兰州百合枯萎病病原菌鉴定及罹病组织超微结构观察.pdf

植物保护学报Journal of Plant Protection 2022 49 4 1111 1118 DOI 10 13802 ki zwbhxb 2022 2020289 兰州百合枯萎病病原菌鉴定及罹病组织超微结构观察 牟晓玲 1 2 李潇潇 1 师桂英 1 王文珠 1 李谋强 3 张爱菊 4 1 甘肃农业大学园艺学院 兰州730070 2 甘肃农业大学应用技术学院 临洮730500 3 临洮县龙门镇农业农村 综合服务中心 甘肃临洮730500 4 临洮县园艺站 甘肃临洮730500 摘要 为明确引起甘肃省兰州百合主产区百合枯萎病的致病镰孢菌种类 对从百合主产区枯萎病 罹病植株上分离纯化的4株镰孢菌株进行形态学鉴定 分子生物学鉴定以及致病性测定 同时利用 电子显微镜对尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum侵入百合鳞片后的细胞超微结构进行观察 结果表 明 4株镰孢菌菌株经鉴定分别为尖孢镰孢菌 茄病镰孢菌F solani 三线镰孢菌F tricinctum和燕 麦镰孢菌F avenaceum 4株镰孢菌菌株的致病力由强到弱的顺序依次是尖孢镰孢菌 燕麦镰孢菌 茄 病镰孢菌 三线镰孢菌 尖孢镰孢菌侵入后 鳞片细胞壁 细胞质膜和细胞核结构被破坏 细胞核附近出 现大量线粒体 细胞中淀粉粒数量减少 表明尖孢镰孢菌是兰州百合枯萎病防治的重点防控对象 关键词 食用百合 枯萎病 镰孢菌 致病性 细胞超微结构 IdentificationofpathogenscausingFusariumwiltofLanzhoulily andtheobservation ofcellultrastructuresintheinfectedbulbscales Mou Xiaoling 1 2 Li Xiaoxiao 1 Shi Guiying 1 Wang Wenzhu 1 Li Mouqiang 3 Zhang Aiju 4 1 College of Horticulture GansuAgricultural University Lanzhou 730070 Gansu Province China 2 College ofApplied Technology GansuAgricultural University Lintao 730500 Gansu Province China 3 Agriculture and Rural Comprehensive Service Center of Longmen Town Lintao County Lintao 730500 Gansu Province China 4 Lintao County Gardening Station Lintao 730500 Gansu Province China Abstract To clarify Fusarium species causing the wilt disease of Lanzhou lily in the main producing region of Gansu Province four Fusarium strains were isolated and purified from lily with wilt symp toms and morphological characters and molecular sequence analysis as well as pathogenicity test were performed In addition the cell ultrastructures in the lily bulb scales infected by F oxysporum were also observed with electronic microscope The four strains were identified as F oxysporum F solani F tricinctum and F avenaceum respectively The pathogenicity of these strains decreased in the following order F oxysporum F avenaceum F solani F tricinctum The electronic microscope observation re vealed that the cell walls cytoplasmic membranes and nuclei in lily bulb scale were