 木霉 芽胞杆菌混合菌剂 T3 与 CK 间病情指数出现显著差异 T1 T2 T3 处理病情指数极显著低于 CK 处理 海藻渣 木霉 芽胞杆 菌混合菌剂 T1 的防治效果显著高于海藻渣单独使用 T2 及木霉 芽胞杆菌混合菌剂单独使用 T3 木霉 芽胞杆菌混合菌剂 T3 的防治效果显著高于海藻渣单独使用 T2 海藻渣单独使用 T2 的防 治效果较差 平均防效只有 25 79 证明海藻渣本身诱导黄瓜幼苗对枯萎病是有限的 木霉 芽胞杆菌混 合菌剂 T3 平均防效为 81 78 添加海藻渣后防效提高到 93 49 提高了 11 71 结果表明海藻渣可 以增强木霉菌剂 芽胞杆菌菌剂对黄瓜幼苗枯萎病防效 海藻渣与木霉菌剂 芽胞杆菌菌剂对黄瓜幼苗枯 萎病防效协同增效 表 2 图 1 第 1 期 郝大志等 海藻渣复配微生物菌剂防治黄瓜苗期枯萎病的协同增效作用 101 表 2 海藻渣复配微生物菌剂处理对黄瓜枯萎病防效的影响 Table 2 Effect of seaweed residue combined with microbial agents on cucumber Fusarium wilt 处理 Treatment 病情指数 Disease index 防治效果 Control effect 海藻渣 木霉菌剂 芽胞杆菌菌剂 Seaweed residue Trichoderma Bacillus T1 5 95 93 49 a 海藻渣 Seaweed residue T2 67 86 25 79 c 木霉菌剂 芽胞杆菌菌 Trichoderma Bacillus T3 16 67 81 78 b 空白硅藻土处理 CK 91 67 注 表中数据为平均值 标准差 同列数据后不同字母表示经最小显著差数法检验差异显著性 P 0 05 下同 Note Data were mean SD values in the same column followed by different letters were significantly different P 0 05 according to least significant difference test The same below 图 1 海藻渣对木霉 芽胞杆菌混合菌剂防治黄瓜苗期枯萎病的影响 Fig 1 Influence of seaweed residue on the control effect of Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents gainst cucumber Fusarium wilt 2 2 海藻渣对木霉 芽胞杆菌混合菌剂诱导黄瓜叶片抗氧化酶活性的影响 通过灌根接种尖孢镰刀菌后 0 3 6 和 9 d 测定叶片抗氧化酶系的活性结果表明 叶片超氧化物歧化 酶 SOD 与苯丙氨酸解氨酶 PAL 活性变化趋势相近 与 CK 相比 未接种病原菌情况下的 T1 T2 和 T3 处理的叶片 SOD 活性及 PAL 活性均显著高于 CK 随着接种病菌后时间的增加 各处理的植物防御 反应逐渐加强 其中 T1 处理的大部分时间节点中的叶片 SOD 活性 PAL 活性均高于 T3 和 T2 处理 可 见海藻渣能增强木霉 芽胞杆菌混合菌剂对叶片 SOD 和 PAL 活性的诱导 图 2 随着接种病菌后时间增加 T1 T3 的 POD CAT 活性均显著提高 PPO 变化较为复杂 但在 9 d 时 T1 的 POD PPO CAT 活性为所有处理中最高 且 T1 T3 T2 图 2 综上试验结果 由于抗氧化酶系统变化较为复杂 在病原菌刚接种时不同处理中 POD SOD CAT PPO PAL 活性变化并不一致 但 T1 处理的黄瓜叶片 POD SOD CAT PPO PAL 活性均随着接种病 原菌后的天数增加而提高 T1 处理叶片的酶活在 9 d 时均高于 T2 T3 及 CK 海藻渣对黄瓜抗氧化系统 酶活有一定的诱导作用 添加海藻渣可以进一步增强微生物菌剂的诱导效果 海藻渣与木霉 芽胞杆菌混 合菌剂在诱导黄瓜抗氧化酶系统中表现为协同增效 图 2 2 3 海藻渣对木霉 芽胞杆菌混合菌剂诱导黄瓜根部和叶片水杨酸和茉莉酸含量变化的影响 在未接种病菌情况下 海藻渣及微生物菌剂对黄瓜根系茉莉酸积累有显著影响 T1 处理中茉莉酸含量 是 CK 的 0 46 倍 T2 T3 处理的茉莉酸含量则低于 CK 接种后 6 d T1 T2 T3 处理的茉莉酸含量仍呈 降低趋势 但水杨酸含量则逐渐增加 推测可能与茉莉酸信号通路途径和水杨酸信号通路途径间存在拮抗 关系有关 图 3A 在未接种病菌的情况下 海藻渣及海藻渣 木霉 芽胞杆菌混合菌剂对黄瓜根系水杨酸含量无显著影 响 