专利：杜鹃根腐病病原菌的特异性检测靶标Ppini_05588及应用.pdf

19 国家知识产权局 12 发明 专利申请 10 申请公布号 43 申请公布日 21 申请 号 202210232204 2 22 申请日 2022 03 09 71 申请人 南京林业大 学 地址 210018 江苏省南京市玄武区龙蟠路 159号 申请人 南京海关动植物与食品检测中心 72 发明人 戴婷 婷 周紫薇 杨静 钱茱希 吴翠萍 74 专利代理 机构 镇江至睿专利代理事务所 普通 合 伙 3252 9 专利代理师 刘静 51 Int Cl C12Q 1 6895 2018 01 C12Q 1 686 2018 01 C12N 15 11 2006 01 C12R 1 645 2006 01 54 发明名称 杜鹃根腐病病原菌的特异性检测靶标 Ppini 05588及应用 57 摘要 本发明公开了一种引起杜鹃根腐病的病原 菌Phytophthora pini的特异性检测靶标Ppini 05588 该检测靶标Ppini 05588的DNA序列如SEQ ID NO 1所示 CDS序列如SEQ ID NO 1所示 蛋白 序列如SEQ ID NO 2所示 同时 还公开了特异性 检测靶标Ppini 05588的引 物对 其正向引 物序 列如SEQ ID NO 3所示 反向引物序列如SEQ ID NO 4所示 本发明所发掘的检测靶标和其设计的 引物对用于普通PCR 其特异性强 灵敏度高 为 杜鹃根腐病的病原菌P pini的检测提供了新的 技 术方法 权利要求书1页 说明书12页 序列表6页 附图2页 CN 114457186 A 2022 05 10 CN 114457186 A 1 一种引起杜鹃根腐病病原菌P pini的特异性检测靶标Ppini 05588 其特征在于 所 述检测标靶的DNA序列如SEQ ID NO 1所示 2 一种检测杜鹃根腐病病原菌P pini的引物对 其特征在于 所述引物对包括正向引 物和反向引物 所述正向引物Ppi05588 PCR F1序列如SEQ ID NO 3所示 反向引物 Ppi05588 PCR R1序列如SEQ ID NO 4所示 3 权利要求2所述的引物对在检测杜鹃根腐病 病原菌P pi ni中的应用 4 一种检测杜鹃根腐病病原菌P pini的试剂盒 其特征在于 至少包括1次用量的含有 权利要求3所述的引物对的检测溶 液 其中所述引物组合浓度为20 M 5 根据权利要求4所述的试剂盒 其特征在于 所述检测溶液还包括 4种dNTP各2000 M 10 0 L 10 PCR反应缓冲液 80mM Mg2 10 0 L 1 BSA 5 0单位Taq酶 6 权利要求 4 5任一所述的试剂盒在检测杜鹃根腐病 病原菌P pi ni中的应用 7 一种检测杜鹃根腐病病原菌P pini的方法 其特征在于 包括以下步骤 取1 L检测 对象的DNA溶液 加入23 L权利要求5中所述的检测溶液和1 L灭菌去离子水 总体积为25 L PCR扩增程序为94 变性3分钟 94 变性30秒钟 58 退火30秒 72 延伸45秒钟 33个 循环 最后72 延伸10分钟 权 利 要 求 书 1 1 页 2 CN 114457186 A 杜鹃根腐病 病原菌的特异性检测靶标Ppini 05 588及应用 技术领域 0001 本发明属于杜鹃根腐病病原菌检测技术领域 具体涉及杜鹃根腐病病原菌 Phytophthora pini的特异性检测靶标Ppi ni 05588及应用 背景技术 0002 Phytophthora pini是一种重要的卵菌植物病原体 P pini能够引起杜鹃根部的 腐烂以及 枝干溃疡 目前已发现P pini能在杜鹃 挪威云杉 杨 树 欧洲山毛榉树 橄榄树等 植物上致病 目前对该病还没有有效的防治措施 防止病原菌的传播扩散是控制该病的最 有效措施 因此为了更有效地检测该病菌 建立快速检测方法 为病害的风险及研究决策提 供依据 从而 有利于降低该病害的发生对生态 环境的保护起到一定的作用 0003 传统的卵菌分类鉴定主要是基于形态学特征 致病性测定 生理生化特征等 传统 的分离疫腐霉的方法采是用诱捕法从土壤 灌溉水和 植物材料中分离 传统方法在疫霉菌 的检测中发挥了重要作用 但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离 形态学 鉴定知识和丰富的经验 同时传统分类鉴定方法耗时长 灵敏度低 