查尔酮合成酶基因在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的作用.pdf

中国农业科学 2022 55 6 1139 1148 Scientia Agricultura Sinica doi 10 3864 j issn 0578 1752 2022 06 007 收稿日期 2021 09 23 接受日期 2021 12 14 基金项目 国家自然科学基金 31860493 广西重点研发计划 桂科 AB21076001 广西八桂青年学者 专项 广西农科院基本科研业务专项 2021JM97 2018JZ18 联系方式 郭泽西 E mail 1162410925 通信作者尹玲 E mail 779335723 开放科学 资源服务 标识码 OSID 查尔酮合成酶基因在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的 作用 郭泽西 孙大运 曲俊杰 潘凤英 刘露露 尹玲 广西壮族自治区农业科学院广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室 南宁 530007 摘要 目的 克隆不同抗性葡 萄品种中查尔酮合成酶 c halcone synthase 基因 CHS1 明确该基因在葡萄灰霉病菌 Botrytis cinerea 和葡萄霜霉病菌 Plasmopara viticola 侵染下的表达模式 并对 CHS1 进行亚细胞定位和功能 验证 为探究 CHS1 的广谱抗病作用机理提供依据 方法 分别以毛葡萄 Vitis quinquangularis 野酿二号 欧 亚种 Vitis vinifera 无核白 和山葡萄 Vitis amurensis 双红 叶片 cDNA 为模板 克隆 CHS1 分析不同品种 中 CHS1 的序列差异 并对 CHS1 蛋白的理化性质进行生物信息学分析 利用 qRT PCR 检测不同葡萄品种受到灰霉病菌和 霜霉病菌侵染后 CHS1 的表达模式 构建表达载体 利用农杆菌介导的瞬时表达技术 分别在烟草和 无核白 组培苗 叶片中进行亚细胞定位和抗病功能验证 结果 CHS1 在不同葡萄品种中高度保守 ORF 全长均为 1 182 bp 编码 393 个氨基酸 预测编码的蛋白分子量为 42 92 kD 为稳定的亲水蛋白 受灰霉病菌侵染后 毛葡萄 VqCHS1 和欧亚种 VvCHS1 的表达模式变化类似 但灰霉病抗性品种 野酿二号 中 VqCHS1 的表达水平整体显著偏高 受霜霉病菌侵染后 山葡 萄 VaCHS1 和欧亚种 VvCHS1 表现出不同的表达模式变化 霜霉病抗性品种 双红 中 VaCHS1 的表达量不断增加 而 VvCHS1 的表达量逐渐下降 亚细胞定位结果表明 CHS1 蛋白在细胞膜质 细胞核中都有分布 但以细胞核定位为主 人工接 种灰霉病菌和霜霉病菌后 与阴性对照相比 过表达 VaCHS1 的 无核白 叶片具有更强的灰霉病和霜霉病抗性 结 论 抗性品种中查尔酮合成酶基因 CHS1 的表达量比感病品种高 过表达 CHS1 能够提高感病葡萄品种对灰霉病和霜霉 病的抗性 关键词 查尔酮合成酶 葡萄 灰霉病菌 霜霉病菌 抗病性 The Role of Chalcone Synthase Gene in Grape Resistance to Gray Mold and Downy Mildew GUO ZeXi SUN DaYun QU JunJie PAN FengYing LIU LuLu YIN Ling Key Lab of Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Guangxi Academy of Agricultural Sciences Nanning 530007 Abstract Objective The objective of this study is to clone the chalcone synthase gene CHS1 in different resistant grape varieties clarify the expression pattern under the infection of Botrytis cinerea and Plasmopara viticola verify the subcellular localization and function of