但在接种病原菌后则显著提高黄瓜根系积累水杨酸的速度 在接种病原菌 3 d 后 T1 中水杨酸含量为 CK 的 0 5 倍 而 T2 T3 水杨酸含量无显著变化 在接种病原菌 6 d 后 T2 水杨酸迅速上升至 CK 的 0 75 102 中 国 生 物 防 治 学 报 第 38 卷 CK T1 T2 T3 0 50 100 150 200 i gh cdef defg fgh ab bcd h a efg bcde fgh ab cdef abc 0 5000 10000 15000 i gh h gh defg c efgh cdef cde fgh efgh cde a cd b 超氧化物歧化酶活性 SO D acti c i ty U g 苯丙氨酸解氨酶活性 PAL a ct icit y U g A bcd cd B 9 d 尖孢镰刀菌接种后时间 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d 9 d 尖孢镰刀菌接种后时间 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d 过氧化物酶活性 PO D act ic it y U g 多酚氧化酶活性 PPO a c t i ci ty U g CD 9 d 尖孢镰刀菌接种后时间 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d 9 d 尖孢镰刀菌接种后时间 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d e e de a cd g g g c h f h b h e de 0 0 05 0 10 0 15 0 20 0 25 0 20 40 60 80 hi h j h i f g fg g d e a c b de de 过氧化氢酶活性 CAT a ct icit y U g C 0 100 200 300 400 500 b k hi ijk fg jk ef gh l de a c b cd de hig 9 d 尖孢镰刀菌接种后时间 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d 图 2 海藻渣对木霉 芽胞杆菌混合菌剂诱导黄瓜幼苗叶片抗氧化酶活性的影响 Fig 2 Effect of seaweed residue on antioxidant enzyme activity of cucumber seedling leaves induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents 0 1 2 3 4 b a cd bc ef b de h gh 0 100 200 300 400 h fg h d gh f d c c e a gh b A fg fg fg ef gh ef fg de def ef B 9 d 尖孢镰刀菌接种后时间 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d 9 d 尖孢镰刀菌接种后时间 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d CK T1 T2 T3 图 3 海藻渣对木霉和芽胞杆菌混合菌剂诱导黄瓜幼苗根系茉莉酸 A 水杨酸 B 含量变化的影响 Fig 3 Effect of seaweed residue on changes of jasmonic acid JA and salicylic acid SA content in cucumber seedling roots induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents 倍 且比 T1 及 T3 还要高 在接种病原菌 9 d 后 T1 水杨酸为 CK 的 0 77 倍 为所有处理中最高 T3 高于 T2 T2 在 9 d 时水杨酸含量降低 这可能是因为单独的海藻渣处理对黄瓜防御反应的诱导不具有持效性 与 T2 相比 T1 具有对寄主防御反应更为持效的诱导能力 说明海藻渣能强化微生物菌剂的诱导效应 图 3B 未接种病菌的情况下 海藻渣及混合菌剂对黄瓜叶片水杨酸积累有一定影响 但不显著 接种病菌后 第 1 期 郝大志等 海藻渣复配微生物菌剂防治黄瓜苗期枯萎病的协同增效作用 103 CK T1 T2 T3 叶片中水杨酸含量均逐渐增加 且呈 T1 T3 T2 CK 说明了海藻渣与微生物菌剂诱 导叶片中水杨酸积累具有协同作用 接种后叶片中的茉莉酸积累也有类似规律 图 4A B 综上检测结果 