易受人为及环境等诸多 因素 的干扰 不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断 很难对病害发生进行及时的监测和 有效控制 所以为了快速并准确的检测到病原菌 发掘特异性好的靶基因是目前所有检测 技术的核心 不同的靶标序列检测的特异性和灵敏度存在一定的差距 因选择 的目标靶序 列不同 片段大小不同 结果 都会有很大差别 靶标基因的选择要确保其在种内的不同菌株 间的高度保守 而在种间变异性较高 0004 综上所述 发掘高信赖度特异性分子检测靶标并基于新靶标建立灵敏 准确的检 测技术体系对提升对杜鹃根腐病病原菌P pini的快速分子检测 研究及其检测时所致病害 早期诊断具有重要作用 发明内容 0005 针对现有技术中的技术问题 本发明提供一种杜鹃根腐病病原菌P pi ni的检测 靶标Ppini 05588及基于新检测靶标其PCR检测引物组合物 本发 明的另一目的是提供上述 杜鹃根腐病 病原菌P pi ni的PCR检测试剂盒 0006 第一方面 本发明提供了一种引起杜鹃根腐病病原菌P pini的特异性检测靶标 Ppini 05588 所述检测标靶的DNA序列如SEQ ID NO 1所示 0007 第二方面 本发明提供了一种检测 杜鹃根腐病病原菌P pini 的引物对 所述引物 对包括正向引物和反向引物 所述正向引物Ppi05588 PCR F1序列如SEQ ID NO 3所示 反 向引物Ppi0 5588 PCR R1序列如SEQ ID NO 4所示 0008 第三方面 本 发明提供了第二方面所述的引物对在 检测杜鹃根腐病病原菌P pini 中的应用 0009 第四方面 本发明还提供了一种检测 杜鹃根腐病病原菌P pini 的试剂盒 至少包 括 1次用量的含有本发明第二方面所述的引物对的检测溶液 其中所述引物组合浓度为20 说 明 书 1 12 页 3 CN 114457186 A M 0010 进一步地 所述检测溶液还包括 4种dNTP各2000 M 100 L 10 PCR反应缓冲液 80mM Mg2 10 0 L 1 BSA 5 0单位Taq酶 0011 第五方面 本发明还提供了第四方面所述的试剂盒在检测杜鹃根腐病病原菌 P pini中的应用 0012 第六方面 本发明还提供了一种检测 杜鹃根腐病病原菌P pini 的方法 包括以下 步骤 取1 L检测对象 的DNA溶液 加入23 L本发 明第四方面中所述的检测溶液和1 L灭菌去 离子水 总体积为25 L PCR扩增程序为94 变性3分钟 94 变性30秒钟 58 退火30秒 72 延伸45秒钟 3 3个 循环 最后72 延伸10分钟 0013 相比于现有技 术 本发明的优点 为 0014 1 本发明首次公开了高信赖度特异性分子检测靶标Ppini 05588 并基于该新靶 标建立灵敏 准确P CR检测技术体系 对提升对杜鹃根腐病病原菌P pini的快速 分子检测研 究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用 0015 2 采用本发明提供的检测引物对针对杜鹃根腐病病原菌P pini菌株和其他镰刀 菌 真菌以及松材线 虫 病原卵菌等进 行检测 结果显示仅有杜鹃根腐病病原菌P pini的检 测结果为阳性 能够扩增出特异性条带 条带大小为247bp 同时 经过特异性实验证明 PCR 法检测杜鹃根腐病 病原菌P pi ni基因 组DNA的灵敏度为10 0pg L 1 0016 3 本发明为杜鹃根腐病病原菌P pini 的检测提供了新 的检测靶标的发掘方法和 技术平台 在病害侵染初期鉴定出病原物 本发明可以用于带菌植株组织中杜鹃根腐病病 原菌P pi ni的快速检测 能够对感病样品进行 快速检测 附图说明 0017 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案 下面将对具体 实施方式描述中所需要 使用的附图作简单地介绍 0018 图1是基于杜鹃根腐病病原菌P pini新检测靶标Ppini 05588设计的特异性引物 Ppi05588PCR F1 Ppi05588PCR R1在疫霉菌种间普通PCR特异性验证电泳图 特异性引物上 游引物Ppi05588 PCR F1和下游引物Ppi05588PCR R1只能从供试的杜鹃根腐病病原菌 P pini菌株中特异地扩增出一条247bp的条带 而其余疫霉未产生目的条带 