3种兰科植物种子非共生萌发成苗比较.pdf

2022年4月 陕西理工大学学报 自然科学版 Apr 2022 第38卷第2期 Journal of Shaanxi University of Technology Natural Science Edition Vol 38 No 2 引用格式 张娜 曹小勇 胡选萍 等 3种兰科植物种子非共生萌发成苗比较 J 陕西理工大学学报 自然科学版 2022 38 2 66 71 3种兰科植物种子非共生萌发成苗比较 张 娜1 曹小勇1 2 胡选萍1 2 秦公伟1 2 王思蕲1 赵 垚1 1 陕西理工大学生物科学与工程学院 陕西汉中723000 2 陕西省资源生物重点实验室 陕西汉中723000 摘 要 以白及 杜鹃兰 建兰种子为离体培养材料 比较三者非共生萌发及成苗过程 结果 表明 3种兰科植物成苗过程存在明显差异 白及种胚膨大成原球茎后上端形成叶片 随后形 成根直接成苗 杜鹃兰的原球茎先形成根状茎 顶端分化出叶芽 叶基部长出根发育成苗 建兰 萌发形成根状茎后持续增殖 需改变培养基激素 才可分化成苗 建兰根状茎与杜鹃兰的明显 不同 具有向地性 且杜鹃兰的根状茎仅能进行有限分支并形成休眠芽 结论 兰科植物种子 非共生萌发成苗可区分为3种模式 白及是绝大多数兰科种子非共生萌发成苗的模式 关键词 兰科植物 种子 非共生萌发 原球茎 根状茎 成苗 中图分类号 Q945 文献标识码 A 文章编号 2096 3998 2022 02 0066 06 收稿日期 2021 07 07 修回日期 2021 10 11 基金项目 陕西省教育厅重点实验室科研计划项目 18JS017 通信作者 曹小勇 1964 男 陕西泾阳人 教授 主要研究方向为植物生物技术 兰科植物自古以来便被赋予了不同的寓意和象征 拥有着高贵的品质 散发着自然之美和人文之 美 1 作为种类最多 分布最广的有花植物之一 兰科植物的生态类型丰富 且多为珍稀濒危植物 药 用 观赏价值较高 2 兰科植物资源再生及合理开发利用多采用种子共生萌发与非共生萌发 其中 非共生萌发应用更为 广泛 2 白及 Bletilla striata 3 的非共生萌发研究表明 白及种胚膨大至突破种皮后形成原球茎 原球 茎的顶端分化叶芽 基部生根形成幼苗 4 千代兰 Ascocenda Fuchs Gold 5 西藏虎头兰 Cymbidi um tracyanum 6 蝴蝶兰 Phalaenopsis aphrodite 7 等植物种子非共生萌发的过程与白及相同 对建兰 C ensifolium 3 的非共生萌发研究中发现 其种胚形成原球茎后进行伸长生长 至根状茎阶段可持续 增殖 根状茎继代培养形成芽后成苗 8 墨兰 C sinense 9 春兰 C goeringii 10 寒兰 C kan ran 11 大花蕙兰 C hybrid 12 等兰科植物种子非共生萌发的过程与建兰的相同 兰科植物种子非 共生萌发除白及和建兰的萌发成苗模式外 是否还存在与上述二者差异的形式 目前尚未见报道 本课题组在对杜鹃兰 Cremastra appendiculata 种子非共生萌发研究中 发现其萌发过程与白及 建 兰不同 本文通过对白及 杜鹃兰 建兰3种兰科植物非共生萌发成苗过程比较观察 展示3种兰科植 物种子非共生萌发成苗的差异 为兰科植物非共生萌发研究提供参考 1 试验 1 1 材料 非共生萌发培养材料 采集白及 建兰 杜鹃兰成熟未开裂蒴果分别置于广口瓶内 自来水冲洗3 4次后 置SW CJ 2D双人单面垂直净化工作台上使用体积分数75 酒精和质量分数10 次氯酸钠溶 66 液对蒴果消毒 无菌水冲洗3 4次 取出置于无菌培养皿内切除蒴果两端 划开侧面 用镊子夹取蒴果 将种子抖入无菌玻璃瓶内 晾干后存储于4 冰箱备用 1 2 方法 1 2 1 培养方法 白及种子 2021年1月播种 2021年2月成苗 培养50 d 1 2MS固体培养基 杜鹃兰种子 2020 年10月播种 2021年4月成苗 培养6个月 1 2MS 2 g L水解酪蛋白 0 5 mg L NAA液体培养基 培养至多数产生分支后移入配制相同的固体培养基内 建兰种子 2019年10月播种 2021年5月成苗 培养19个月 种子萌发培养基为1 2MS固体培养基 根状茎分化培养基为1 2MS 2 0 mg L 6 BA 0 2 mg L NAA固体培养基 培养温度 25 2 光照时间12 h d 静置培养 