damaged by infec tion of F oxysporum It was also found that lots of mitochondria appeared near the nucleus and plas molysis occurred in the infected cells The sever damages suggested that the prevention and control of Fusarium wilt should have the top priority in the edible Lanzhou lily production region Key words edible lily wilt disease Fusarium pathogenicity cells ultrastructure 兰州百合Lilium davidii var unicolor是中国唯 一的甜百合 是极具地方特色的甘肃名优蔬菜 仅适 宜于甘肃省中部兰州市周边二阴山区种植 狭域分 布 无性繁殖 多年生栽培 连作现象十分普遍 陈艳 华等 2003 兰州百合枯萎病是一种典型的土传病 害 一般于5月下旬左右开始发病 6月雨水多时发 基金项目 国家自然科学基金 31860549 兰州市科技计划项目 2017 4 95 甘肃农业大学学科建设基金 GAU XKJS 2018 05 通信作者 Author for correspondence E mail shigy 收稿日期 2020 11 11 1112 植 物 保 护 学 报 49卷 病程度严重 植株根部腐烂 地上部分黄化 枯萎死 亡 该病害在百合产区普遍发生 是影响连作的重 要因素之一 Wu et al 2015 食用百合是指以鳞茎作为蔬菜的百合类型 在 中国食用百合广为栽培有3个类群 包括兰州百合 宜兴百合和龙芽百合 其中以兰州百合栽培占绝对 主导地位 食用百合栽培面积相对较小 其枯萎病 病原菌研究仅有零星报道 目前分离鉴定的致病菌 主要有尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum 串珠镰孢 菌F moniliforme和茄病镰孢菌F solani和三线镰孢 菌F tricinctum等 李诚和李俊杰 1996 潘其云等 2004 边小荣等 2016 相对而言 观赏百合枯萎病 病原菌研究报道较多 L ffler et al 1995 研究表 明 尖孢镰孢菌为荷兰百合枯萎病的主要病原菌 Prados Ligero et al 2008 首次报道引起西班牙百合 枯萎病的病原菌为尖孢镰孢菌和层出镰孢菌F pro liferatum 镰孢菌形态相似 很难区别同属的不同 种 近年来 PCR扩增病原菌核糖体内转录间隔区 internal transcribed spacer ITS 以及翻译延长因子 translation elongation factor TEF 序列分析等技术 在植物枯萎病病原菌鉴定 检测及病害诊断方面得 到了应用 张凡等 2018 王喜刚等 2020 该技术在 观赏百合枯萎病病原菌尖孢镰孢菌 茄病镰孢菌 三 线镰孢菌 串珠镰孢菌等鉴定方面应用也有报道 杨 秀梅等 2010 Li et al 2013 李琬玥等 2016 另 外 还有关于镰孢菌菌丝侵入罹病组织过程的显微 观察 李琬玥等 2016 以及百合枯萎病抗性分析 杨秀梅等 2012 张艺萍等 2018 等报道 兰州百 合栽培面积小 上述提及的兰州百合致病镰孢菌鉴 定工作均采用传统的形态学鉴定方法 李诚和李俊 杰 1996 镰孢菌种类很多 其种类分布表现出很强的地 域性 刘波等 2013 本课题组于2015年利用鳞片 接种方法对兰州百合主产区枯萎病进行了病原菌研 究 边小荣等 2016 然而在实际生产中 百合枯萎 病发生时 其典型症状表现为植株根部腐烂 地上部 黄化 最终枯萎死亡 因此 利用植株接种试验来确 定镰孢菌的致病性非常必要 植株水平的致病性鉴 定存在鉴定周期长 植株发病症状复杂 病情分级存 在一定难度 该方面在兰州百合上还未见文献报 道 鉴于此 本研究在前期工作的基础上 利用ITS 序列分析技术以及TEF序列分析技术 结合形态学 鉴定方法对该病原真菌种类进行鉴定 同时进行致 病性测定和病原菌侵入寄主体内的电子显微观察 以期明确各成员的致病性差异和镰孢菌在寄主亚细 胞层次的致病生理 为兰州百合土传病害的综合治 理提供依据 1 材料与方法 1 1 材料 供试菌种及植物 本课题前期利用鳞片接种致 病性测定及形态学方法鉴定获得的4株镰孢菌菌株 为供试病原菌 供试百合品种为兰百1号 由甘肃 农业大学食用百合试验基地提供 选择无病虫 质量 为25 g左右种球用于致病性测定 培养基 