其中 从左边 到右边 依次为 1 Marker 2 杜鹃根腐病病原菌Phytophthorapini 3 辣椒疫霉 Phytophthora capsici 4 烟草疫霉Phytophthora nicotianae 5 大豆疫霉Phytophthora sojae 6 柑桔褐腐疫霉Phytopht hora citrophthora 7 荔枝疫霉Phytophthora litchii 8 大雄疫霉Phytopht hora megasperma 9 寄生疫霉Phytopht hora parasitica 10 冬生疫 霉Phytophthora hibernalis 11 丁香疫霉Phytophthora syringae 12 N阴性对照 13 Marker 0019 图2是基于杜鹃根腐病病原菌P pini新检测靶标Ppini 05588设计的特异性引物 在其他卵菌和真菌中的普通PCR特异性验证电泳图 特异性引物上游引物Ppi05588 PCR F1 和下游引物Ppi05588 PCR R1只能从供试的杜鹃根腐病病原菌P pini菌株中特异地扩增出 一条247bp的条 带 而其 余卵菌或真菌未产生目的条 带 0020 图3是实施例3基于杜 鹃根腐病病原菌P pini新检测靶标Ppini 05588设计的检测 说 明 书 2 12 页 4 CN 114457186 A 引物组合的灵敏度验证电泳图 结果显示该引物的检测灵敏度仅能达 到10 0pg L 1 0021 图4是实施例4的实验接种及检测 结果图 其中图4A中1为人工接种琼脂块杜鹃样 品 图4A中2 4为人工接种杜鹃根腐病病原菌P pini的杜鹃 图4B为人工接种杜鹃根腐病病 原菌P pini的发病杜鹃的PCR检测结果图 PCR检测结果图中从左边到右边分别为Marker 1000bp 杜鹃根腐病病原 菌Phytopht hora pini 人工接种杜鹃根腐病病原 菌P pini的杜 鹃 RhododendronsimsiiPlanch 提取的DNA 重复人工接种杜鹃根腐病病原菌P pini的杜 鹃 Rhododendron simsiiPlanch 提取的DNA 重复人工接种杜鹃根腐病病原菌P pini的杜 鹃 Rhododendron simsiiPlanch 提取的DNA 人工接种琼脂块的杜鹃 Rhododendron simsii Planch 提取的DNA NC 阴性对照 Marker 10 00bp 具体实施方式 0022 下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述 以下实施例仅用于 更加清楚地说明本发明的技术方案 因此只是作为示例 而不能以此来限制 本发明的保护 范围 需要注意的是 除非另有说明 本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所 属领域 技 术人员所理解的通常意 义 0023 实施例1 0024 本研究通过Blast序列搜索 序列提取 比对与分析 挖掘大规模的基因组数据库 从而发掘 疫霉菌的检测靶标 通过全基因组比对 共计获得P pini特异性检测靶标1000个 以上 随机从P pini 1000多个特异 性基因中挑选出部分基因作为候选基因 设计了并筛选 特异 性引物 表1列出其中6个靶标基因 表1 采用P CR技术对设计的特异性引物进 行验证 特异性评价选择与P pini不同种 辣椒疫霉 Phytophthora capsici 烟草疫霉 Phytophthora nicotianae 大豆疫霉 Phytophthora sojae 柑桔褐腐疫霉 Phytophthora citrophthora 荔枝疫霉 Phytophthora litchii 大雄疫霉 Phytophthora megasperma 寄生疫霉 Phytophthoraparasitica 冬生疫霉 Phytophthora hibernalis 丁香疫霉 Phytophthora syringae 等 和不同属的菌 Phytopythium litorale Phytopythium helicoides 松脂溃疡菌 Fusarium circinatum 藤仓镰刀菌 Fusariumfujikuroi 葡萄座腔菌 Botryosphaeria dothidea 松材线虫 Bursaphelenchusxylophillus