土壤病原微生物检测技术研究进展.pdf

农 业 环 境 科 学 学 报 J o u r n a l o f A g r o E n v i r o n m e n t S c i e n c e 2 0 2 2 4 1 1 2 2 5 9 3 2 6 0 3 2 0 2 2 年 1 2 月 徐 菲 杨 凯 朱 龙 吉 等 土 壤 病 原 微 生 物 检 测 技 术 研 究 进 展 J 农 业 环 境 科 学 学 报 2 0 2 2 4 1 1 2 2 5 9 3 2 6 0 3 X U F Y A N G K Z H U L J e t a l A d v a n c e s i n t h e d e t e c t i o n t e c h n o l o g y o f p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s i n s o i l J J o u r n a l o f A g r o E n v i r o n m e n t S c i e n c e 2 0 2 2 4 1 1 2 2 5 9 3 2 6 0 3 开 放 科 学 O S I D 土 壤 病 原 微 生 物 检 测 技 术 研 究 进 展 徐 菲 1 2 3 杨 凯 1 朱 龙 吉 1 林 文 芳 1 崔 丽 1 1 中 国 科 学 院 城 市 环 境 研 究 所 福 建 省 流 域 生 态 重 点 实 验 室 福 建 厦 门 3 6 1 0 2 1 2 中 国 科 学 院 大 学 北 京 1 0 0 0 4 9 3 福 建 农 林 大 学 资 源 与 环 境 学 院 福 州 3 5 0 0 0 2 A d v a n c e s i n t h e d e t e c t i o n t e c h n o l o g y o f p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s i n s o i l X U F e i 1 2 3 Y A N G K a i 1 Z H U L o n g j i 1 L I N W e n f a n g 1 C U I L i 1 1 F u j i a n K e y L a b o r a t o r y o f W a t e r s h e d E c o l o g y I n s t i t u t e o f U r b a n E n v i r o n m e n t C h i n e s e A c a d e m y o f S c i e n c e s X i a m e n 3 6 1 0 2 1 C h i n a 2 U n i v e r s i t y o f C h i n e s e A c a d e m y o f S c i e n c e s B e i j i n g 1 0 0 0 4 9 C h i n a 3 C o l l e g e o f R e s o u r c e s a n d E n v i r o n m e n t F u j i a n A g r i c u l t u r e a n d F o r e s t r y U n i v e r s i t y F u z h o u 3 5 0 0 0 2 C h i n a A b s t r a c t P a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s e g b a c t e r i a v i r u s e s a n d f u n g i a r e u b i q u i t o u s i n s o i l e n v i r o n m e n t s t h r e a t e n i n g g l o b a l p u b l i c h e a l t h T h e d e v e l o p m e n t o f a r a p i d d e t e c t i o n t e c h n o l o g y f o r e n v i r o n m e n t a l p a t h o g e n s i s o f g r e a t s i g n i f i c a n c e t o r e d u c e t h e s p r