CHS1 and to provide a basis for exploring the broad spectrum resistance mechanism of CHS1 Method CHS1 genes were cloned from the leaf cDNAs of Vitis quinquangularis Yeniang 2 Vitis vinifera Thompson Seedless and Vitis amurensis Shuanghong The differences in the nucleic acid sequence and physicochemical properties of CHS1 protein were analyzed by bioinformatics Expression patterns of CHS1 in different varieties during B cinerea and P viticola infection were also detected by 1140 中 国 农 业 科 学 55卷 qRT PCR The expression vector was constructed and the transient expression technology mediated by Agrobacterium was used to verify the subcellular localization and disease resistance function in the leaves of tobacco and Thompson Seedless tissue culture seedlings Result The CHS1 is highly conserved among different grape varieties The full length of ORF is 1 182 bp which encodes 393 amino acids The predicted molecular weight of the encoded protein is 42 92 kD which is a stable hydrophilic protein After being infected by B cinerea the expression patterns of VqCHS1 and VvCHS1 were similar but the expression level of VqCHS1 in the resistant variety Yejiang 2 was significantly higher After being infected by P viticola VaCHS1 and VvCHS1 showed different expression pattern changes The expression level of VaCHS1 in the resistant variety Shuanghong continued to increase while the expression level of VvCHS1 gradually decreased The results of subcellular localization showed that CHS1 protein is distributed in the cytoplasm and nucleus but it is mainly localized in the nucleus Compared with the negative control the Thompson Seedless leaves overexpressing VaCHS1 showed stronger resistance to gray mold and downy mildew after artificial inoculation Conclusion The expression level of CHS1 in resistant varieties is higher than that in susceptible varieties and overexpression of CHS1 can increase the resistance of susceptible