Diaporthepescicole Lasiodiplodiaparva 苹果炭疽 Colletotrichum aenigma 等 的DNA作为模板 进行PCR特 异性和灵敏度验证 最终获得1个杜鹃根腐病病原菌P pini的检测新靶标基因Ppini 05588 0025 表1杜鹃根腐病 病原菌 6个特异性基因序列表 说 明 书 3 12 页 5 CN 114457186 A 0026 说 明 书 4 12 页 6 CN 114457186 A 0027 说 明 书 5 12 页 7 CN 114457186 A 0028 说 明 书 6 12 页 8 CN 114457186 A 0029 说 明 书 7 12 页 9 CN 114457186 A 0030 0031 新靶标基因Ppini 05588其DNA序列如SEQ ID NO 1所示 CDS序列如S EQ ID NO 1 其蛋白序列如SEQ ID NO 2所示 并基于该新靶标建立灵敏 准确的PCR检测技 术体系 0032 该检测技术体系所使用的PCR检测引物组合物 由上游引物Ppi05588PCR F1和下 游引物Ppi0 5588 PCR R1 各引物序列具体如下 0033 Ppi05588PCR F1 CGACGATATG GCAAGATATC 0034 Ppi05588PCR R1 GT TCGCAAAC CTCTCTCGTA 0035 提取待检微生物的DNA 取1 L DNA溶液 加入23 L试剂盒中的检测溶液和1 L灭菌 去离子水 总体积为25 L PCR扩增程序为94 变性3分钟 94 变性30秒钟 58 退火30秒 72 延伸45秒钟 33个循环 最后72 延伸10分钟 其中 所述 mL所述的检测溶液包括 4种 dNTP各2000 M 100 L 10 PCR反应缓冲液 80mM Mg2 100 L 1 B SA 50单位Taq酶 TaKaRa 特异引物Ppi05588 PCR F1和 Ppi05588PCR R120 M引物 加入超纯水制备成1mL 检测溶 液 0036 反应结束后取7 L扩增产物于1 5 琼脂糖凝胶中电泳30min 100V 在凝胶成像 系统上检测并拍照 每 个实验至少重复3次 0037 实施例2 说 明 书 8 12 页 10 CN 114457186 A 0038 为了验证杜鹃根腐病病原菌P pini 的特异性引物序列 本实施例以3株杜鹃根腐 病病原菌P pini菌株和病原卵菌以及其它真菌为供试材料 表2 采用CTAB法提取发病组 织中杜鹃根腐病病原菌P pini的DNA 具体方法如下 取少量菌丝粉 加900 L 2 CTAB提取 液和90 L 10 SDS 漩涡混匀 于60 水浴1h 中间每10min上下颠倒几次 12000rpm离心 10min 取上清加等体积酚 氯仿 异戊醇 2 5 24 1 颠倒混匀 2 000rpm离心10min 将上清 转移至新管 加等体积氯仿 轻轻颠倒混匀 12000rpm离心5min 上清转移至新管中 加2倍 体积的无水乙醇和1 10体积的3M NaAc pH 5 2 20 沉淀 1h 12 000rpm离心10min 倾 去上清 沉淀用70 乙醇洗涤两次 室温晾干 加适量灭菌超纯水或TE pH 8 0 溶解沉淀 含20 g mL RNase 37 处 理1h后 20 保存备用 0039 表 2用于杜鹃根腐病 病原菌P pi ni PCR检测的卵菌和真菌 菌株 说 明 书 9 12 页 11 CN 114457186 A 0040 0041 PCR检测结果如图1 图2所示 杜鹃根腐病病原菌Phytophthora pini菌株均可特 异 地扩增出一条247b p的条带 其余病原卵菌以及真菌琼脂糖凝胶电泳没有 出现扩增条带 选 择与杜鹃根腐病病原 菌Phytopht hora pini不同种 辣椒疫霉 Phytopht hora capsici 说 明 书 10 12 页 12 CN 114457186 A 烟草疫霉 Phytophthora nicotianae 大豆疫霉 Phytophthora sojae 柑桔褐腐疫霉 Phytophthora citrophthora 荔枝疫霉 Phytophthora litchii 大雄疫霉 Phytophthora megasperma 寄生疫霉 Phytophthora parasitica 冬生疫霉 Phytophthora hibernalis 丁香疫霉 