吉林白城与内蒙古开鲁辣椒白皮病病原鉴定及生防菌筛选.pdf

第 51 卷 第 12 期 2023 年 12 月 西 北 农 林 科 技 大 学 学 报 自 然 科 学 版 J ou r na l o f No r t hwe s t A 内 蒙 古 自 治 区 高 教 项 目 NJZY21458 NJZY22521 科 技 兴 蒙 行 动 重 点 专 项 211 作 者 简 介 孙 平 平 1985 女 陕 西 渭 南 人 副 教 授 博 士 硕 士 生 导 师 主 要 从 事 植 物 病 原 鉴 定 及 生 物 防 治 研 究 E ma i l sunp i ngp i ng imau edu cn 通 信 作 者 李 正 男 1983 男 吉 林 白 城 人 教 授 博 士 硕 士 生 导 师 主 要 从 事 植 物 病 原 菌 与 植 物 互 作 研 究 E ma i l l i zhengnan imau edu cn 孙 平 平 1 范 博 文 1 付 崇 毅 2 王 永 2 毕 智 君 3 李 正 男 1 1 内 蒙 古 农 业 大 学 园 艺 与 植 物 保 护 学 院 内 蒙 古 呼 和 浩 特 010018 2 内 蒙 古 自 治 区 农 牧 业 科 学 院 蔬 菜 花 卉 研 究 所 内 蒙 古 呼 和 浩 特 010031 3 呼 和 浩 特 市 农 畜 产 品 质 量 安 全 中 心 内 蒙 古 呼 和 浩 特 010020 摘 要 目 的 明 确 吉 林 白 城 和 内 蒙 古 开 鲁 辣 椒 白 皮 病 病 原 并 从 辣 椒 根 际 土 壤 中 筛 选 对 该 病 原 菌 具 有 良 好 防 效 的 生 防 菌 为 辣 椒 白 皮 病 的 诊 断 和 绿 色 防 控 提 供 参 考 方 法 从 吉 林 白 城 和 内 蒙 古 开 鲁 辣 椒 产 区 采 集 表 现 白 皮 症 状 的 辣 椒 果 实 及 其 根 际 土 壤 样 品 采 用 组 织 分 离 法 分 离 纯 化 病 原 菌 果 实 接 种 法 验 证 分 离 病 原 菌 的 致 病 性 通 过 形 态 学 结 合 ITS ACT TUB CHS GAPDH HI S3 多 基 因 联 合 法 对 分 离 的 致 病 菌 进 行 鉴 定 利 用 逐 级 稀 释 法 分 离 辣 椒 根 际 土 壤 样 品 中 的 放 线 菌 用 离 体 结 合 活 体 测 定 法 筛 选 对 分 离 病 原 菌 有 显 著 拮 抗 活 性 的 生 防 菌 并 采 用 形 态 学 培 养 特 性 和 分 子 序 列 相 结 合 的 方 法 对 筛 选 的 生 防 菌 株 进 行 鉴 定 结 果 从 吉 林 白 城 和 内 蒙 古 开 鲁 辣 椒 样 品 中 分 离 得 到 25 株 真 菌 其 中 有 6 株 真 菌 在 致 病 性 测 定 中 表 现 出 典 型 的 白 皮 病 症 状 分 别 为 LJ 1 LJ 2 LJ 3 LJ 4 LJ 5 和 KLLJ 9 形 态 学 结 合 多 基 因 联 合 确 定 分 离 的 病 原 菌 均 为 斯 高 维 尔 炭 疽 菌 C o l l e t o t r i c h u m s c o v i l l e i 以 斯 高 维 尔 炭 疽 菌 LJ 1 为 供 试 靶 标 菌 从 辣 椒 根 际 土 壤 中 分 离 到 1 株 拮 抗 放 线 菌 SLJ 2 2 其 能 有 效 抑 制 斯 高 维 尔 炭 疽 菌 LJ 1 的 感 染 和 扩 展 喷 施 3 次 SLJ 2 2 发 酵 上 清 液 后 对 斯 高 维 尔 炭 疽 菌 LJ 1 的 抑 制 率 达 到 95 53 结 合 形 态 学 培 养 特 性 和 分 子 生 物 学 方 法 将 SLJ 2 2 鉴 定 为 微 黄 白 链 霉 菌 S t r e p t o m y c e s a l b i d o f l a v u s 结 论 吉 林 白 城 和 内 蒙 古 开 鲁 地 区 辣 椒 白 皮 病 主 要 由 斯 高 维 尔 炭 疽 菌 侵 染 引 起 从 辣 椒 根 际 土 壤 中 筛 选 出 的 微 黄 白 链 霉 菌 能 有 效 抑 制 该 病 原 菌 的 感 染 及 其 在 辣 椒 上 的 扩 展 关 键 词 辣 椒 白 皮 病 病 原 鉴 定 生 物 防 治 斯 高 维 尔 炭 疽 菌 微 白 黄 链 霉 菌 中 图 分 类 号 S436 418 1 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1671 9387 2023 12 0060 12 I s o