grape varieties to gray mold and downy mildew Key words chalcone synthase CHS grape Botrytis cinerea Plasmopara viticola disease resistance 0 引言 研究意义 葡萄是我国广泛种植的果树 其果 实可以用来鲜食 酿酒 制干和制汁等 具有重大的 经济价值 国家统计局统计数据显示 2019 年我国葡 萄种植面积达到 72 62 万公顷 产量为 1 419 54 万吨 灰霉病和霜霉病是危害葡萄生长比较严重的两种病 害 会造成果实品质下降 严重减产 甚至绝收 生 产上主要采用化学药剂防治灰霉病和霜霉病 普遍存 在病原菌易产生抗药性 增加生产成本并造成一定的 环境问题 因此 培育广谱抗病优质葡萄品种是葡萄 育种的重点 将抗病品种中的查尔酮合成酶 chalcone synthase 基因 CHS 转入感病品种 提高对灰霉菌和 霜霉菌的抗性 了解 CHS 在葡萄抗灰霉病和霜霉病中 的作用机制 可为广谱抗病品种的培育提供理论依据 前人研究进展 类黄酮 flavonoid 是一类低分子 量多酚化合物的总称 在植 物受到病原菌侵染时类黄 酮合成途径被迅速激活 进而起到防御作用 类黄酮 不仅在植物自身生理生化方面具有重要作用 例如种 子的显色反应 逆境的抵抗 1 抗病害 2 和信号传导 3 等 在临床上还具有防癌 4 抗氧化 5 抗疟疾和抗 动脉硬化等功能 查尔酮合成酶 CHS 是类黄酮 合成途径中的关键酶 也是限速酶 研究表明 在 番茄 6 亚麻 7 小麦 8 烟草 9 和苹果 10 中过表达 CHS 能够增加对虫害和病原菌等环境胁迫的抗性 而在彩色棉中 GhCHS1 参与植株体内和纤维中花青素 的合成与累积 在纤维色泽形成中起着关键作用 11 本研究切入点 前期本课题组通过对多个葡萄品 种响应不同病原菌侵染的转录组数据分析 发现 CHS1 XM 019224647 1 的表达量在不同抗性品种 响应葡萄灰霉病菌 Botrytis cinerea 和葡萄霜霉病菌 Plasmopara viticola 的侵染过程中均存在显著差 异 推测该基因可能与抗病相关 DAO 等研究表明 植物 CHS 在紫外线或病原菌等胁迫条件下会被诱导 表达 从而导致类黄酮和异黄酮植物抗毒素的积累 并参与水杨酸防御途径 12 13 因此笔者推测 CHS 在 葡萄的抗病过程中也发挥重要作用 拟解决的关键 问题 从野生毛葡萄 野酿二号 Vitis quinquangularis cv Yeniang 2 欧洲葡萄 无核白 Vitis vinifera cv Thompson Seedless 和山葡萄 双红 Vitis amurensis cv Shuanghong 中克隆 CHS1 分析其在不同品种中 的序列差异和蛋白特征 并通过 qRT PCR 检测该基因 受灰霉病菌和霜霉病菌侵染后不同时间点的表达差 异 通过叶片瞬时表达明确该基因的亚细胞定位和抗 性功能 为培育广谱抗病的葡萄新品种提供新的思路 和策略 1 材料与方法 试验于 2020 年在广西作物遗传改良生物技术重 点开放实验室完成 1 1 材料与试剂 1 1 1 材料 野生毛葡萄 野酿二号 由广西壮族自 治区农业科学院组培苗公司提供 欧洲葡萄 无核白 和山葡萄 双红 来自广西壮族自治区农业科学院试 验基地 葡萄灰霉病菌由北京市农林科学院植物保护 研究所惠赠 葡萄霜霉病菌由广西作物遗传改良生物 技术重点开放实验室葡萄分子设计育种团队分离保 存 本氏烟 Nicotiana benthamiana 和葡萄组培苗均 在光照 16 h 黑暗 8 h 25 生长条件下培养 6 期 郭泽西等 查尔酮合成酶基因在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的作用 1141 1 1 2 试剂 植物总 RNA 提取试剂盒 Spectrum Plant Total RNA Kit 购自西格玛奥德里奇 上海 贸 易有限公司 反转录试剂盒 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 购自 TaKaRa 大连 公司 高保 真 DNA 聚合酶 2 Phanta Max Master Mix 感受态细 胞 Fast T1 和克隆试剂盒 5 min TA Blunt Zero Cloning Kit 购自南京诺唯赞生物科技有限公司 胶回收试剂盒 