e a d o f p a t h o g e n s p r e v e n t a n d c o n t r o l i n f e c t i o u s d i s e a s e s a n d m a i n t a i n b i o s e c u r i t y T h i s a r t i c l e r e v i e w e d t h e r e c e n t l y d e v e l o p e d a n d s t a t e o f t h e a r t t e c h n i q u e s f o r d e t e c t i n g p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s i n c l u d i n g c h r o m o g e n i c c u l t i v a t i o n m a t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n t i m e o f f l i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y m o l e c u l a r b i o l o g y t o o l s R a m a n s p e c t r o s c o p y f l o w c y t o m e t r y a n d b i o s e n s o r s A c o m p r e h e n s i v e o v e r v i e w a n d c o m p a r i s o n o f t h e p r i n c i p l e s a p p l i c a t i o n s a d v a n t a g e s a n d d i s a d v a n t a g e s o f t h e p r e s e n t e d t e c h n i q u e s w e r e s h o w n F i n a l l y w e p u t f o r w a r d i m p o r t a n t p e r s p e c t i v e s f o r t h e f u t u r e d e v e l o p m e n t o f r a p i d d e t e c t i o n m e t h o d s a i m i n g t o p r o m o t e r a p i d d i a g n o s i s o f s o i l p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s a n d p r o v i d e g u i d a n c e f o r t h e c o n t r o l o f b i o l o g i c a l r i s k s K e y w o r d s b i o s a f e t y a n d b i o s e c u r i t y s o i l p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m r a p i d d e t e c t i o n t e c h n i q u e m o l e c u l a r b i o l o g y t o o l R a m a n s p e c t r o s c o p y 收 稿 日 期 2 0 2 2 1 0 1 1 录 用 日 期 2 0 2 2 1 1 0 3 作 者 简 介 徐 菲 1 9 9 8 女 河 北 衡 水 人 硕 士 研 究 生 从 事 环 境 病 原 微 生 物 快 速 检 测 研 究 E m a i l f x u i u e a c c n 杨 凯 与 徐 菲 同 等 贡 献 通 信 作 者 崔 丽 E m a i l l c u i i u e a c c n 基 金 项 目 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 2 1 9 2 2 6 0 8 2 2 1 7 6 1 8 6 中 科 院 从 0 到 1 原 始 创 新 项 目 Z D B S L Y D Q C 