l a t i o n o f p a t h o g e n s c a u s i n g c h i l l i w h i t e s k i n d i s e a s e i n B a i c h e n g J i l i n a n d K a i l u I n n e r M o n g o l i a a n d s c r e e n i n g o f e f f e c t i v e b i o c o n t r o l a g e n t SUN P i ngp i ng 1 FAN Bowen 1 FU Chongy i 2 WANG Yong 2 BI Zh i j un 3 LI Zhengnan 1 1 C o l l e g e o f H o r t i c u l t u r e a n d P l a n t P r o t e c t i o n I n n e r M o n g o l i a A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y H o h h o t I n n e r M o n g o l i a 010018 C h i n a 2 I n s t i t u t e o f V e g e t a b l e a n d F l o w e r R e s e a r c h A c a d e m y o f A g r i c u l t u r e a n d A n i m a l H u s b a n d r y S c i e n c e o f I n n e r M o n g o l i a A u t o n o m o u s R e g i o n H o h h o t I n n e r M o n g o l i a 010031 C h i n a 3 Q u a l i t y a n d S a f e t y C e n t e r o f A g r i c u l t u r a l a n d A n i m a l P r o d u c t s i n H o h h o t H o h h o t I n n e r M o n g o l i a 010020 C h i n a A b s t r a c t Ob j e c t i ve Th i s s t udy i den t i f i ed t he pa t hogen c aus i ng ch i l l i wh i t e sk i n i n Ba i cheng J i l i n and Ka i l u I nne r Mongo l i a and s c r e ened t he b i o c on t r o l agen t f r om rh i z o sphe r e o f ch i l l i p l an t s wi t h h i gh c on t r o l e f f i c i enc y t o p r ov i de i n f o rma t i on f o r t he i den t i f i c a t i on and c on t r o l o f ch i l l i wh i t e sk i n d i s e a s e Me t hod Di s e a s ed ch i l l i f ru i t s wi t h s ymp t oms o f wh i t e sk i n and rh i z o sphe r e s o i l we r e c o l l e c t ed f r om Ba i cheng J i l i n and Ka i l u I nne r Mongo l i a Ti s sue i so l a t i on me t hod wa s us ed t o i s o l a t e t he f ung i and t he pa t hogen i c i t y o f i s o l a t ed s t r a i ns wa s ve r i f i ed by i nocu l a t i on me t hod be f o r e t he pa t hogen i c s t r a i ns we r e i den t i f i ed by mo r pho l og i c cha r a c t e r s c omb i ned wi t h ITS ACT TUB CHS GAPDH HI