QIAquick Gel Extraction Kit 和质粒小提试剂盒 TIANprep Mini Plasmid Kit 购自天根生化科技有限公 司 荧光定量试剂盒 LightCycle 480 SYBR Green Master 购自广州聚研生物科技有限公司 1 2 方法 1 2 1 CHS1 的克隆 野酿二号 无核白 和 双 红 叶片总 RNA 提取参照 Spectrum Plant Total RNA Kit 试剂盒说明书 参照 TaKaRa 公司的 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 的试剂盒说明书进行 cDNA 的合成 根据 NCBI 上的 CHS1 序列 登录号 XM 019224647 1 设计特异引物 CHS1 F 和 CHS1 R 引物序列见表 1 以 cDNA为模板 利用 2 Phanta Max Master Mix 试剂盒进行扩增 反应条件 95 预变性 3 min 95 15 s 54 15 s 72 45 s 30 个循环 72 延伸 5 min 1 的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物 参照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行 PCR 产物回 收 回收片段参照 5 min TA Blunt Zero Cloning Kit 试 剂盒与 T 载体进行连接 37 连接 5 min 将连接 产物转化到 Fast T1 化学感受态细胞 具体步骤参照 Fast T1 的说明书 挑取白斑 PCR 检测 检测的引物 为 CHS1 F 和通用引物 M13 F 质粒的提取步骤详见 TIANprep Mini Plasmid Kit 试剂盒说明书 将质粒送 往上海生工公司测序 将测序的结果用软件 Vector NTI Explorer 进行序列的组装 碱基序列和氨基酸序 列的比对使用 DNAMAN 软件 用蛋白质系统分析工 具 http web expasy org protparam 分析 CHS1 蛋白 的理化参数 表 1 本试验所用引物序列 Table 1 Primer sequences used in this study 引物名称 Primer name 序列 Primer sequence 5 3 用途 Purpose CHS1 F ATGGTGTCAGTGGGGGAAAT CHS1 R TGCTACACAATCGACTCAC 基因扩增 Gene amplification CHS1 qF CGTTCTGAGCGAGTATGGGA CHS1 qR TGTGGTGCCCTTTCCTTCTT 实时荧光定量 PCR Real time fluorescence quantitative PCR EF 1 F AATTTTGACCAAGATCGACAGG EF 1 R CAGCAACAGTTTGACGCATG 葡萄内参基因 Reference gene in grape CHS1 2F GCTCTAGAATGGTGTCAGTGGGGGAAATC CHS1 2R GCCCCGGGATGTGAGTCGATTGTGTAGCA 亚细胞定位 Subcellular localization 1 2 2 病原菌培养及接种方法 葡萄霜霉病菌的培 养和接种 取不同葡萄品种一年生枝条上第 2 4 位健 康的完全伸展开的幼嫩叶片 用无菌水清洗两次 滤 纸吸干叶片表面水分 用打孔器打取直径为 1 或 1 5 cm 的叶盘 放入铺有两层湿润滤纸的培养皿中进行保 湿 将实验室在 赤霞 叶片上扩繁的葡萄霜霉病菌 配置成浓度为 2 10 5 mL 的孢子囊悬浮液 用移液器 接种到 野酿二号 无核白 和 双红 的叶盘上 每个叶盘上接种 35 L 在抗性表型观察试验中 每 个品种接种 12 个叶盘 葡萄灰霉菌病的培养和接种 在超净工作台上 将在 PDA 培养基上新活化的灰霉病菌作为接种试材 用灭过菌的打孔器在灰霉病菌菌落边缘打下直径 0 5 cm 菌块 如霜霉病菌接种步骤中准备的叶盘 叶盘中 间用无菌牙签刺一个小孔 将灰霉病菌菌块倒扣在叶 盘针刺处 使得菌丝与叶片接触 在相对湿度 90 22 黑暗条件下培养 3 d 观察发病症状 在抗性表型 观察试验中 每个品种接种 16 个叶盘 1 2 3 CHS1 的表达模式分析 取不同葡萄品种一年 生枝条上第 2 4 位健康的幼嫩叶片 