0 2 7 福 建 省 自 然 科 学 基 金 项 目 2 0 2 2 J 0 5 0 9 5 P r o j e c t s u p p o r t e d T h e N a t i o n a l N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f C h i n a 2 1 9 2 2 6 0 8 2 2 1 7 6 1 8 6 C h i n e s e A c a d e m y o f S c i e n c e s Z D B S L Y D Q C 0 2 7 T h e N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f F u j i a n P r o v i n c e C h i n a 2 0 2 2 J 0 5 0 9 5 摘 要 病 原 微 生 物 如 细 菌 病 毒 真 菌 等 广 泛 存 在 于 土 壤 环 境 中 其 严 重 威 胁 着 全 球 公 共 卫 生 安 全 发 展 病 原 微 生 物 快 速 检 测 技 术 对 于 减 少 病 原 菌 扩 散 传 播 防 控 传 染 性 疾 病 维 护 生 物 安 全 具 有 重 要 意 义 本 文 对 病 原 微 生 物 检 测 技 术 的 最 新 研 究 进 展 进 行 了 综 述 包 括 显 色 培 养 技 术 基 质 辅 助 激 光 解 吸 电 离 飞 行 时 间 质 谱 分 子 生 物 学 技 术 拉 曼 光 谱 技 术 流 式 细 胞 技 术 和 生 物 传 感 器 等 并 对 其 原 理 应 用 及 优 缺 点 进 行 了 全 面 比 较 最 后 对 病 原 微 生 物 检 测 技 术 的 未 来 发 展 提 出 展 望 旨 在 促 进 土 壤 环 境 病 原 微 生 物 的 快 速 检 测 和 生 物 风 险 防 控 关 键 词 生 物 安 全 土 壤 病 原 微 生 物 快 速 检 测 技 术 分 子 生 物 学 技 术 拉 曼 光 谱 中 图 分 类 号 R 1 2 4 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1 6 7 2 2 0 4 3 2 0 2 2 1 2 2 5 9 3 1 1 d o i 1 0 1 1 6 5 4 j a e s 2 0 2 2 1 0 1 2农 业 环 境 科 学 学 报 第 4 1 卷 第 1 2 期 随 着 新 型 冠 状 病 毒 肺 炎 C O V I D 1 9 疫 情 的 全 球 蔓 延 由 病 原 微 生 物 引 起 的 生 物 安 全 受 到 了 全 球 的 关 注 病 原 微 生 物 是 长 期 引 起 人 类 传 染 性 疾 病 的 罪 魁 祸 首 严 重 威 胁 着 公 共 健 康 安 全 为 了 有 效 防 控 病 原 微 生 物 的 威 胁 生 物 安 全 被 提 到 了 国 家 安 全 战 略 的 层 面 2 0 2 0 年 1 0 月 1 7 日 通 过 的 中 华 人 民 共 和 国 生 物 安 全 法 为 维 护 国 家 安 全 防 范 和 应 对 生 物 安 全 风 险 保障人民生命健康 提供了法律准则 另外 我国国家 卫 生 计 生 委 早 在 2 0 1 7 年 就 组 织 制 定 了 国 家 致 病 菌 识 别网工作实施方案 明确提出要通过加强国家致病菌 识 别 网 建 设 建 立 并 不 断 完 善 适 合 我 国 国 情 的 细 菌 性 传 染 病 监 测 模 式 推 进 细 菌 性 传 染 病 监 测 预 警 新 技 术 和策略应用 从而提高疫情发现和防控能力 土 壤 中 栖 息 着 地 球 上 最 多 样 和 最 复 杂 的 微 生 物 群 落 1 是 病 原 微 生 物 赋 存 和 大 规 模 传 播 的 主 要 媒 介 之 一 并 且 土 壤 可 耦 合 空 气 和 水 体 等 媒 介 使 得 土 壤 病 原 微 生 物 对 植 物 动 物 和 人 类 的 健 康 产 生 直 接 或 间 接 的 影 响 图 1 土 壤 环 境 中 的 病 原 微 生 物 种 类 多 来 源 广 风 险 异 质 性 高 传 播 方 式 复 杂 多 变 可 通 过 环 境 介 质 在 全 球 进 行 传 播 造 成 全 球 性 大 流 行 病 2 4 例 如 土 壤 中 广 泛 存 在 