白及光照培养 光照2500 3000 lx 杜鹃兰弱光 培养 光照500 1000 lx 建兰种子萌发前暗培养 萌发后 140 d 移至光下培养 光照2500 3000 lx 1 2 2 观察记录 Nikon SMZ800体视显微镜定期观察白及 杜鹃兰 建兰种子的非共生萌发生长情况 观察白及时 未形成原球茎前可隔瓶身观察 形成原球茎后 需每次选20个样本挑出至培养皿后 在体视显微镜下观 察 杜鹃兰与建兰在形成根状茎后 不同生长阶段各选20个样本挑出观察 图像采集使用Leica M205C 体视显微镜 2 结果观察 2 1 白及非共生萌发成苗 培养7 d 大多数种子种胚膨大 变绿 种胚突破种皮 形成原球茎 图1 A 原球茎呈卵圆形 绿色 均匀 培养15 d 原球茎顶端生长出叶片 图1 B 基部形成簇状假根 均匀分布 培养约30 d 原球茎 基部分化出不定根 图1 C 培养50 d 形成三叶两根幼苗 图1 D 图1 白及非共生萌发成苗过程 2 2 杜鹃兰非共生萌发成苗 培养约20 d 种胚膨大至突破种皮 图2 A 培养30 d 形成原球茎 出现假根 培养约60 d 形成 根状茎 图2 B 少数根状茎形成分支 一些呈绿色 顶端鳞片无色 根状茎生长过程中会弯曲 形成背 腹面 假根在背面较多 腹面较少 培养约90 d 出现褐变 根状茎产生多级分支 次级分支顶端形成休 眠芽 图2 C 上面箭头 培养约130 d 根状茎顶端产生叶片 培养180 d 着生叶片的部位分化出根 76 第2期 张娜 曹小勇 胡选萍 等 3种兰科植物种子非共生萌发成苗比较 形成幼苗 图2 D 培养240 d 形成假鳞茎 杜鹃兰根状茎大多为水平生长 不伸入培养基内部 根 状茎也存在不产生分支的情况 根状茎伸长 产生多枚鳞片后 顶端出现叶片分化成苗 图2 杜鹃兰非共生萌发成苗过程 杜鹃兰种子非共生萌发过程与白及不同 白及非共生萌发成苗过程为种胚膨大至突破种皮 形成 原球茎 原球茎上端形成叶片 随后形成根直接成苗 杜鹃兰原球茎形成后 伸长生长形成根状茎 顶端 分化出叶芽 叶基部长出根发育成苗 白及非共生萌发各阶段整齐度高 杜鹃兰整齐度较低 2 3 建兰非共生萌发成苗 种子在萌发培养基上培养约140 d 种胚膨大突破种皮 形成无色的原球茎 图3 A 培养约250 d 形成基部为绿色根状茎 图3 B 根状茎持续分支 呈现明显向地性 顶端没有芽的分化 培养450 d 形成大量鲜绿色分支 图3 C 根状茎顶端呈锥状 具鳞片 下侧是大量簇状假根 图3 D 当根状茎 转移到分化培养基 培养60 d 根状茎顶端膨大 形成由数枚光滑覆瓦状鳞片包裹的芽 图3 E 培养 约120 d形成具有叶和根的幼苗 图3 F 图3 E中箭头指示部位表示根状茎分化 图3 F中箭头指示 根的位置 杜鹃兰原球茎形成根状茎后仅进行有限分支即可分化成苗 分支期间会形成休眠芽且大多水平分 布于培养基表面 建兰原球茎形成根状茎后 持续产生分支增殖 改变培养基激素后才可进入分化阶 段 且其根状茎有明显向地性 3 分析与讨论 大多数兰科植物的非共生萌发培养过程与白及相同 如千代兰 Ascocenda Fuchs Gold 5 西藏 虎头兰 C tracyanum 6 扇形文心兰 Psygmorchis pusilla 13 蝴蝶兰 Phalaenopsis aphrodite 7 铁皮 石斛 Dendrobium officinale 14 小叶兜兰 Paphiopedilum barbigerum 3 卡特兰 Cattleya hybrida 3 大 花君子兰 Clivia miniata 3 金边龙舌兰 Agave americana Variegata Nichols 15 树兰 Epidendreae Humb 16 鹤望兰 Strelitzia reginae 17 等 3种成苗模式的兰科植物如图4所示 扇形文心兰种子非共生萌发种胚一端产生芽 随后产生多枚叶片 形成根 图4 A 13 蝴蝶兰原 球茎顶端存在生长点 根由原球茎下部分化产生 且其原球茎增殖产生大量原球茎 或直接分化成苗 图4 B 7 18 故白及是绝大多数兰科植物种子萌发成苗的模式 与建兰非共生萌发过程相同的兰科植物有墨兰 C sinense 9 春兰 C goeringii 10 寒兰 C kanran 11 大花蕙兰 C hybrid 12 蕙兰 C faberi 19 莲瓣兰 C tortisepalum 20 等 墨兰根状茎 