用超纯水清洗两 次 滤纸吸干叶片表面水分 用打孔器打取直径为 1 cm 的叶盘 放入铺有两层湿润滤纸的培养皿中进行 保湿 叶盘均分到 5 个培养皿中 每个皿的标记为 0 6 12 24 和 48 h 每个品种选取长势一致的 3 棵植 1142 中 国 农 业 科 学 55卷 株作为 3 个生物学重复 按照 1 2 2 中的接种方法 分 别进行霜霉病菌和灰霉病菌接种 并分别在 0 6 12 24 和 48 h 取样 迅速用液氮冷冻 保存于 80 冰箱 备用 叶盘 RNA 提取和 cDNA 合成参照 1 2 1 利用 Primer 5 0软件设计荧光定量引物 CHS1 qF R 以 EF 1 为内参基因 引物信息见表 1 使用 ROCHE 公司的 LightCycle 480 进行荧光定量 PCR 每个生物学重复设 置 3 个技术重复 荧光定量反应体系参照 LightCycle 480 SYBR Green Master 说明书 采用 2 Ct 法计算不 同时间点 CHS1 相对 0 h 的表达量变化 采用 IBM SPSS Statistics 计算各组别间的差异显著性 1 2 4 VaCHS1 的亚细胞定位 以 双红 叶片 cDNA 为模板 使用含有 Xba 和 Xma 酶切位点的上下游 引物 CHS1 2F R 利用 2 Phanta Max Master Mix 进 行 PCR 扩增 同时使用 Xba 和 Xma 酶切 pBI121 GFP 载体 将目的基因和载体大片段回收纯化后进行 连接 将连接产物转化到大肠杆菌 DH5 感受态细 胞 通过 PCR 酶切鉴定阳性克隆并进行测序 将 构建成功 测序正确的重组载体质粒通过电转化法转 入农杆菌 GV3101 28 培养 2 d 参照尹玲 14 的瞬 时转化方法注射烟草叶片 48 h 后取标记的农杆菌注 射的烟草叶片 于激光共聚焦显微镜 C2 ER Nikon Japan 下观察 GFP 融合蛋白的绿色荧光位置 拍照 记录 1 2 5 VaCHS1 瞬时转化至葡萄叶片 将 pBWA V HS VaCHS1 GFP 过表达载体转化到农杆菌 GV3101 挑取单菌落接种到 5 mL YEP 培养基上 并加上 2 5 L 的 100 ng mL 1 的卡那霉素 在 28 200 r min 的摇 床上培养 2 d 2 d 后 将旧培养基上的菌液吸取 200 L 至 20 mL 新鲜 YEP 中生长 24 h 后 将细菌培养物转 移到 50 mL 离心管 室温下 1 500 g 离心 4 min 用 渗透缓冲液 50 mmol L 1 MES pH 5 6 2 mmol L 1 Na 3 PO 4 0 5 蔗糖 w v 和 100 mol mL 1 乙酰丁香 酮 洗涤沉淀两次 并将细菌悬浮液稀释至 OD 600 为 0 2 在 25 黑暗环境中生长 1 2 h 注射前轻轻摇 动离心管 使用不带针头的 1 mL 注射器注射菌液到 无核白 叶片远轴端 渗透后 将叶片转移到光照 16 h 黑暗 8 h 温度为 22 的生长室生长 2 d 后 分别用灰霉病菌和霜霉病菌鉴定瞬转后葡萄叶片的抗 性 同时以 pBWA V HS GFP 空载作为对照 接种方 法与 1 2 2 中离体叶盘类似 但是整片叶子接种时注意 避开叶片的主叶脉 同时接种点要与观察到 GFP 荧光 的注射点尽量保持重合 每组鉴定选取 5 片叶子作为 生物学重复 2 结果 2 1 不同葡萄品种接种霜霉病菌和灰霉病菌的表型 通过室内离体叶盘法接种鉴定发现 野酿二号 无核白 和 双红 3 个葡萄品种对霜霉病的抗性 存在较大差异 如图 1 所示 欧亚种 无核白 接种 5 d 后 叶盘上可以观察到明显的白色霜霉 而山葡萄 双红 和毛葡萄 野酿二号 的叶盘表面未见任何 发病症状 同样地 利用室内离体叶盘法对 3 个品种 进行灰霉病抗性鉴定 结果表明 相同面积的灰霉病 菌菌块接种相同大小的叶盘 5 d 后 无核白 表现 图 1 不同葡萄品种接种霜霉病菌和灰霉病菌后的表型 Fig 1 Phenotypes of leaf discs of different grape varieties inoculated with P viticola and B cinerea 6 期 郭泽西等 查尔酮合成酶基因在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的作用 1143 出明显的发病症状 病斑直径显著大于 双红 而 野酿二号 叶盘上只观察到接种前针刺的小孔 