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不同细胞分裂素对鹅毛玉凤花无菌苗一步成苗的影响 邵 丽 上海辰山植物园城市园艺技术研发与推广中心 上海松江 201602 摘 要 为提高鹅毛玉凤花组织培养效率 以种子为外植体 研究3种细胞分裂素6 BA 6 苄氨基腺嘌呤 TDZ 噻苯隆 和KT 激动素 对鹅毛玉凤花种子无菌播种以及萌发后原球茎分化成苗的影响 结果表明 3种分裂素均有利于种子萌发 TDZ促使原 球茎分化成苗的效果最好 能一步成苗的最佳培养基为1 2MS 0 2mg LNAA 1 5mg LTDZ 关键词 鹅毛玉凤花 细胞分裂素 一步成苗 无菌播种 原球茎分化 1 2 1 种子消毒灭菌 将鹅毛玉凤花蒴果用少许洗洁精 轻轻搓洗后 在水流下冲洗30min 在无菌工作台上用 75 酒精浸泡30s 然后用0 1 升汞溶液震荡消毒 10 15min 无菌水冲洗3次 滤纸吸干果荚表面水分 待用 5 1 2 2 种子无菌播种 将已消毒的蒴果在无菌环境剖 开 取出种子并均匀接种在配制好的培养基上 将基础 培养基设为1 2MS 附加0 2mg LNAA 萘乙酸 0 5g L 活性炭 30g L蔗糖 7 5g L琼脂 pH值5 8 6 0 并设置 13个处理组 处理1 12分别添加不同种类不同浓度 梯度的细胞分裂素 分别为0 5mg L 1 0mg L 1 5mg L 2 0mg L的6 BA 0 1mg L 0 5mg L 1 0mg L 1 5mg L的 TDZ 0 2mg L 0 4mg L 0 8mg L 1 6mg L的KT 处理13 为对照组 不添加细胞分裂素 每个处理接种12瓶 每 瓶约100粒种子 培养室温度设置为25 2 光照时 间为12h d 光照强度为2000Lux 6 1 3 数据处理 记录萌发时间并统计萌发率 统计时以形成白色 肉眼可见的原球茎为准 种子萌发率 萌发种子 数量 播种总数 100 7 种子萌发成原球茎30d后 统 计原球茎膨大率 分化率 再过60d统计成苗率 原球 茎膨大率 原球茎膨大数量 萌发原球茎数量 100 分化率 原球茎分化数量 萌发原球茎数 量 100 成苗率 成苗数量 萌发原球茎数量 100 运用SPSS16 0统计分析程序对试验结果进行数 据处理 2 结果与分析 2 1 不同细胞分裂素对鹅毛玉凤花种子无菌萌发的 影响 通过预试验发现 鹅毛玉凤花种子在1 2MS附加 NAA和6 BA的培养基中比MS培养基的萌发率高 且附加6 BA的培养基可使种子萌发后原球茎膨大 叶片分化并直接成苗 仅添加NAA的1 2MS培养基上 的种子可萌发形成白色卵圆形原球茎 但原球茎长时 间不分化直至变成黄褐色 萎缩死亡 而不添加任何生 鹅毛玉凤花 是兰科 玉凤花属地生草本植物 别名双肾参 双肾子 天鹅抱 蛋 对对参等 为 国家 二 级重 点 保护 野 生 植 物 生于海 拔 630 1500m的山坡林下 花期在8 10月 在中国 主要分布于安徽 浙江 江西 福建 台湾 湖北 湖南 广东 广西 四川 贵州 云南 西藏 1 鹅毛玉凤花是珍 贵的药用植物 其块茎可入药 具有补肺肾 利尿等功 能 主治肾虚腰痛 病后体虚 肾虚阳痿 疝气痛 胃痛 肺结核咳嗽 睾丸炎及尿路感染等 2 鹅毛玉凤花野外 资源稀缺 过度采挖 破坏生境可能是其野生种群逐渐 减少的原因 该植物有较高的经济价值 但生长缓慢 繁殖困难 通过自然方式繁殖系数极低 长期 以来 民 间均依靠采挖野生资源作为药用 只挖不栽 造成了资 源的枯竭 而目前有关鹅毛玉凤花组培快繁的相关研 究和报道都较少 陈娅娅等 3 在药用植物鹅毛玉凤花胚 培养的研究中已探讨过其无菌播种的影响因子 