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 炭 疽 杆 菌 大 肠 杆 菌 O 1 5 7 H 7 军 团 菌 诺 卡 氏 菌 等 病 原 细 菌 5 并 且 其 中 许 多 病 原 微 生 物 具 有 多 重 抗 生 素 耐 药 性 除 细 菌 外 土 壤 中 还 生 存 着 3 0 0 多 种 可 感 染 人 类 和 植 物 的 真 菌 1 对 土 壤 病 原 微 生 物 进 行 快 速 监 测 是 控 制 其 传 播 的 关 键 为 提 高 病 原 微 生 物 的 检 测 能 力 有 必 要 发 展 快 速 甚 至 实 时 灵 敏 准 确 的 检 测 技 术 以 便 快 速 发 现 和 定 位 环 境 介 质 中 的 病 原 微 生 物 采 取 适 当 措 施 实 施 精 准 消 杀 及 时 有 效 阻 控 病 原 微 生 物 的 传 播 6 7 保 障 生 命 健 康 安 全 为 此 本 文 综 述 了 新 近 发 展 的 多 种 环 境 病 原 微 生 物 检 测 技 术 根 据 其 是 否 依 赖 培 养 划 分 为 两 大 类 并 进 一 步 根 据 其 检 测 信 息 基 因 型 或 表 型 和 原 理 分 成 6 类 图 2 包 括 显 色 培 养 技 术 基 质 辅 助 激 光 解 吸 电 离 飞 行 时 间 质 谱 技 术 分 子 生 物 学 技 术 拉 曼 光 谱 技 术 流 式 细 胞 技 术 和 生 物 传 感 器 本 文 对 这 些 病 原 微 生 物 检 测 技 术 进 行 了 详 细 总 结 和 对 比 并 进 一 步 对 未 来 病 原 微 生 物 检 测 技 术 的 发 展 提 出 展 望 旨 在 为 土 壤 环 境 病 原 微 生 物 的 快 速 检 测 和 防 控 提 供 技 术 指 导 保 障 生 物 安 全 1 基 于 培 养 的 病 原 菌 检 测 技 术 1 1 显 色 培 养 技 术 显 色 培 养 技 术 的 原 理 是 利 用 微 生 物 生 长 繁 殖 过 程 中 自 身 代 谢 产 生 的 酶 与 相 应 显 色 底 物 反 应 显 色 从 而 对 目 标 微 生 物 进 行 鉴 定 该 技 术 可 直 接 对 临 床 和 环 境 中 病 原 微 生 物 或 者 混 有 多 种 微 生 物 的 样 本 进 行 检 测 培 养 时 长 约 为 1 8 2 4 h 现 已 成 功 用 于 水 体 8 以 及 临 床 9 中 病 原 微 生 物 的 检 测 目 前 常 用 的 主 要 有 大 肠 杆 菌 O 1 5 7 H 7 金 黄 色 葡 萄 球 菌 李 斯 特 菌 沙 门 氏 菌 等 显 色 培 养 基 该 技 术 可 对 病 原 微 生 物 进 行 粗 筛 和 分 离 其 灵 敏 度 和 特 异 性 优 于 传 统 培 养 基 但 由 于 环 境 复 杂 干 扰 较 大 显 色 培 养 技 术 存 在 一 定 程 度 的 误 判 其 准 确 性 需 要 借 助 其 他 技 术 进 行 进 一 步 确 认 1 2 基 质 辅 助 激 光 解 吸 电 离 飞 行 时 间 质 谱 技 术 除 显 色 培 养 基 以 外 基 于 培 养 的 基 质 辅 助 激 光 解 吸 电 离 飞 行 时 间 质 谱 M A L D I T O F M S 也 被 广 泛 用 于 病 原 微 生 物 的 快 速 检 测 M A L D I T O F M S 是 近 年 来 兴 起 的 基 于 不 同 细 菌 特 征 蛋 白 指 纹 图 谱 的 检 测 技 术 通 过 对 微 生 物 菌 落 进 行 检 测 并 与 数 据 库 中 已 知 病 原 菌 信 息 比 对 来 实 现 病 原 微 生 物 的 快 速 诊 断 该 技 术 具 有 高 通 量 快 速 准 确 流 程 简 单 等 特 点 已 成 功 应 用 于 植 物 1 0 临 床 1 1 病 原 微 生 物 及 其 耐 药 性 的 相 关 研 究 中 这 两 种 依 赖 培 养 的 方 法 虽 已 实 现 对 病 原 微 生 物 的 检 测 但 是 局 限 性 在 于 无 法 对 V B N C V i a b l e B u t N o n c u l t u r a b l e 状 态 的 病 原 菌 或 者 环 境 中 未 培 养 的 微 生 物 开 展 研 究 1 2 并 且 