这 表明 欧亚种 无核白 对霜霉病菌和霜霉病菌均表 现为感病 野酿二号 和 双红 则对这两种病原 菌均有较强的抗性 2 2 不同葡萄品种 CHS 的克隆和序列分析 以 野酿二号 无核白 和 双红 cDNA 为 模板 利用 RT PCR 分别从 3 个品种中扩增出 VqCHS1 VvCHS1 和 VaCHS1 的编码区序列 全长均 为 1 182 bp 编码 393 个氨基酸 预测编码的 CHS1 蛋白的分子量为 42 92 kD 理论等电点为 6 10 包含 20 种氨基酸 正电荷的氨基酸 Arg Lys 43 个 负 电荷的氨基酸 Asp Glu 48 个 不稳定性系数为 34 59 属于稳定蛋白 且亲水性平均系数 GRAVY 为 0 064 为亲水蛋白 TMHMM 在线网站分析表明 该蛋白没有跨膜结构域 不属于跨膜蛋白 序列比对 分析结果如图 2 所示 VvCHS1 和 VaCHS1 的氨基酸 序列完全一致 VqCHS1 与 VvCHS1 VaCHS1 只在 第 61 位存在 1 个氨基酸的差异 说明 CHS1 在不同品 种中高度保守 图 2 VqCHS1 VvCHS1 和 VaCHS1 的氨基酸序列比对 Fig 2 Amino acid sequence alignment of VqCHS1 VvCHS1 and VaCHS1 2 3 不同品种受到病原菌侵染后 CHS1 的表达模式分析 用打孔器在 野酿二号 和 无核白 的嫩叶上 打取叶盘 直径 0 5 cm 灰霉病菌菌块进行侵染 并在 侵染后 0 6 12 24 和 48 h 分别收集叶盘用于 CHS1 的荧光定量分析 结果如图 3 所示 与 0 h 相比 灰 霉病菌侵染 6 h 后 野酿二号 VqCHS1 诱导上调表 达 侵染后 12 24 h 表 达 量 比 6 h 有所下降 而 48 h 又急剧上升 感病品种 无核白 VvCHS1 的表达模 式变化虽然与之类似 但整体表达量均低于抗灰霉病 的 野酿二号 VqCHS1 用相同浓度的霜霉病菌孢子囊悬浮液接种 双红 和 无核白 的嫩叶叶盘 接种后 0 6 12 24 和 48 h 分别取样用于 VaCHS1 和 VvCHS1 表达量分析 结果如图 4 所示 霜霉病菌侵染后 抗霜霉病的品种 双红 中的 VaCHS1 的持续上调表达 在 24 h 时表 达量达到最高 48 h 时表达量略有下降 而感病品种 无核白 VvCHS1 的表达量持续下降 在 48 h 时略 有回升 b b a b b b c b a a 0 5 10 15 20 25 VqCHS1 VvCHS1 0 hpi 6 hpi 12 hpi 24 hpi 48 hpi 柱上不同小写字母表示相对表达量在 0 05 水平上差异显著 图 4 同 Different lowercase letters on the bars indicate significant difference in the relative expression at 0 05 level The same as Fig 4 图 3 灰霉病菌侵染 野酿二号 和 无核白 过程 CHS1 的表达变化 Fig 3 The expression changes of CHS1 in Yeniang 2 and Thompson Seedless during B cinerea infection 1144 中 国 农 业 科 学 55卷 2 4 CHS1 蛋白的亚细胞定位 为了验证 VaCHS1 的亚细胞定位 将含有 pBI121 VaCHS1 GFP 载体的农杆菌瞬时转化至烟草叶片表皮 细胞中 表达 pBI121 GFP 的烟草叶片为阴性对照 观察融合蛋白的荧光位置 结果如图 5 所示 瞬时表 达 pBI121 GFP 的细胞 绿色荧光分布在细胞膜 细 胞核和细胞质 而瞬时表达 pBI121 VaCHS1 GFP 的 细胞 绿色荧光主要分布在细胞核内 少量分布在细 胞膜 2 5 CHS1 的抗病功能验证 为了验证 CHS1 在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的功 能 将 pBWA V HS GFP 和 pBWA V HS VaCHS1 GFP 分别瞬时转化感病品种 无核白 组培苗叶片 2 d 后 首先在紫外灯下观察蛋白的表达情况 如图 6 A 6 B 所示 观察到明显的绿色荧光 说明 pBWA V HS GFP 和 pBWA V HS VaCHS1 GFP 在 无核白 a