萌发 率可达82 本研究针对不同细胞分裂素6 BA 6 苄氨基腺 嘌呤 TDZ 噻苯隆 和KT 激动素 对鹅毛玉凤花种 子无菌播种以及萌发后原球茎分化成苗的影响 4 筛选 出种子萌发后一步成苗的最佳培养基 为大规模人工 快速繁殖建立基础 也为该物种的种群回归 恢复以及 药用经济价值的开发研究提供参考和理论依据 1 材料与方法 1 1 试验材料 选取无病虫害的健康鹅毛玉凤花植株 在开花后 1 3d内花粉活性较强时进行人工授粉 自交授粉1 2 周后 若柱头膨大 花瓣下垂内卷 则授粉成功 鹅毛玉 凤花种子成熟时间较短 2个月后种子成熟 即可采收 果实并播种 若采下后不能及时播种 可将种子干燥保 存于4 冷藏室中 但储存时间不宜过久 最好在10d 内播种 1 2 试验方法 基金项目 上海市科技兴农项目 2021 02 08 00 12 F00778 作者简介 邵丽 1989 女 汉 上海人 绿化工程师 学士 研究方 向 兰科植物快速繁殖和新品种繁育 2022年第13期 现代园艺 试验研究 輥輳訛 5 6 但处理7和处理8的差异不显著 处理组7 8分 别在萌发后40d和45d长根 100d 后苗高为4 5cm 根数1 2根 根长3 4cm KT和6 BA处理组的原球 茎长势无明显规律 其中KT组的原球茎长势相对最 差 成苗率也低 0 5mg L和1 0mg L6 BA有少部分原 球茎也能直接分化成苗 但大量不生长的原球茎变黄 褐色且萎缩死亡 3 炼苗移栽 将长至5cm以上的鹅毛玉凤花 无菌瓶苗转移到温室内炼苗 5 7d 后将无菌苗从培养瓶中取出 冲洗 掉植株上残留的培养基 将幼苗种 植在含树皮 1 3mm 草 炭 兰 石 1 3mm 的介质中 配比为1 2 1 置于温室内遮阴处 光照 3000 5000Lux 室温22 28 保持 湿度60 80 待植株稳定生长后 可进行常规水肥管理 4 讨论 鹅毛玉凤花在野生状态和人工 栽培条件下生长缓慢 且冬季时植 株进入休眠期 只留块茎在地下或盆土中 很难采用其 他兰科植物常用的分株繁殖方式 用植株器官进行组 培也会伤及母株影响生长 而鹅毛玉凤花的种子细小 且胚发育不完全 自然状态下人工播种难以萌发 须借 助共生菌类供给养料 8 因此 利用种子无菌播种的培 养方式即可有效解决繁殖困难 繁殖系数低和周期长 的问题 影响鹅毛玉凤花种子无菌繁殖的因素有多种 如 种子活性 培养环境等 本试验在其他因素都相同的情 况下 仅研究细胞分裂素对其产生的影响 并探讨无菌 长素和细胞分裂素的培养基上 种子萌发率不到 20 因此 生长调节剂对鹅毛玉凤花种子萌发和 原球茎分化成苗有一定促进作用 而不 同 种 类 生 长调 节剂和不同浓度配比对其影响有显著差异 本研究仅探讨不同种类和浓度的细胞分裂素对 其影响 生长素均使用NAA 由表1可知 添加 KT TDZ和6 BA和未添加分裂素的培养基上种 子均能萌发且萌发时间都为10d 未添加分裂素 的培养基上种子萌发率为48 7 显著低于其他 添加了分裂素的培养基 且种子萌发成原球茎后 均停止生长 不分化直至变黄褐色萎缩 不同分 裂素的培养基萌发率有差异但不显著 添加了 KT的处理组萌发率随着浓度增加而先上升后下 降 可见 0 8mg L的KT是适合种子萌发的浓度 添加TDZ和6 BA的处理组中最适合种子萌发 的浓度分别为1 0mg L 和 0 5mg L 萌发率分别为 69 05 和65 56 但萌发率并不随分裂素浓度增加而 有规律的变化 13组处理的原球茎生长都有不同程度 的变黄萎缩 但添加了分裂素的原球茎都有部分膨大 有些甚至能直接分化成苗 而未 添 加分裂素的处理13 种子萌发成原球茎后停止生长并逐渐萎缩死亡 