马铃薯蔗糖琼脂 potato sucrose agar PSA 培养基成分为去皮马铃薯200 g 蔗糖20 g 琼 脂20 g 水1 000 mL pH为自然值 马铃薯葡萄糖 液体 potato dextrose broth PDB 培养基成分为去 皮马铃薯200 g 葡萄糖20 g 水1 000 mL pH为 自然值 试剂及仪器 SolarbioD2300 50T真菌基因组 DNA提取试剂盒 北京索来宝科技有限公司 其他 试剂均为国内分析纯 GNP 9160恒温培养箱 上海 精宏实验设备有限公司 TS 200B恒温培养摇床 上 海科辰实验设备有限公司 RDN 300E 4人工气候 箱 宁波东南仪器有限公司 JEM 1230型透射电子 显微镜 日本电子株式会社 TC96G H bB PCR仪 杭州博日科技股份有限公司 TC DYCP 31DN琼脂 糖水平电泳槽 Imager 600UV凝胶成像系统 美国 Amersham公司 1 2 方法 1 2 1 镰孢菌的分子鉴定 利用真菌基因组抽提试剂盒提取4株菌株的 DNA 本研究采用镰孢菌种水平鉴定的专用引物 EF 1 F 5 ATGGGTAAGGA A G GACAAGAC 3 和EF 2 R 5 GGA G A GTACCAGT G C ATCA TGTT 3 O Donnell et al 1998 进行序列分析 引 物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成 以真 菌DNA作模板进行PCR扩增 PCR扩增反应体 系 模板DNA1 L 10 Buffer 含Mg 2 2 5 L dNTP 1 L Taq酶0 2 L 上下游引物各0 5 L ddH 2 O加至 25 L PCR反应程序为 94 预变性4 min 94 变 性45 s 55 退火45 s 72 延伸1 min 30个循环 最后72 延伸10 min 4 保存 扩增产物经1 琼 脂糖凝胶电泳 回收 纯化500 bp左右的主带 送南 京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定 测序结 果在NCBI https www ncbi nlm nih gov 数据库中 4期 牟晓玲等 兰州百合枯萎病病原菌鉴定及罹病组织超微结构观察 1113 进行BLAST比对分析 利用MEGA 7 0 26软件采 用邻接法构建系统发育树 重复500次 1 2 2 病原菌的形态学鉴定 参考方中达 1998 方法并加以改良进行接种及 病原菌鉴定 将4株病原菌株分别接种于PDB培养 基上 每个锥形瓶100 mL培养基 培养7 d后打取并 接种15块直径为5 mm的菌饼 于恒温培养摇床上 于28 120 r min培养7 d 然后收集培养物 用无 菌水稀释 得到浓度为10 7 个 mL的孢子悬浮液用 于接种 选用直径8 cm 高10 cm且装有基质 蛭 石 珍珠岩 3 1 的营养钵进行栽培 高温蒸汽基质 灭菌 选用周径为14 16 cm兰州百合种球播种 待 90 植株株高达到10 cm时接种 采用浸根 刺伤 和灌根相结合的方法进行接种 将百合植株剪去约 0 5 1 cm根尖 将鳞茎与根部在菌液中浸泡30 min 然后选3个不同部位 用针头刺伤鳞茎刺伤 深度1 2 mm 刺伤后重新播种于营养钵中 然后每钵用 10 mL同浓度的菌液灌根 5 d后等量灌根1次 直 至首株植株开始发病 停止灌根 将处理好的植 株放置于人工气候箱中 于25 相对湿度85 12 h光暗交替条件下培养 植株接种后7 10d开始 发病 将植株发病组织剪成约0 5 cm 0 5 cm的小块 消毒后接种于PSA培养基上 置于25 12 h光暗交 替条件下培养10 d 观察菌落性状 孢子形态 测定 菌落直径 从培养物上挑取少许菌丝 制成简易装 片 进行病原菌鉴定 在显微镜下观察了分生孢子 和厚垣孢子的形态 大小 每种镰孢菌观察10个 以上视野 观察的分生孢子100个以上 厚垣孢子 40个以上 形态学鉴定参考 镰孢菌属 Booth 1988 真 菌鉴定手册 魏景超 1979 以及 植物病原学 张 中义 1986 等分类文献 同时参照Gerlach 2 3 4 represent the Fusarium strains F1 F2 F3 F4 respectively 图1 4株镰孢菌株的PCR扩增结果 A 及基于TEF扩增序列构建代表菌株及其相似菌株的系统发育树 B Fig 1 PCR results of four Fusarium strains A and phylogenetic tree of representative strains and the related strains based on TEF