a b a b a c a b a 0 3 6 9 12 15 VaCHS1 VvCHS1 0 hpi 6 hpi 12 hpi 24 hpi 48 hpi 3 图 4 霜霉病菌侵染 双红 和 无核白 过程 CHS1 的表 达变化 Fig 4 The expression changes of CHS1 in Shuanghong and Thompson Seedless during P viticola infection ABCD EFGH pBI121 GFP pBI121 VaCHS1 GFP A E 荧光蛋白通道 Fluorescent protein channel B F 叶绿体荧光蛋白通道 Chloroplast fluorescent protein channel C G 明场 Bright field D H 荧光蛋白通道 叶绿体荧光蛋白通道和明场的叠加图 Merged field 图 5 CHS 蛋白在烟草叶片中的亚细胞定位 Fig 5 Subcellular localization of CHS protein in tobacco leaves 上正常表达 然后用直径为 0 5 cm 的灰霉病菌菌块和 浓度为 2 10 5 孢子囊 mL 的霜霉病菌菌液分别侵染瞬 时转化的叶片 5 d 后观察发病情况 结果如图 6 C 6 D 所示 表达 VaCHS1 的 无核白 叶片接种灰霉 病菌后 发病面积和严重程度明显小于对照组 抗性 显著增强 5 个重复试验鉴定结果表现一致 如图 6 E 6 F 所示 对照组 无核白 叶片接种点周围可以观 察到明显的白色霜霉菌 而过表达 VaCHS1 的 无核 白 叶片表现出较强的霜霉病抗性 叶片表面几乎观 察不到病菌生长 5 片叶子重复表型一致 3 讨论 3 1 CHS 基因结构与抗病性 类黄酮是植物重要的次生代谢产物 参与植物对 6 期 郭泽西等 查尔酮合成酶基因在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的作用 1145 A B GFP 和 VaCHS1 GFP 荧光蛋白表达 Expression of fluorescent protein of GFP and VaCHS1 GFP C E 灰霉病菌 霜霉病菌侵染表达 GFP 的 无核白 叶片 B cinerea and P viticola infect Thompson Seedless leaves expressing GFP D F 灰霉病菌 霜霉病菌侵染表达 VaCHS1 的 无核白 叶片 B cinerea and P viticola infect Thompson Seedless leaves expressing VaCHS1 图 6 CHS1 的抗病功能验证 Fig 6 Function verification of CHS1 in disease resistance 逆境环境的抵抗 15 CHS 是类黄酮合成途径中的关键 酶 也是限速酶 16 查尔酮合成酶基因家族是个古老 的基因家族 具有高度保守性 17 目前为止 在盐肤 木 金钱莲 桑树 海南龙血树和高粱等多种植物中 都已克隆得到 CHS 本研究克隆到的 VqCHS1 VvCHS1 和 VaCHS1 3个基因的 ORF 均为 1 182 bp 编码 393 个氨基酸 与显齿蛇葡萄 18 中克隆得到的 AgCHS1 和巨峰葡萄中克隆得到的 CHS4 19 的 ORF 长 度完全一致 说明 CHS 在同一科 属的植物中具有高 度保守性 而在草地早熟禾 17 和盐肤木 20 中克隆得到 的 PpCHS1 和 RcCHS 的 ORF 长度则为 1 170 和 1 173 bp 说明不同物种间的 CHS 存在一定差异 此外 1146 中 国 农 业 科 学 55卷 CHS 上游的启动子包含一些特殊元件调控自身的表 达 例如银杏 GbCHS 启动子区存在紫外 蓝光响应单 元 植物激素响应单元 真菌诱导元件 MYB 结合位 点 TATA box 和 CAAT box 等多个顺式作用元件 21 龙血树 DcCHS1 的启动子区域中包含大量光应答元 件 激素应答元件 MBY 结合相关元件以及参与防御 和应激反应的富含 TC 的重复元件 22 小 麦 CHS 启动 子上的 ABRE 脱落酸响应原件 和茉莉酸甲酯的响 应原件被外界条件刺激 病原体侵染 创伤和低温胁 迫 后会诱导 CHS 表达 8 本研究中抗霜霉病品种 双 红 的 VaCHS1 