需 要 对 病 原 微 生 物 进 行 培 养 比 较 费 时 为 了 更 好 地 实 现 环 境 中 病 原 微 生 物 的 快 速 和 准 确鉴别 近年来发展出一些不依赖于培养的技术 这些 图 1 土 壤 空 气 水 体 植 物 动 物 和 人 类 病 原 微 生 物 之 间 的 联 系 F i g u r e 1 L i n k b e t w e e n s o i l a i r w a t e r p l a n t a n i m a l a n d h u m a n p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s 2 5 9 4徐 菲 等 土 壤 病 原 微 生 物 检 测 技 术 研 究 进 展 2 0 2 2 年 1 2 月 w w w a e s o r g c n 技 术 使 得 环 境 中 病 原 微 生 物 的 快 检 得 以 迅 速 发 展 并 已投入到实际环境应用中 显示出巨大的发展潜力 2 分 子 生 物 学 技 术 分 子 生 物 学 技 术 用 于 快 速 检 测 病 原 微 生 物 主 要 是 基 于 病 原 微 生 物 的 特 异 D N A 或 R N A 标 记 基 因 序 列 进 行 分 析 主 要 包 含 聚 合 酶 链 式 反 应 P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n P C R 技 术 高 通 量 测 序 技 术 等 2 1 P C R 技 术 P C R 技 术 是 在 体 外 模 拟 D N A 合 成 过 程 通 过 三 步 反 应 循 环 变 性 退 火 和 延 伸 扩 增 特 定 的 靶 D N A 序 列 实 现 靶 序 列 的 指 数 扩 增 图 3 A 实 时 荧 光 定 量 P C R q P C R 技 术 是 在 P C R 技 术 基 础 上 引 入 荧 光 染 料 或 者 探 针 在 扩 增 过 程 中 实 时 监 测 目 的 基 因 的 荧 光 信 号 强 度 通 过 内 参 法 或 者 外 参 法 对 样 品 中 特 定 的 基 因 进 行 定 量 分 析 图 3 A q P C R 技 术 相 较 于 传 统 培 养 方 法 大 幅 降 低 了 病 原 微 生 物 的 检 测 限 且 分 析 快 速 目 前 已 广 泛 用 于 快 速 检 测 和 定 量 土 壤 水 体 和 空 气 等 环 境 中 的 细 菌 真 菌 等 病 原 微 生 物 例 如 N G U Y E N 等 1 5 利 用 手 持 式 便 携 q P C R 系 统 对 过 滤 水 样 中 嗜 冷 黄 杆 菌 实 现 了 5 0 m i n 内 的 快 速 现 场 监 测 Y A O 等 1 6 利 用 q P C R 和 I l l u m i n a 测 序 技 术 对 施 用 生 物 炭 后 土 壤 细 菌 和 真 菌 群 落 的 变 化 进 行 了 长 期 监 测 考 虑 到 P C R 技 术 检 测 通 量 低 的 局 限 性 研 究 者 发 展 出 了 多 重 P C R 技 术 多 重 P C R 技 术 是 在 P C R 反 应 管 中 同 时 加 入 多 种 特 异 性 引 物 进 行 P C R 扩 增 该 技 术 具 有 高 通 量 低 成 本 等 优 点 近 年 来 多 重 P C R 技 术 为 水 环 境 中 病 原 微 生 物 的 联 合 检 测 提 供 了 一 种 快 速 灵 敏 的 方 法 已 成 功 应 用 于 检 测 地 表 水 中 的 大 肠 杆 菌 铜 绿 假 单 胞 菌 志 贺 氏 菌 属 沙 门 氏 菌 等 病 原 微 生 物 检 测 限 为 3 1 0 2 3 1 0 3 C F U m L 1 1 7 朱 永 官 团 队 还 开 发 出 病 原 菌 检 测 的 高 通 量 定 量 P C R 技 术 平 台 1 8 1 9 图 3 B 该 技 术 可 以 同 时 对 2 3 种 人 类 病 原 菌 的 6 8 个 标 记 基 因 和 1 0 种 粪 源 宿 主 的 2 3 个 标 记 基 因 进 行 定 量 检 测 利 用 该 技 术 A N 等 1 4 对 厦 门 1 3 个 海 滨 浴 场 的 水 体 进 行 病 原 菌 检 测 和 污 染 溯 源 为 病 原 菌 相 关 的 健 康 评 估 提 