表1 不同细胞分裂素对鹅毛玉凤兰种子萌发的影响 分裂 素 处 理 浓度 mg L 萌发率 萌发时 间 d 原球茎生长情况 KT 1 0 2 54 69 0 09 bc 10 膨大少但不分化 少量变黄褐色且萎缩 2 0 4 56 65 0 06 bc 10 膨大少且分化 少量变黄褐色且萎缩 3 0 8 62 22 0 07 ab 10 膨大少且分化 少量变黄褐色且萎缩 4 1 6 56 87 0 04 bc 10 膨大少但不分化 少量变黄褐色且萎缩 TDZ 5 0 1 65 99 0 06 ab 10 膨大少 分化少 大部分无变化 6 0 5 50 77 0 06 cd 10 膨大多但分化少 大部分无变化 7 1 0 69 05 0 13 a 10 膨大多但分化少 大部分无变化 8 1 5 66 82 0 08 ab 10 膨大多且分化多 大部分无变化 9 0 5 65 56 0 11 ab 10 膨大少 分化少 大量变黄褐色且萎缩 10 1 0 60 32 0 06 abc 10 膨大少 分化少 大量变黄褐色且萎缩 11 1 5 61 56 0 08 abc 10 膨大少 无分化 大量变黄褐色且萎缩 12 2 0 55 70 0 11 bc 10 膨大少 无分化 大量变黄褐色且萎缩 注 表中萌发率为平均值 标准误 同列不同字母表示差异显著 P 0 05 下同 13 48 70 0 04 d 10 无膨大 无分化 无生长且大量变黄褐色萎缩 6 BA 2 2 不同细胞分裂素对原球茎分化成苗的影响 此试验周期为从播种到原球茎分化成苗的100d 表2显示 未添加分裂素的处理13原球茎在试验期间 并无明显生长现象 且逐渐萎缩死亡 添加了分裂素的 原球茎均有部分分化 可见 分裂素在萌发培养基中能 使种子萌发的原球茎一步成苗 分裂素的不同种类和 不同浓度的促进作用也有显著差异 3种分裂素都能 促使原球茎膨大 TDZ处理组在原球茎膨大量 分化量 和成苗量上都为最佳 且随着TDZ浓度的上升 这3 个指标也呈上升趋势 TDZ的处理7 8显著优于处理 表2 不同细胞分裂素对鹅毛玉凤兰原球茎分化的影响 分裂 素 处 理 浓度 mg L 原球茎膨大率 分化率 成苗率 KT 1 0 2 21 60 0 01 bc 0 c 0 b 2 0 4 21 84 0 01 bc 10 56 0 01 bc 10 30 0 01 b 3 0 8 21 72 0 01 bc 10 56 0 01 bc 0 b 4 1 6 20 76 0 01 c 0 c 0 b TDZ 5 0 1 23 54 0 02 bc 10 45 0 01 bc 0 b 6 0 5 29 58 0 02 b 10 89 0 01 bc 0 b 7 1 0 45 96 0 04 a 11 34 0 03 bc 11 01 0 02 ab 8 1 5 48 56 0 03 a 13 30 0 04 a 12 42 0 04 a 9 0 5 24 99 0 02 bc 12 05 0 03 ab 10 26 0 01 b 10 1 0 23 40 0 01 bc 10 60 0 01 bc 10 45 0 01 ab 11 1 5 20 25 0 01 c 0 c 0 b 12 2 0 22 47 0 01 bc 0 c 0 b 13 0 d 0 c 0 b 6 BA 试验研究 现代园艺 2022年第13期 輥輴訛 上接第14页 说不适宜在滁州本地种植 研究表明 6个铁线莲品种当中 王梦 红 色 公 主 紫铃铛 的ETo RC值较高 王梦 的DIo RC参 数值较高 紫铃铛 的Fm Fo Fv Fo和Fm值都很高 红色公主 品种的铁线莲的Fv Fm和Fv