gene sequences B 2 2 病原菌的形态学鉴定 4株菌株接种后均可诱导植株发病 并且其发 病症状相似 病原菌侵染植株后按照叶尖到叶基 下部叶到上部叶的顺序逐渐发黄 变褐 枯萎 且从 叶缘两侧向下卷曲 地上茎茎尖首先发黄 继而由上 及下 茎秆渐渐变成褐色 干枯 最终整株植株变褐 枯萎死亡 地下部鳞茎盘变褐 根系腐烂 发病严 重的整株死亡 图2 A 对照 B E 分别表示接种后叶片1 3叶发黄 干枯 1 2叶发黄 干枯 2 3叶发黄 干枯 全株叶发黄 植株死亡 A CK B E leaves became yellow on 1 3 1 2 2 3 totally of areas respectively and finally became dry and wilt after infection 图2 兰州百合植株接种镰孢菌后的发病症状 Fig 2 Symptoms on Lanzhou lily artificially inoculated with Fusarium 从植株发病组织分离培养的4种病原菌 菌落 边缘均整齐 病原菌菌落背面颜色均呈红色至深红 色 正面颜色均为白色 病原菌气生菌丝均为白色 图3 4株镰孢菌菌株均可产生大型分生孢子 小 型分生孢子和厚垣孢子 孢子形态各异 F1菌株大 型分生孢子镰孢形 弯曲 两头稍尖 无色 3 5隔 大小为10 98 50 65 m 2 11 6 69 m 小型分生孢子 为椭圆形 单胞 少数双胞 大小为6 59 13 58 m 2 00 4 90 m 厚垣孢子近圆形 6 87 8 26 m 4 51 7 89 m F2菌株大型分生孢子呈茄形 稍弯 4期 牟晓玲等 兰州百合枯萎病病原菌鉴定及罹病组织超微结构观察 1115 曲 两端稍圆钝 无色 3 5隔 大小为11 16 38 53 m 2 11 5 57 m 小型分生孢子椭圆形 单胞 大小为 5 13 13 36 m 1 74 5 38 m 厚垣孢子近圆形 单 胞 大小为7 10 27 99 m 4 48 10 33 m F3菌株 大型分生孢子镰孢形 弯曲 1 2隔 大小为11 21 31 01 m 1 49 7 82 m 小型分生孢子椭圆形 单 胞 大小为3 71 8 91 m 1 14 3 41 m 厚垣孢子近 圆形 大小为8 03 16 96 m 5 93 12 82 m F4菌 株大型分生孢子镰孢形 略弯曲 3 5隔 大小为 11 35 35 29 m 2 20 4 37 m 小型分生孢子椭圆 形 0 1隔 大小为4 70 10 03 m 1 30 3 89 m 厚 垣孢子椭圆形 大小为9 26 25 38 m 4 70 8 53 m 依据形态特点 结合分子生物学鉴定结果 最终将 F1 F2 F3和F4菌株分别鉴定为尖孢镰孢菌 茄病 镰孢菌 三线镰孢菌和燕麦镰孢菌 F1 F2 F3和F4 菌株在GenBank中对应的序列登记号分别为Seq ID1MT292552 SeqID2MT292553 SeqID3MT292 554和SeqID4MT292555 A B C D分别代表从病组织上分离鉴定的尖孢镰孢菌 茄病镰孢菌 三线镰孢菌和燕麦镰孢菌 1 2分别代表菌落 的背面和正面 A B C D represent the morphology of F oxysporum F solani F tricinctum F avenaceum isolated after artificial inoculations respectively 1 and 2 represent fugal colonies morphology at back and front respectively 图3 兰州百合植株人工接种后从发病组织再分离培养得到的4种镰孢菌形态特征 Fig 3 Colony morphology of four Fusarium strains reisolated from diseased bulb scale tissues of Lanzhou lily after artificial inoculation 2 3 病原菌致病力的测定 鳞片接菌后 鳞片顶端 侧方及基部产生褐色病 斑 进而逐渐形成腐烂现象 与无刺伤处理相比较 刺伤处理显著提高了发病率及病情指数 刺伤处理 后发病率均为100 无刺伤处理发病率介于11 22 之间 尖孢镰孢菌处理的病情指数在刺伤处理 与无刺伤处理2种情况下均最高 其余3个处理病情 指数排列次序有所不同 各菌株在致病性与鳞片水 平上的致病性存在一定差异 燕麦镰孢菌处理的发 病率最高 尖孢镰孢菌处理的病情指数最高 4株 镰孢菌株的致病力由强到弱依次为尖孢镰孢菌 燕 麦镰孢菌 茄病镰孢菌 三线镰孢菌 表1 2 4 病原菌侵入寄主体内的电镜显微观察 