无论在根系还是叶片中水杨酸含量都显著高于茉莉酸含量 说明海藻渣及混合菌剂主 要诱导黄瓜的水杨酸含量增加 以激发相关防御反应途径 叶片及根系中水杨酸含量均为 T1 T3 T2 CK 说明了海藻渣对木霉 芽胞杆菌混合菌剂诱导黄瓜幼苗叶片及根系中水杨酸积累具有显著增效作用 在未接种病原时 各处理间的根系及叶片中水杨酸含量差异较小 而茉莉酸差异较大 说明在未接种病原 菌时 海藻渣及微生物菌剂就已经提高茉莉酸含量 以提高黄瓜幼苗的抗病性 而在接种病原后 水杨酸 含量快速增加 主要通过提高水杨酸的应答速度及含量来提高黄瓜幼苗的抗病性 海藻渣对水杨酸含量增 加的诱导能力虽然低于微生物菌剂 但海藻渣对茉莉酸含量增加的诱导能力强于微生物菌剂 海藻渣的添 加丰富了微生物菌剂的系统诱导抗性 图 3 4 JA content ng g SA cont ent n g g 图 4 海藻渣对木霉和芽胞杆菌混合菌剂诱导黄瓜幼苗叶片茉莉酸 水杨酸含量变化的影响 Fig 4 Effect of seaweed residue on changes of jasmonic acid JA and salicylic acid SA content in cucumber seedling leaves induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents 2 4 海藻渣对木霉 芽胞杆菌混合菌剂诱导黄瓜叶片防御反应信号相关基因表达的影响 2 4 1 对水杨酸 SA 途径的影响 测定接种病菌 0 3 6 和 9 d 的黄瓜幼苗叶片水杨酸相关基因的表达情 况 发现海藻渣及混合菌剂处理均可以激活黄瓜幼苗防御反应 未接种病原菌时 海藻渣及混合菌剂处理 黄瓜根部可引起黄瓜叶片内与水杨酸相关的基因 PAD4 PR1 NPR1 的表达变化 T1 处理显著上调 接 种病原菌后 CK 的 PAD4 PR1 表达上调 NPR1 表达下调 但变化程度较小 T1 的 PAD4 PR1 NPR1 表达显著上调 T2 的 PAD4 PR1 表达上调 NPR1 表达下调 T3 的 PAD4 PR1 NPR1 表达显著上调 但上调程度低于 T1 与 CK 相比 海藻渣及混合菌剂处理的叶片无论是否接种原菌 PAD4 PR1 NPR1 均被诱导表达上调 且 T1 上调程度显著高于 T3 T3 显著高于 T2 与黄瓜叶片水杨酸含量变化相比 SA 途径基因表达先于含量变化 且诱导效应逐渐衰减 但水杨酸含量逐步增加 海藻渣本身对黄瓜幼苗防御 反应具有一定的诱导能力 但不如微生物菌剂 添加海藻渣增强了木霉 芽胞杆菌混合菌剂对防御反应诱 导能力 SA 途径基因表达水平提高 水杨酸含量积累 表明了海藻渣与木霉 芽胞杆菌混合菌剂对黄瓜幼 苗枯萎病防效的协同作用 图 5 2 4 2 对茉莉酸 JA 途径的影响 关于茉莉酸途径的诱导 未接种病原菌时 T1 处理 LOX1 显著上调 LOX2 显著下调 T2 T3 处理 LOX1 LOX2 均显著上调 接种病菌后 CK 的 LOX1 表达下调 LOX2 表达先上调 后下调 T1 的 LOX1 表达上调 LOX2 先下调 在 6 d 后上调 T2 的 LOX1 LOX2 均表达下调 T3 的 LOX1 表达下调 LOX2 先上调 6 d 后下调 与 CK 相比 海藻渣与混合菌剂处理在 LOX2 基因表达水平表现协 同增效 但在 LOX1 基因上未表现 LOX1 基因表达水平更多受海藻渣的影响 LOX2 基因表达水平更多受 微生物菌剂影响 0 6 d 内基因表达水平变化趋势与叶片 JA 含量相吻合 在未接种病原菌 海藻渣本身 对黄瓜幼苗 JA 途径强于微生物菌剂 接种病原菌后 LOX1 与 LOX2 在 3 和 6 d 时表达水平表现出相反的 变化 但在 9 d 时 T1 的 LOX1 显著高于 T2 T3 T1 的 LOX2 显著高于 T3 表明添加海藻渣增强了木霉 芽胞杆菌混合菌剂对 JA 途径的诱导能力 图 6 104 中 国 生 物 防 治 学 报 第 38 卷 jk gh fg hij ghij c d ghi ij a b e k f ij fg C 0 2 4 6 9 d 尖孢镰刀菌接种后时间 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d de d h a de c h b g h de g ef i ef gh i hi b ef d h a e c i d fg e A deef fg B 0 2 4 6 0 2 4 6 9 d 尖孢镰刀菌接种后时间 Time after inoculation of F oxysporum 6 d3 d0 d 9 d 尖孢镰刀菌接种后