S3 mu l t i gene me t h od Ac t i nomyc e t e s we r e i s o l a t ed f r om rh i z osphe r e o f ch i l l i p l an t s by s e r i a l d i l u t i on me t hod and b i o c on t r o l agen t s wi t h s i gn i f i c an t an t agon i s t i c a c t i v i t y aga i ns t t he f ung i we r e s c r e ened by i n v i t r o and i n v i v o a s s ay The i s o l a t ed b i o con t r o l agen t s we r e i den t i f i ed by mo r pho l og i c cha r a c t e r s c omb i ned wi t h mo l e cu l a r me t h ods Re su l t A t o t a l o f 25 f unga l i s o l a t e s we r e i s o l a t ed f r om ch i l l i s amp l e s and 6 o f t hem name l y LJ 1 LJ 2 LJ 3 LJ 4 LJ 5 and KLLJ 9 showed t yp i c a l wh i t e sk i n s ymp t oms i n t he pa t hogen i c i t y t e s t Al l o f t he s e 6 s t r a i ns we r e i den t i f i ed a s C o l l e t o t r i c h u m s c o v i l l e i by mo r pho l og i c cha r a c t e r s t oge t he r wi t h mu l t i gene me t hod The s t r a i n SLJ 2 2 i so l a t ed f r om rh i z o sphe r e o f ch i l l i showed s i gn i f i c an t i nh i b i t o r y a c t i v i t y aga i ns t C s c o v i l l e i LJ 1 and t he d i s e a s e d i ame t e r o f C s c o v i l l e i LJ 1 on ch i l l i f ru i t s wa s r educ ed by 95 53 a f t e r sp r ay i ng SLJ 2 2 by 3 t ime s The mo r pho l og i c and cu l t u r a l cha r a c t e r s t oge t he r wi t h mo l e cu l a r i den t i f i c a t i on i nd i c a t ed t ha t SLJ 2 2 wa s S t r e p t o m y c e s a l b i d o f l a v u s Conc l us i on C s c o v i l l e i wa s t he ma i n c aus e o f ch i l l i wh i t e sk i n i n Ba i cheng J i l i n and Ka i l u I nne r Mongo l i a and S a l b i d o f l a v u s SLJ 2 2 i so l a t ed f r om rh i z osphe r e cou l d e f f e c t i ve l y i nh i b i t C s c o v i l l e i K e y w o r d s ch i l l i wh i t e sk i n pa t hogen i den t i f i c a t i on b i o l og i c a l c on t r o l C o l l e t o t r i c h u m s c o v i l l e i S t r e p t o m y c e s a l b i d o f l a v u s 辣 椒 C a p s i c u m a n n u u