Fo数值也是 最大 说明原初潜在光化学最高的是 红色公主 品种 与PiAbs值综合发展一起分析来看 红色公主 相对 于其他5种观赏型铁线莲 对光能的利用能力更强 而 且 它 的光 合 性能 最强 还拥 有足够光合碳同化需要的 能量 铁线莲 红色公主 也会形成更多的光合产物 所 以综合来讲 它是6种铁线莲中最优良的品种 王梦 红色公主 紫铃铛 表现出了良好的生长优势 为 以 后观赏型铁线莲品种的高效优质栽培与良种选择提供 一定的理论基础 收稿 2021 10 22 参考文献 1 TamuraM SystemClematidisAsiaeOreintalis J SciRepOsakaUniv 1955 4 43 55 2 TamuraM Morphology ecologyandphylogenyoftheRanuncu laceae J SciRepOsakaUniv 1967 16 2 21 43 3 TamuraM AclassificationofgenusClematis J ActaPhytotaxGeobot 1987 38 33 44 4 王文采 中国中国毛茛科植物小志 廿二 J 植物分类学报 1998 36 2 150 172 5 牟建梅 张国芹 刘凤军 白菜叶绿素含量的测定方法筛选 J 江苏 农业科学 2014 42 09 289 290 6 万修志 提取测定淡水藻中叶绿素a的方法研究 D 济南 山东建 筑大学 2011 7 张义 李恒 秋季叶喷尿素与磷酸二氢钾对李树叶片衰老相关生理 指标的影响 J 南方农业 2008 2 6 14 15 8 赵明水 刘欣欣 张明如 浙西北15个树种叶片叶绿素含量分析 J 浙江林业科技 2014 34 2 49 52 9 李佳佳 于旭东 蔡泽坪 等 高等植物叶绿素生物合成研究进展 J 分子植物育种 2019 17 18 6013 6019 10 AshrafM HarrisPJC Photosynthesisunderstressfulenvironments An overview J Photosynthetica 2013 51 2 163 190 11 LIXN ASHIHARAH vEffectsofinorganicphosphateonsugar catabolismbysuspensionculturedCatharanthusroseus J Phytochemistry 1990 29 2 497 500 12 LAZRD Thepolyphasicchlorophyl afluorescencerisemeasured underhighintensityofexcitinglight J FunctionalPlantBiology 2006 33 1 9 30 13 童小芹 王淑智 夏咏 等 应用叶绿素荧光技术快速预警乌鲁木齐 典型农作物干旱胁迫 J 干旱区研究 2013 30 5 860 866 14 刘晓晴 常宗强 马亚丽 等 胡杨 异形叶叶绿 素荧光动力学 J 中国沙漠 2014 34 3 704 711 15 李瑞 文 涛 唐艳 萍 等 遮阴对大豆幼苗光合和荧光特性的影响 J 草业学报 2014 23 6 198 206 16 陈辰 何小定 秦金舟 等 4种含笑叶片叶绿素荧光参数Fv Fm特 性的比较 J 安徽农业大学学报 2013 40 1 32 37 17 吴建慧 周蕴薇 戴思兰 两个山茶品种光合荧光参数日变化对春 季低温的响应 J 经济林研究 2012 30 1 40 44 18 任丽娟 何聃 邢鹏 等 湖泊水体细菌多样性及其生态功能研究进 展 J 生物多样性 2013 21 4 421 