供 了 数 据 支 持 微 滴 式 数 字 P C R D r o p l e t D i g i t a l P C R d d P C R 是 第 三 代 P C R 技 术 图 3 A 可 用 于 绝 对 定 量 且 比 q P C R 具 有 更 高 的 聚 合 酶 链 式 反 应 抑 制 剂 的 耐 受 能 力 在 处 理 复 杂 环 境 样 品 如 水 样 沉 积 物 时 具 有 优 势 S I N G H 等 2 0 使 用 d d P C R 和 q P C R 分 别 对 河 流 沉 积 物 中 的 沙 门 氏 菌 进 行 检 测 发 现 d d P C R 显 著 提 高 了 图 2 土 壤 等 环 境 病 原 微 生 物 检 测 技 术 汇 总 F i g u r e 2 S u m m a r y o f d e t e c t i o n t e c h n i q u e s f o r p a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s i n s o i l a n d o t h e r e n v i r o n m e n t s 2 5 9 5农 业 环 境 科 学 学 报 第 4 1 卷 第 1 2 期 分 析 灵 敏 度 和 低 浓 度 沙 门 氏 菌 的 检 测 结 果 证 明 d d P C R 更 适 用 于 沙 门 氏 菌 的 检 测 该 技 术 稳 定 准 确 高 通 量 并 且 检 测 河 流 沉 积 物 类 的 环 境 样 品 比 q P C R 更 加 灵 敏 上 述 P C R 相 关 技 术 的 主 要 缺 点 是 设 备 昂 贵 需 要 繁 琐 的 热 循 环 额 外 的 设 备 以 及 较 高 的 专 业 技 能 为 了 加 快 环 境 病 原 微 生 物 的 快 速 检 测 环 介 导 等 温 扩 增 L o o p m e d i a t e d I s o t h e r m a l A m p l i f i c a t i o n L A M P 投 入 应 用 该 技 术 是 近 年 来 新 开 发 的 一 种 恒 温 基 因 扩 增 技 术 2 1 主 要 包 括 模 板 合 成 循 环 扩 增 以 及 延 长 和 再 循 环 阶 段 具 有 简 便 经 济 快 速 灵 敏 度 高 特 异 性 强 等 优 点 缺 点 是 扩 增 效 率 比 较 低 常 因 为 非 特 异 性 而 导 致 假 阳 性 结 果 引 物 设 计 复 杂 反 应 体 系 容 易 被 污 染 扩 增 产 物 难 定 量 等 2 2 L A M P 可 以 在 资 源 匮 乏 地 区 且 无 专 业 技 术 人 员 情 况 下 进 行 环 境 中 微 生 物 的 快 速 检 测 2 3 该 技 术 已 经 被 应 用 于 检 测 空 气 中 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 2 4 以 及 水 体 中 的 大 肠 杆 菌 2 5 沙 门 氏 菌 2 5 等 病 原 菌 2 2 高 通 量 测 序 高 通 量 测 序 主 要 利 用 特 异 性 标 记 基 因 毒 力 因 子 和 1 6 S r R N A 基 因 鉴 定 致 病 菌 利 用 此 技 术 可 以 获 得 环 境 中 多 种 微 生 物 物 种 结 构 功 能 以 及 遗 传 多 样 性 等 方 面 的 丰 富 信 息 该 技 术 具 有 通 量 大 可 直 接 测 定 病 原 微 生 物 的 核 酸 序 列 检 测 限 低 等 优 势 但 是 检 测 成 本 高 难 以 完 全 取 代 常 规 病 原 微 生 物 检 测 方 法 且 数 据 分 析 耗 时 目 前 第 二 代 测 序 技 术 是 主 导 的 测 序 技 术 主 要 的 测 序 平 台 为 4 5 4 测 序 平 台 和 I l l u m i n a 测 序 平 台 7 C A O 等 2 6 利 用 I l l u m i n a H i S e q 2 0 0 0 对 雾 霾 空 气 微 生 物 宏 基 因 组 进 行 了 测 序 研 究 在 种 的 分 类 水 平 上 对 环 境 空 气 中 细 菌 真 菌 古 菌 和 d s D N A 病 毒 等 微 生 物 进 行 了 检 测 鉴 定 2 7 Y A N G 