Phytophthora syringae 等 和不同属的菌 Phytopythium litorale Phytopythium helicoides 松脂溃疡菌 Fusarium circinatum 藤仓镰刀菌 Fusarium fujikuroi 葡萄座腔菌 Botryosphaeria dothidea 松材线虫 Bursaphelenchus xylophillus Diaporthe pescicole Lasiodiplodia parva 苹果炭疽 Colletotrichum aenigma 等 的DNA作为模板 取1 L DNA溶液 加入23 L试剂盒检测溶液和1 L灭菌去离子水 总 体积为25 L PCR扩增程序为94 变性3分钟 94 变性30秒钟 58 退火30秒 72 延伸45秒钟 33个循环 最后72 延伸 10分钟 0042 证明所设计 的特异性引物上游引物和下游引 物PCR特异性引物具有种的特异性 Ppini 05588是一个特异性较强的新检测 靶标 这说明该引物组可被用于生产 实践中发病 组织中杜 鹃根腐病病原菌的快速可靠的检测鉴定 当用于发病组织中存在杜 鹃根腐病病原 菌时 采用NaOH快速裂解法提取杜鹃根腐病病原菌的DNA 具体过程如下 取一段发病的植 株组织 每毫克组织加入10 L 0 5M NaOH 在研钵中充分研磨后转移至1 5mL的EP管中 12000rpm离心5min 取5 L上清液加入495 L 0 1mM Tris pH 8 0 混匀后取1 L直接用于 PCR反应 每 个反应至少重复三次 同时为确定植株中无PCR抑制物存在 0043 实施例3 0044 用杜鹃根腐病病原菌Phytophthora pini的菌株的不同浓度的基因组DNA作为扩 增模板 进行PCR扩增反应 使用Nanodro 2000微量分光光度计测出实施例1提取DNA的浓度 为100ng L 1 将其依次稀释为10ng L 1 1ng L 1 100pg L 1 10pg L 1 1pg L 1 100fg L 1 10fg L 1 1fg L 1 100ag L 1 根据实施例1 2采用的引物 反应体系 和反应条件 对不同浓度的DNA进行PCR检测 结果如图3所示 25 L的反应体系中分别含有 100ng L 1 10ng L 1 1ng L 1 100pg L 1P pini DNA的出 现247bp特异性阳性条带 呈阳性反应 25 L的反应体系中分别含有10pg L 1 1pg L 1 100fg L 1 10fg L 1 1fg L 1 100ag L 1P pini DNA的未出现特异性条带呈阴性反应 结果表 明PCR检测的 灵敏度达 到10 0pg L 1 图3 0045 实施例4活体组织中杜鹃根腐病 病原菌Phytophthora pini的普通PCR检测 0046 采用NaOH碱裂解法提取接种丁香疫霉菌的发病柑橘组织 的DNA 将其作为模板用 于PCR扩增 取1uL DNA溶液 按实施例2的方法 进行PCR反应 结果如图4所示 其中图 A 1 为人工接种琼脂块的杜鹃叶片 图4A 2 3 为人工接种P pini的感病杜鹃叶片 图4B为人工 接种P pini的发病杜鹃叶片的PCR检测结果 PCR检测结果图中从左边到右边分别为Marker 1000bp P pini 人工接种P pini的杜鹃叶片提取的DNA 重复人工接种P pini的杜鹃叶 片提取的DNA 重复人工接种P pini的杜鹃叶片提取的DNA及人工接种琼脂块的杜鹃叶片提 取的DNA NC 阴性对照 Marker 1000bp 结果显示 P pini菌株及人工接种P pini的杜鹃 叶片提取的DNA均可特异 地扩增出一条2 47bp的条带 而 人工接种琼脂块的杜鹃叶片提取的 DNA及阴性对照没有出现扩增条 带 0047 除非另外具体说明 否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围 在 说 明 书 11 12 页 13 CN 114457186 A 这里示出和描述的所有示例中 除非另有规定 任何具体值应被解释为仅仅是示例性的 而 不是作为限制 因此 示例性实施例的其 他 示例可以具有不同的值 说 明 书 12 12 页 14 CN 114457186 A 序列表 南京林业大 学 南京海关动植物与食品检测中心 杜鹃根腐病 病原菌的特异性检测靶标Ppi ni 05588及应用 