与感病品种 无核白 的 VvCHS1 之 间无氨基酸差异 推测抗病性差异可能与其基因上游 的启动子序列差异有关 3 2 CHS 在各种胁迫下的表达变化 CHS 的表达受到多种外界环境刺激的控制 包括 紫外线 病原菌 创伤和生物钟等各种生物和非生物 胁迫 23 研究表明 不同 CHS 受到不同的刺激 其表 达模式的变化也不尽相同 VvCHS1 和 VvCHS2 在受 到创伤时仅表现出轻微的上调表达 而 VvCHS3 则在 创伤后 8 h 表达量增加 5 倍 与创伤处理相比 UV C 和霜霉病菌处理后 3 个 VvCHS 的转录物积累则均 显著减少 24 而在 CIAFFI 等 25 的研究中发现 在 不同基因型的葡萄品种中 3 种 VvCHS 组成型表达 量存在显著差异 但这种差异与葡萄对霜霉病的抗 性并无显著相关性 接种霜霉病菌后 在抗性较强 品种中 霜霉 病菌接种导致从感染的早期阶段 16 24 hpi 开始 转录物积累稳定且显著减少 上述两项 研究中 推测在抗性品种中 CHS 表达水平的下降是由 于与该基因具有相同催化底物的芪合酶表达量大幅提 高 二者对底物的竞争性抑制导致的 对霜霉病有较 强抵抗力的黄瓜品种 Jing Chun NO 4 受到黄瓜霜霉 病菌侵染后 CHS 在 25 hpi 到 30 hpi 时表达量增加了 5 倍以上 随后又迅速降低 26 使用葡萄的寄主病原 菌 葡萄霜霉病菌和非寄主病原菌 黄瓜霜霉病 菌分别接种抗病葡萄 Gloire 和感病葡萄 Riesling 时 发现两种病菌都能诱导 CHS 的表达 但感病葡萄 Riesling 中 CHS 的表达量低于抗病葡萄 Gloire 值得注意的是 抗病品种中 CHS 有较弱的组成型表达 而在感病品种中则没有 27 本研究分别用灰霉病菌侵 染 野酿二号 和 无核白 霜霉病菌侵染 双红 和 无核白 发现抗病品种 野酿二号 双红 中 VqCHS1 和 VaCHS1 在受到病原菌侵染后都可以诱 导上调表达 而感病品种 无核白 中 VvCHS1 的表 达量明显低于 VqCHS1 和 VaCHS1 这与 QIAO 等 26 和 KORTEKAMP 27 的研究结果一致 说明 CHS 在抗 病葡萄抵抗灰霉病菌和霜霉病菌侵染过程中发挥重要 作用 CHS 可以通过催化形成不同的类黄酮化合物来 提高植物的抗病能力 也可通过改变植保素 26 黄酮 素 23 抗氧化酶 SOD 和 POD 9 等的积累以及防御酶 的活性来提高防御能力 在烟草中过表达或沉默 NtCHS 可以显著提高或减少烟草叶片中总黄酮 绿 原酸 芸香苷 花青素等物质的含量 9 抗枯萎病的 棉花品种中 CHS 表达量明显上调后 类黄酮的含量提 高从而增加其对枯萎病的抗性 28 本研究中在感病品 种 无核白 叶片中瞬时表达 VaCHS1 能够提高对灰 霉病和霜霉病的抗病能力 但具体是通过何种途径诱 导 CHS 的表达还有待进一步验证 4 结论 从不同抗性的葡萄品种 野酿二号 双红 无 核白 中分别克隆了 CHS1 该基因高度保守 主要 定位于细胞核 虽然 CHS1 受灰霉病菌和霜霉病菌 侵染后表达模式的变化不同 但抗性品种 野酿二 号 以及 双红 中 CHS1 的整体表达水平均显著 高于感病品种 无核白 过表达 VaCHS1 可以显 著提高 无核白 叶片对灰霉病和霜霉病的抗性 表明 CHS1 在葡萄抵御灰霉病和霜霉病的过程中发 挥重要的作用 参考文献 References 1 王佳媛 海南龙血树查尔酮合酶基因 DcCHS 的克隆及其启动子 功能分析 D 海口 海南大学 2014 WANG J Y Cloning of chalcone synthase gene from Dracaena cambodiana and functional identification of its promoter D Haikou Hainan University 2014 in Chinese 2 王志彬 柑橘查尔酮合成酶基因遗传多样性及其功能研究 D 重 庆 西南大学 2019 WANG Z B Genetic diversity and functional study of chalcone synthase gene in citrus D Chongqing Southwest University 2019 in Chinese 3 ZHAO C Y WANG F LIAN Y H XIAO H ZHENG J K Biosynthesis of citrus flav