电镜显微观察揭示了镰孢菌入侵细胞后细胞超 微结构的变化 图4 与对照 图4 J 相比 百合鳞 片罹病组织细胞中出现大量黑色 高致密度小颗粒 图4 A 细胞壁出现大量褶皱 图4 B 并逐渐被 破坏 细胞发生明显的质壁分离现象 图4 C 淀粉 粒数量减少 图4 D 细胞核结构受到严重地破坏 核膜模糊 不完整 细胞核呈不规则状 细胞核附近 出现大量线粒体 图4 E 细胞中出现大量的疑似 内质网的结构 图4 F 细胞质膜被破坏 图4 G 细胞质膜内侧边缘出现大量黑色 扁椭圆体状 高致 密度颗粒 图4 H 疑似白色体 1116 植 物 保 护 学 报 49卷 表1 兰州百合鳞片及植株人工接种4种镰孢菌的发病率和病情指数 Table 1 The morbidity and disease index of Lanzhou lily inoculated with four Fusarium species 菌株Strain 尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum 茄病镰孢菌F solani 三线镰孢菌F tricinctum 燕麦镰孢菌F avenaceum 对照CK 鳞片发病率Morbidity 刺伤后接种 Scales inocula tion after piercing 100 00 0 00 a 100 00 0 00 a 100 00 0 00 a 100 00 0 00 a 0 00 0 00 b 无刺伤接种 Scales inocula tion without piercing 22 22 0 29 a 22 22 0 34 a 11 11 0 19 b 11 11 0 08 b 0 00 0 00 c 鳞片病情指数Disease index 刺伤后接种 Scales inocula tion after piercing 38 89 0 78 a 25 93 3 21 c 31 48 0 72 b 33 33 0 45 b 0 00 0 00 d 无刺伤接种 Scales inocula tion without piercing 3 71 0 17 a 3 71 0 09 a 1 85 0 04 b 1 85 0 04 b 0 00 0 00 c 植株发病率 Morbidity 96 30 0 61 c 82 14 0 24 d 96 67 0 39 b 100 00 0 46 a 0 00 0 00 e 植株病情指数 Disease index 57 41 0 30 a 51 79 0 03 c 35 82 0 15 d 56 25 0 23 b 0 00 0 00 e 表中数据为平均数 标准误 同列不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P 0 05水平差异显著 Data are mean SE Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at P 0 05 by Duncan s new multiple range test A 细胞中出现大量黑色 高致密度小颗粒 8 000 B 细胞壁出现大量褶皱 10 000 C 细胞发生严重的质壁分离 现象 12 000 D 细胞中的淀粉粒数量减少 3 000 E 细胞核的结构受到严重地破坏 核膜模糊 不完整 细胞核 呈不规则状 细胞核附近出现大量线粒体 25 000 F 细胞中出现大量的疑似内质网的结构 20 000 G 细胞质膜 被破坏 5 000 H 细胞质膜内侧边缘出现大量黑色 扁椭圆体状 高致密度颗粒 疑似白色体 10 000 I 细胞质 膜被破坏 8 000 J 对照细胞 8 000 A Alarge number of black high density particles appeared in the cell 8 000 B a large number of folds appeared in the cell wall 10 000 C plasmolysis occurred in the cells 12 000 D the number of starch grains decreased 3 000 E the seriously damaged nucleus structure in which the nuclear membrane become fuzzy and incomplete the nucleus become irregular and lots of mitochondria appeared near the nucleus 25 000 F a large number of