等 2 8 利 用 I l l u m i n a 对 水 体 环 境 和 塑 料 际 微 生 物 的 1 6 S r R N A 进 行 测 序 并 将 测 序 结 果 与 病 原 菌 数 据 库 进 行 比 对 共 检 测 到 水 体 及 塑 料 际 包 括 分 枝 杆 菌 李 斯 特 菌 芽 孢 杆 菌 假 单 胞 菌 肠 杆 菌 等 在 内 的 多 种 人 体 潜 在 致 病 菌 3 拉 曼 光 谱 技 术 拉 曼 光 谱 正 发 展 成 为 一 种 不 依 赖 于 培 养 的 微 生 物 快 速 检 测 和 识 别 的 新 兴 检 测 手 段 与 分 子 生 物 学 技 术 相 比 拉 曼 光 谱 可 以 直 接 快 速 无 损 地 对 低 至 单 个微生物进行检测 且可借助稳定同位素标记区分死 活细胞 为病原微生物的快速检测提供了新的手段 3 1 拉 曼 光 谱 原 理 1 9 2 8 年 印 度 物 理 学 家 拉 曼 首 次 发 现 拉 曼 散 射 现 象 拉 曼 光 谱 是 一 种 基 于 分 子 振 动 的 光 谱 技 术 入 射 光 与 分 子 化 学 键 作 用 后 发 生 非 弹 性 拉 曼 散 射 通 过 检 测 与 入 射 光 频 率 不 同 的 拉 曼 散 射 光 获 得 物 质 的 化 学 组 成 和 分 子 结 构 等 信 息 3 2 单 细 胞 拉 曼 光 谱 单 细 胞 拉 曼 光 谱 研 究 微 生 物 的 主 要 优 点 包 括 2 8 2 9 单 细 胞 水 平 检 测 与 光 学 显 微 镜 结 合 可 提 供 低 至 1 m m 的 空 间 分 辨 率 实 现 对 单 个 细 菌 的 直 接 图 3 P C R 相 关 技 术 原 理 及 流 程 图 F i g u r e 3 P r i n c i p l e s a n d f l o w c h a r t o f P C R r e l a t e d t e c h n o l o g y A P C R q P C R 以 及 d d P C R 原 理 图 1 3 B 高 通 量 定 量 P C R 技 术 流 程 1 4 2 5 9 6徐 菲 等 土 壤 病 原 微 生 物 检 测 技 术 研 究 进 展 2 0 2 2 年 1 2 月 w w w a e s o r g c n 检 测 克 服 冗 长 的 培 养 限 制 实 现 快 速 检 测 丰 富 的 化 学 信 息 拉 曼 光 谱 提 供 微 生 物 所 含 多 种 生 物 分 子 的 指 纹 图 谱 包 括 核 酸 蛋 白 质 脂 质 色 素 如 类 胡 萝 卜 素 细 胞 色 素 c 等 这 些 拉 曼 特 征 会 随 种 属 或 生 理 状 态 的 变 化 而 灵 敏 改 变 与 统 计 分 析 或 机 器 学 习 结 合 时 拉 曼 光 谱 可 在 不 同 分 类 水 平 如 属 种 甚 至 菌 株 水 平 区 分 病 原 菌 无 损 检 测 允 许 下 游 特 定 功 能 单 细 胞 的 基 因 组 分 析 提 供 了 一 种 关 联 拉 曼 表 型 和 基 因 型 的 方 法 对 于 全 面 深 入 认 识 环 境 中 致 病 菌 和 抗 生 素 耐 药 性 非 常 重 要 2 9 近 年 来 基 于 不 同 微 生 物 的 特 征 指 纹 图 谱 拉 曼 光 谱 已 被 用 于 快 速 识 别 土 壤 水 体 临 床 中 的 病 原 微 生 物 甚 至 在 低 至 单 个 菌 株 水 平 上 有 很 高 的 准 确 度 例 如 W A L T E R 等 3 0 采 用 拉 曼 光 谱 结 合 线 性 判 别 分 析 L i n e a r D i s c r i m i n a n t A n a l y s i s L D A 研 究 了 作 为 土 壤 重 金 属 污 染 的 生 物 指 示 剂 链 霉 菌 属 细 菌 识 别 了 不 同 N i 2 浓 度 培 养 基 中 链 霉 菌 的 单 细 胞 拉 曼 光 谱 预 测 精 度 为 8 8 此 外 有 研 究 者 还 利 用 拉 曼 光 谱 结 合 支 持 向 量 机 鉴 定 瓶 装 矿 泉 水 独 立 样 本 中 的 铜 绿 假 单 胞 菌 准 确 率 达 到 8 5 3 1 S C H U S T E R 等 3 2 3 3 首 先 在 单 细 胞 水 平 引 入 拉 曼 光 谱 进 行 