202203 19 SIPOSequenceListing 1 0 1 774 DNA 人工序列 ar tificial sequence 1 atggttgctc tctttcaccc attccgccgg ccagaagact tcgatgacga tattcgaaac 60 ggcggccagg ttggttacga gcgatggtgg cgcgatcacg cacctaccgg agctcgtgag 120 tttctgaaat tttctaaaga ttataacatt tcccgagaga tcgcccgcca acggatagac 180 gacgatatgg caagatatcg gggttacatc gagtgctcat cggatgaaga ggcagatggt 240 tctagcatcc tagaaggatc gtcgggtgag gaggaggata tggcatggga cgataactcg 300 tctcaagcag atacggcttt ggtgaagtcc atgacagaac atactcttaa attccagtgg 360 ggtcgtgaag cggttcaatt gtcggctgcg tcaagcgatg taccgttacg agagaggttt 420 gcgaacgttt ctgttccggt agatgacaga gataaagata tcgcagctac tgagagacta 480 cttgccgagc gtgaaactaa gcccgtggcg aatgggacca tgaatctgcc agaagcggaa 540 acaaaagtca tattgctgcg gggcgctatc gcaaactgtg atatttggat ggatccaact 600 ctgattccaa atacctcgag gcccgaattg gggcagcaat catcgctaca agaaatatct 660 caacatttca gtctgaatga aaagcagcac aaagcgtttg tgcgctttgg aaagccattt 720 gtgcgatccc atgcaagcct tggcggggtc ctgggaatct gccgatgccc ttaa 774 2 257 PRT Phytophthora pini 2 Met Val Ala Leu Phe His Pro Phe Arg Arg Pro Glu Asp Phe Asp Asp 1 5 10 15 Asp Ile Arg Asn Gly Gly Gln Val Gly Tyr Glu Arg Trp Trp Arg Asp 20 25 30 His Ala Pro Thr Gly Ala Arg Glu Phe Leu Lys Phe Ser Lys Asp Tyr 35 40 45 Asn Ile Ser Arg Glu Ile Ala Arg Gln Arg Ile Asp Asp Asp Met Ala 50 55 60 Arg Tyr Arg Gly Tyr Ile Glu Cys Ser Ser Asp Glu Glu Ala Asp Gly 序 列 表 1 6 页 15 CN 114457186 A 65 70 75 80 Ser Ser Ile Leu Glu Gly Ser Ser Gly Glu Glu Glu Asp Met Ala Trp 85 90 95 Asp Asp Asn Ser Ser Gln Ala Asp Thr Ala Leu Val Lys Ser Met Thr 100 105 110 Glu His Thr Leu Lys Phe Gln Trp Gly Arg Glu Ala Val Gln Leu Ser 115 120 125 Ala Ala Ser Ser Asp Val Pro Leu Arg Glu Arg Phe Ala Asn Val Ser 130 135 140 Val Pro Val Asp Asp Arg Asp Lys Asp Ile Ala Ala Thr Glu Arg Leu 145 150 155 160 Leu Ala Glu Arg Glu Thr Lys Pro Val Ala Asn Gly Thr Met Asn Leu 165 170 175 Pro Glu Ala Glu Thr Lys Val Ile Leu Leu