suspected endoplasmic reticulum appear 20 000 G the cytoplasmic membrane was destroyed 5 000 H a large number of black and oblate ellipsoidal and highly density particles appeared at the inner edge of the cytoplasmic mem brane which were suspected as leucoplasts 10 000 I the cytoplasmic membrane was destroyed 8 000 J cell in CK 8 000 图4 尖孢镰孢菌侵入后百合鳞片细胞超微结构的变化 Fig 4 Changes of lily scale cells ultrastructure after invasion by Fusarium oxysporum 3 讨论 病原菌鉴定主要采用形态学鉴定 随着分子生 物学发展 基因序列相似性和系统发育分析逐渐作 为真菌分类的重要补充依据 本研究以形态学 鉴定结果为依据 参考TEF分子生物学鉴定结果 证明4株镰孢菌菌株分别为尖孢镰孢菌 茄病镰孢 菌 三线镰孢菌和燕麦镰孢菌 与观赏百合相比 兰州百合株型小而紧凑 叶面积小 盛花期单叶面 积2 cm 2 师桂英等 2020 观赏百合植株水平上枯 4期 牟晓玲等 兰州百合枯萎病病原菌鉴定及罹病组织超微结构观察 1117 萎病分级标准 杨秀梅等 2010 郑思乡等 2014 并 不适合兰州百合 本研究首次制订了镰孢菌人工接 种后植株水平上枯萎病分级标准 利用该鉴定标准 对4种病原菌致病性进行了比较 发现与鳞片水平 上的人工接种鉴定结果有一定差异 由此说明了兰 州百合植株水平上人工接种镰孢菌进行致病性鉴定 的必要性和重要性 尖孢镰孢菌是国内外最为广泛 报道 Loffler et al 1995 李诚和李俊杰 1996 李琬 玥等 2016 的百合枯萎病致病镰孢菌类群 以尖孢 镰孢菌作为致病菌 研究学者们开展了百合种质资 源对枯萎病的抗性鉴定以及病原性连作障碍机理研 究工作 杨秀梅等 2010 2012 Wu et al 2015 本 研究结果显示 供试的4株镰孢菌菌株致病力由强 到弱的顺序依次是尖孢镰孢菌 燕麦镰孢菌 茄病镰 孢菌 三线镰孢菌 据此分析 尖孢镰孢菌是甘肃兰 州百合主产区重点防控对象 而燕麦镰孢菌作为百 合枯萎病致病镰孢菌类群 属于首次报道 镰孢菌的生化致病机制非常复杂 有多种细胞 壁降解酶和毒素参与 董章勇和王振中 2012 胡长 志等 2016 细胞壁降解酶主要是降解寄主植物的 细胞壁 从而利于病原真菌的侵入 定殖与扩展 董 章勇和王振中 2012 本研究结果显示 尖孢镰孢 菌通过破坏细胞壁 细胞质膜的结构 侵染到细胞内 部结构 进一步对寄主植物进行破坏 导致细胞核结 构不完整 细胞大量失水而发生严重的质壁分离现 象 O Donnell et al 1998 研究表明 病原菌侵染植 物后能迅速引起寄主组织的生理生化变化 寄主组 织呼吸强度迅速上升 呼吸产生的能量用于合成寄 主组织对病原菌侵染的抵抗和平衡自身代谢时需要 的各种代谢物质 本研究结果显示 镰孢菌入侵细 胞 细胞核结构受到严重破坏 核膜模糊 不完整 细 胞核呈不规则状 细胞核附近出现大量线粒体 细胞 中淀粉粒数量减少 大量线粒体的出现与淀粉粒数 量减少均与罹病细胞呼吸强度迅速上升有关 杨秀 梅等 2010 采用石蜡切片 苯胺兰染色 荧光显微镜 下蓝光激发等技术 在细胞水平上研究了罹病百合 中镰孢菌菌丝在鳞茎和根部的侵染过程 发现菌丝 在细胞间隙扩展 集聚于细胞与细胞之间 被菌丝包 围的细胞中淀粉粒明显减少 细胞开始变形 这与 本研究结果类似 在百合鳞片感病细胞中出现大量 的疑似内质网及疑似白色体结构 内质网具有承担 细胞内物质运输的作用 白色体具有贮藏淀粉 蛋白 质及油脂的功能 二者的出现可能与感病细胞呼吸 强度增加 物质代谢加快有关 本研究对百合健康 鳞片和罹病鳞片所进行的电镜显微观察结果为揭示 镰孢菌的致病生理提供了依据 细胞核是遗传物质 存在的场所 百合感病细胞细胞核结构遭到严重破 坏的病理学意义需要深入研究 参 考 文 献 References Bian XR Shi GY Liang QL Sun HQ Fan SF Chen JL 2016 Isola tion and identification of wilt disease pathogen from Lanzhou lily and its 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