432 19 张守仁 叶绿素荧光动力学参数的意义及讨论 J 植物学通报 1999 16 4 444 448 20 孙文帅 秦宁 王菲 等 白花丹参和紫花丹参叶绿素荧光日变化比 较研究 J 特产研究 2019 4 1 8 11 21 张珍明 任春光 张玉武 等 施肥处理对青钱柳幼苗叶绿素荧光特 性的影响 J 北方园艺 2016 16 160 164 22 贾浩 郝建博 曹洪波 等 遮荫对 保 佳红 桃树叶片快速叶绿素荧 光诱导动力学曲线的影响 J 西北植物学报 2015 35 9 1861 1867 23 DemmigB BjrkmanO Comparisonoftheeffectofexces sivelight onchlorophyllfluorescence 77K andphotonyieldofO2evolutionin leavesofhigherplants J Planta 1987 171 2 171 184 苗一步成苗的可能性 通常兰花种子到成苗要经过无 菌播种 原球茎分化 生根壮苗和炼苗移栽4个步骤 需要继代培养2 3次 因此 研究鹅毛玉凤花无菌苗 一步成苗需要对培养基中的营养成分和生长调节剂配 比作出调整 1 2MS培养基上的种子萌发率高于MS 说明低盐分培养基更有利于种子萌发 生长素NAA对 种子萌发有一定作用 但萌发后的原球茎无法继续分 化生长 需要转入含分裂素的分化培养基上做继代培 养 细胞分裂素可刺激细胞分裂 促进芽分化和生长 试验结果表明 未添加分裂素的萌发培养基无法做到 一步成苗 在KT TDZ和6 BA中 1 5mg LTDZ对原 球茎直接分化成苗的促进作用最佳 但能够一步成苗 的处理组的成苗率并不高 且同一种培养基上成苗所 耗时间不同 可能是由于生长调节剂浓度配比和培养 条件设置不准确或者需要添加一些营养物质如香蕉 椰青 马铃薯等来促进植株器官组织生长 9 后续还需 通过试验研究其他因素对其影响 探索一步成苗的最 佳方法 鹅毛玉凤花的种子萌发后形成的原球茎可以促使 它直接分化形成完整的植株 也可以进行原球茎的增 殖和丛生苗的诱导 从而获得大量的组培苗 而研究其 一步成苗的方法意在快速得到成年植株 缩短培养周 期 节约人工和培养成本 短期快速提供优质组培苗 为科学研究和大面积栽培奠定基础 10 收稿 2022 02 21 参考文献 1 陈心启 吉占和 罗毅波 中国野生兰科植物彩色图鉴 M 北京 科学 出版社 1999 250 2 陈谦海 贵州植物志 M 贵阳 贵州科技出版社 2004 389 3 陈娅娅 毛堂芬 李奇科 等 药用植物鹅毛玉凤花胚培养的研究 J 种子 Seed 2008 27 2 89 90 4 郑君爽 范义荣 宁惠娟 等 细胞分裂素对杂交兰原球茎生长的影 响 J 江苏农业科学 2011 39 5 234 235 5 陈娅娅 毛堂芬 李奇科 等 药用植物鹅毛玉凤花的组织培养与植 株再生 J 植物生理学通讯 2007 43 6 1136 6 陈娅娅 朱国胜 毛堂芬 等 鹅毛玉凤花内生真菌的初步研究 J 贵 州农业科学 2008 36 3 12 13 7 王思蕲 曹小勇 胡选萍 等 建兰种子萌发的影响因素研究 J 农业 与技术 2020 40 4 26 28 8 陈娅娅 朱国胜 毛堂芬 等 鹅毛玉凤花菌根真菌对鹅毛玉凤花无 菌幼苗生长的影响 J 贵州农业科学 2009 37 12 33 34 9 穆玉珍 朱美瑶 兰花组织培养研究进展 J 现代园艺 2021 1 24 26 10 邹晖 李海明 王伟英 等 白芨无菌小苗一步成苗培养基优化 J 黑 龙江农业科学 2018 7 130 132 2022年第13期 现代园艺 试验研究 輥輵訛