持续增殖最合适的基本培养基是MS培养基 图4 C 9 寒兰根状茎在分化培养基中顶端分生组织分 86 陕西理工大学学报 自然科学版 第38卷 图3 建兰非共生萌发成苗过程 图4 3种成苗模式的兰科植物 化出芽 图4 D 11 建兰类的成苗模式中存在根状茎持续增殖阶段 需改变培养基激素才能分化成 苗 与杜鹃兰相同的兰科植物有黄花火烧兰 Epipactis flava 21 多花指甲兰 Aerides rosea 22 巨兰 Grammatophyllum speciosum 23 山兰 Oreorchis patens 24 地宝兰 Geodorum densiflorum 25 等 E flava的体外繁殖研究中展示了其成苗模式图 与杜鹃兰的相似 存在休眠芽 呈现显著顶端优势 图4 E 21 地宝兰根状茎水平生长 只进行有限分支后便可成苗 图4 F 25 杜鹃兰根状茎大多水平分布 在培养基表面 但当培养基中萘乙酸浓度呈倍数高于6 BA浓度时 其根状茎也存在伸入培养基内部的 情况 故激素可能会影响植物的形态发生 建兰持续增殖根状茎与分化根状茎 杜鹃兰根状茎上的休眠 芽与继续生长的分支 除外部形态存在差别外 内部结构也可能存在差异 可制作石蜡切片观察 96 第2期 张娜 曹小勇 胡选萍 等 3种兰科植物种子非共生萌发成苗比较 兰科作为被子植物第三大科 2 种子萌发过程可能存在更多类型 现有资料中还存在两种特别的 类型 鬼兰 Dendrophylax lindenii 种子发育成个体的过程没有叶的分化 光合作用器官为根 图5 A 26 天麻 Gastrodia elata 种子萌发形成个体的过程没有根和叶的分化 植株只具茎和花 图5 B 3 图5 A中箭头指示为根 26 图5 B中上侧箭头指示花序 下侧箭头指示块茎 二者种子萌发产 生的个体形态与本文描述的3种模式存在差异 也可据此作为两种 成苗 模式 但广义的成苗过程包 括叶与根的发生 27 上述二者可能不符合广义的成苗模式 图5 两种兰科植物 综上所述 本文将兰科植物种子离体培养成苗区分为3种模式 白及 杜鹃兰 建兰 白及是绝大 多数兰科种子萌发成苗的模式 在兰科植物的非共生萌发研究中 培养早期就可根据这3种成苗模式 确定该材料后续培养方案 另外 原球茎或根状茎的增殖有利于优良品种的高效工厂化生产和兰科植 物快速繁殖技术的发展 白及模式的原球茎和杜鹃兰模式的根状茎增殖与芽分化均可同时进行 建兰 模式根状茎的持续增殖特点可提供大量根状茎 分瓶转接至分化培养基上便可大规模生产幼苗 参 考 文 献 1 汪文忠 君子笔下的 中国兰文化 J 林业与生态 2020 4 44 45 2 刘思思 陈娟 郭顺星 兰科植物种子萌发的研究进展 J 种子 2015 34 6 43 50 3 中国科学院 中国植物志 编辑委员会 中国植物志 第18卷 M 北京 科学出版社 1999 4 陈菁瑛 万学锋 刘保财 等 白及种子非共生培养高效萌发体系的研究 J 福建农业学报 2018 33 2 131 135 5 叶一枝 陈春满 千代兰的组织培养和快速繁殖 J 植物生理学通讯 2004 5 581 6 王莲辉 姜运力 余金勇 等 西藏虎头兰的组织培养与快速繁殖 J 植物生理学通讯 2009 45 1 51 52 7 吕晓辉 蝴蝶兰的离体培养研究 D 郑州 郑州大学 2007 8 陈春 建兰 岭南奇蝶 种子无菌萌发与离体繁殖技术 J 亚热带农业研究 2016 12 2 125 129 9 许申平 袁秀云 王默霏 等 墨兰 Cymbiduim sinense 组培快繁技术体系研究 J 热带作物学报 2018 39 5 926 930 10 王松太 曾丽婷 方中明 等 兰属植物组织培养研究进展 J 黑龙江农业科学 2019 10 144 151 11 朱国兵 杨柏云 敖爱艳 寒兰的组织培养与试管开花 J 植物生理学通讯 2008 3 513 514 12 周永胜 胡松梅 大花蕙兰组织培养体系优化实验初探 J 南方农业 2020 14 30 152 153 13 韩一航 扇形文心兰 Erycina pusilla 离体快繁体系的建立 D 广州 华南农业大学 2017 14 张盈 李媛媛 陈晓梅 等 铁皮石斛种子共生萌发形态学观察 J 首都师范大学学报 自然科学版 2019 40 5 35 42 15 杨志坚 温杭凯 陈选阳 等 金边龙舌兰组织培养技术研究 J 江苏农业科学 2019 47 5 37 39 