Arg Gly Ala Ile Ala Asn 180 185 190 Cys Asp Ile Trp Met Asp Pro Thr Leu Ile Pro Asn Thr Ser Arg Pro 195 200 205 Glu Leu Gly Gln Gln Ser Ser Leu Gln Glu Ile Ser Gln His Phe Ser 210 215 220 Leu Asn Glu Lys Gln His Lys Ala Phe Val Arg Phe Gly Lys Pro Phe 225 230 235 240 Val Arg Ser His Ala Ser Leu Gly Gly Val Leu Gly Ile Cys Arg Cys 245 250 255 Pro 3 20 DNA 人工序列 ar tificial sequence 3 cgacgatatg gcaagatatc 20 4 20 DNA 人工序列 ar tificial sequence 4 gttcgcaaac ctctctcgta 20 5 669 DNA 序 列 表 2 6 页 16 CN 114457186 A Phytophthora pini 5 atgaacgagg agtatggtga ccgctttaaa acgcgctcgg attcagtaga cagcgatgag 60 ctgacgcaag tgctgacaga gctgggcgtc gccatggaca aggaagacac cagttcgagt 120 tcgagctacg aggatgacaa ggtcgctgct tccggtggca cgtcttcgca gcgtattgcc 180 aagcccacta gttccccgag ggaggctcca cacctgaccg aaagtacccc 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tagctcgcaa ttacatacac 300 taccagcacc acaggggcaa actcagaacg ctggagagag aagtcgttcc agtactggcg 360 agagctggac gccgcttcaa tcagtacaag gtgcaggcgc agattagata cctgcaaagg 420 atgtacgaca agcacatggc gaccggagga agcctgccag tgtgcttcga gcggttcgaa 480 序 列 表 3 6 页 17 CN 114457186 A ggagcctacg aagtgttccg gagccacgat ttacaccacc aaaagaagcg tcgcggtgcg 540 gaaggctgtt tattccacgc caatcttgac gcagaagcgc ttgctgctgc tgatctgatt 600 ggaatttag 609 9 20 DNA 人工序列 ar tificial sequence 9 gagcctcgcc catataagaa 20 10 20 DNA 人工序列 ar tificial sequence 10 tgcgagctag ccaggttacg 20 11 687 DNA Phytophthora pini 11 atgcgtgcag acgaagtggc agacgaagtg gcagacgaag tggcagacga agtggcagac 60 gaagtggcaa gaacccagga agagatgccg attgtttctc ctgtgcggaa gaaggcacgg 120 atgcagcaag acaagacctg cgcatcaagt tcgcgcctgt tgacaagcga gcaattgagt 180 ttgctggttc agctgaatga ttcatactcg agctatgggc gggctggacg taagtgggca 240 acgatccaaa cccaaatgcg cacgtcctac gctgaactgg atgtgaaacg gagcagtttg 300 agggacatct gcacccgagt gaagaagcag cgcgaaattc gagagctgac gaggtgcagg 360 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