微 生 物 研 究 证 明 拉 曼 光 谱 可 以 作 为 一 种 快 速 可 靠 的 技 术 方 法 用 于 人 类 致 病 菌 军 团 菌 的 识 别 分 类 此 后 M O N T A N A R I 等 3 4 将 单 细 胞 拉 曼 技 术 与 经 典 微 生 物 检 测 技 术 相 结 合 成 功 鉴 别 出 2 8 8 份 血 液 透 析 用 水 中 分 离 的 1 4 6 种 临 床 酵 母 菌 种 证 实 了 单 细 胞 拉 曼 光 谱 对 血 液 透 析 用 水 中 真 菌 鉴 别 的 可 行 性 由 于 微 生 物 光 谱 数 据 集 差 异 较 小 尤 其 是 低 信 噪 比 的 光 谱 利 用 传 统 的 化 学 计 量 学 方 法 难 以 区 分 如 L D A 偏 最 小 二 乘 判 别 分 析 P a r t i a l L e a s t S q u a r e s D i s c r i m i n a n t A n a l y s i s P L S D A 支 持 向 量 机 S u p p o r t V e c t o r M a c h i n e S V M 以 及 随 机 森 林 R a n d o m F o r e s t R F 等 1 9 3 5 为 了 解 决 这 些 挑 战 深 度 学 习 算 法 如 卷 积 神 经 网 络 C o n v o l u t i o n a l N e u r a l N e t w o r k C N N 循 环 神 经 网 络 R e c u r r e n t N e u r a l N e t w o r k R N N 生 成 式 对 抗 网 络 G e n e r a t i v e A d v e r s a r i a l N e t w o r k s G A N 等 成 为 一 种 有 前 景 的 解 决 途 径 近 几 年 在 致 病 菌 快 速 鉴 别 方 面 得 到 了 成 功 应 用 例 如 L U 等 3 6 利 用 拉 曼 光 镊 结 合 C N N 快 速 鉴 定 微 生 物 单 细 胞 并 进 行 特 征 光 谱 提 取 图 4 A 通 过 构 建 1 4 种 微 生 物 的 拉 曼 组 数 据 库 在 单 细 胞 水 平 鉴 定 微 生 物 的 平 均 准 确 率 达 到 9 5 6 4 并 且 整 个 鉴 定 过 程 在 5 m i n 内 完 成 另 外 拉 曼 光 谱 快 速 鉴 别 病 原 微 生 物 也 被 应 用 到 了 临 床 菌 株 的 鉴 定 例 如 H O 等 3 5 利 用 3 0 个 临 床 病 原 菌 分 离 菌 株 的 拉 曼 光 谱 数 据 建 立 参 考 数 据 集 利 用 C N N 训 练 识 别 模 型 图 4 B 进 一 步 结 合 独 立 验 证 集 临 床 患 者 新 分 离 菌 株 的 拉 曼 谱 图 进 行 模 型 微 调 和 性 能 优 化 实 现 了 临 床 患 者 分 离 菌 株 的 成 功 鉴 定 且 仅 1 0 个 光 谱 就 可 以 获 得 高 达 9 9 7 的 分 类 准 确 度 实 现 了 从 模 拟 到 临 床 应 用 的 转 变 此 外 Q I N 等 3 7 开 发 了 基 于 拉 曼 光 谱 结 合 深 度 学 习 的 方 法 实 现 了 对 6 种 典 型 病 原 菌 细 胞 外 囊 泡 的 快 速 精 准 识 别 和 生 成 机 制 研 究 在 菌 株 水 平 的 分 类 准 确 度 达 到 9 3 值 得 注 意 的 是 微 生 物 的 生 长 状 态 和 环 境 因 素 很 容 易 引 发 拉 曼 光 谱 特 征 的 变 化 因 此 对 于 基 于 拉 曼 光 谱 的 病 原 菌 鉴 别 生 理 状 态 生 长 阶 段 介 质 3 8 3 9 环 境 因 素 p H 温 度 水 分 等 4 0 4 1 以 及 样 品 处 理 过 程 4 2 等 都 需 纳 入 拉 曼 数 据 集 以 构 建 稳 定 的 病 原 菌 鉴 别 模 型 此 外 单 细 胞 拉 曼 光 谱 结 合 稳 定 同 位 素 标 记 还 可 用 于 研 究 微 生 物 的 活 性 1 9 2 9 4 3 当 细 菌 通 过 代 谢 活 动 摄 入 2 D 1 3 C 1 5 N 等 同 位 素 标 记 物 后 细 胞 重 要 组 成 成 分 如 脂 类 蛋 白