16 魏翠华 树兰离体培养和植株再生 简报 J 亚热带植物科学 2006 2 64 65 17 何俊彦 胡洁荃 徐卫平 鹤望兰组织培养与工厂化快繁程序的研究 J 西北植物学报 1996 4 407 411 07 陕西理工大学学报 自然科学版 第38卷 18 王晓丽 朱东昌 顾德锋 等 蝴蝶兰原球茎组织学研究 J 吉林农业大学学报 2003 4 397 399 19 吴正景 高文 马鑫婷 等 蕙兰种子根状茎培养与愈伤组织诱导 J 陕西农业科学 2021 67 5 28 31 20 刘祥 孙东玲 卓素卿 等 杂交莲瓣兰根状茎增殖和分化技术研究及分子鉴定 J 江苏农业科学 2018 46 17 156 160 21 KUNAKHONNURUK B INTHIMA P KONGBANGKERD A In vitro propagation of Epipactis flava Seidenf an endan gered rheophytic orchid a first study on factors affecting asymbiotic seed germination seedling development and green house acclimatization J Plant Cell Tissue 2 Shaanxi Key Laboratory of Bio resource Hanzhong 723000 China Abstract The seeds of Bletilla striata Cremastra appendiculata and Cymbidium ensifolium used as material were cultured in vitro to compare the asymbiotic germination and seedling establishment of the three species The results showed that there are obvious differences in the seedling establishment of the three or chids Seed embryo of B striata swelled into protocorms and leaves formed at the anterior end then the roots and seedlings established directly the protocorms of C appendiculata form rhizomes first the buds differenti ate at the anterior end roots develop at the base of the leaves and seedlings form the rhizomes of C ensifoli um formed after seed germination and proliferated continuously and it can differentiate into seedlings unless hormones changed in the medium the rhizome of C ensifolium is obviously different from that of C appendic ulata the former has geotropism and the latter can only generate limited branches and then form dormant buds Conclusion the asymbiotic germination of orchid seeds and seedling establishment can be divided into three modes The manner of B striata is the mode of most orchid plants Key words orchid seed asymbiotic germination protocorm rhizome seedling establishment 17 第2期 张娜 曹小勇 胡选萍 等 3种兰科植物种子非共生萌发成苗比较