m L 是 世 界 上 需 求 最 大 的 调 味 料 用 作 物 也 是 我 国 第 二 大 蔬 菜 作 物 1 2 吉 林 省 和 内 蒙 古 自 治 区 气 候 凉 爽 光 照 充 足 昼 夜 温 差 大 极 适 宜 辣 椒 种 植 其 中 吉 林 省 白 城 市 辣 椒 种 植 面 积 每 年 稳 定 在 1 33 万 hm 2 左 右 产 量 约 5 万 t 3 通 辽 市 开 鲁 县 是 内 蒙 古 东 北 地 区 干 制 辣 椒 的 重 要 种 植 区 每 年 干 制 辣 椒 种 植 面 积 约 3 3 万 hm 2 年 产 干 制 辣 椒 约 20 万 t 4 近 年 来 受 益 于 稳 定 的 销 售 价 格 和 良 好 的 市 场 渠 道 辣 椒 种 植 面 积 逐 年 增 加 但 是 由 于 重 茬 连 作 等 造 成 辣 椒 病 害 逐 年 加 重 尤 其 在 干 辣 椒 制 作 过 程 中 出 现 大 量 辣 椒 逐 渐 由 红 色 转 为 白 色 的 现 象 在 当 地 被 称 为 辣 椒 白 皮 病 严 重 影 响 其 商 品 价 值 和 后 续 加 工 再 加 上 不 科 学 用 药 以 及 农 药 残 留 等 问 题 给 农 户 造 成 极 大 损 失 因 此 研 究 该 地 区 辣 椒 白 皮 病 的 主 要 病 因 并 对 其 有 效 防 控 成 为 该 地 区 辣 椒 产 业 发 展 的 关 键 本 研 究 从 吉 林 省 白 城 市 和 内 蒙 古 通 辽 市 开 鲁 县 辣 椒 产 区 采 集 表 现 白 皮 病 的 辣 椒 利 用 组 织 分 离 法 分 离 纯 化 病 原 菌 再 利 用 形 态 学 观 察 结 合 ITS ACT TUB CHS GAPDH HI S3 多 基 因 序 列 联 合 分 析 确 定 引 发 辣 椒 白 皮 病 的 病 原 再 以 分 离 的 病 原 菌 为 供 试 菌 株 从 辣 椒 根 际 土 壤 中 分 离 筛 选 能 够 有 效 拮 抗 该 致 病 菌 的 生 防 菌 株 以 期 为 辣 椒 白 皮 病 的 诊 断 和 绿 色 防 控 提 供 依 据 1 材 料 与 方 法 1 1 试 验 材 料 1 1 1 辣 椒 和 土 壤 样 品 采 集 表 现 白 皮 症 状 的 辣 椒 样 品 采 自 吉 林 省 白 城 市 和 内 蒙 古 通 辽 市 开 鲁 县 辣 椒 产 区 正 常 生 长 的 辣 椒 为 红 色 图 1 A 感 病 后 出 现 褪 色 发 白 并 在 感 病 部 位 出 现 环 状 同 心 轮 纹 图 1 B 且 环 状 同 心 轮 纹 上 形 成 黑 色 的 分 生 孢 子 器 图 1 C 发 生 严 重 时 整 个 辣 椒 均 褪 红 而 变 为 白 色 图 1 D 被 称 为 辣 椒 白 皮 病 另 外 在 采 集 辣 椒 样 品 的 同 时 收 集 辣 椒 根 际 土 壤 样 品 土 样 采 集 时 先 去 掉 表 层 5 cm 土 壤 收 集 5 20 cm 土 层 土 壤 后 用 牛 皮 纸 袋 包 好 运 回 实 验 室 4 低 温 保 存 用 于 拮 抗 菌 株 的 分 离 1 1 2 培 养 基 马 铃 薯 葡 萄 糖 培 养 基 PDA 高 氏 1 号 培 养 基 和 碳 源 利 用 培 养 基 其 具 体 配 方 参 见 文 献 5 小 米 培 养 基 的 配 方 为 1 g 小 米 加 蒸 馏 水 煮 20 mi n 取 过 滤 后 的 上 清 液 用 蒸 馏 水 定 容 至 100 mL 再 加 入 葡 萄 糖 1 g 蛋 白 胨 0 3 g NaCl 0 25 g CaCO3 0 02 g 1 2 病 原 菌 的 分 离 与 纯 化 采 用 组 织 分 离 法 分 离 病 原 菌 具 体 操 作 为 切 取 发 病 辣 椒 果 实 病 健 交 界 处 组 织 先 用 质 量 分 数 1 的 次 氯 酸 钠 浸 泡 3 mi n 再 用 体 积 分 数 75 的 乙 1 6 第 12 期 孙 平 平 等 吉 林 白 城 与 内 蒙 古 开 鲁 辣 椒 白 皮 病 病 原 鉴 定 及 生 防 菌 筛 选醇 浸 泡 30 s 用 灭 菌 水 漂 洗 3 次 后 接 于 PDA 培 养 基 上 28 恒 温 培 养 3 4 d 挑 取 菌 落 边 缘 菌 丝 移 入 新 的 PDA 平 板 继 续 恒 温 培 养 重 复 以 上 操 作 直 至 得 到 纯 培 养 物 将 纯 化 菌 株 接 种 于 PDA 培 养 基 上 28 恒 温 培 养 3 4 d 用 于 致 病 性 检 测 和 拮 抗 菌 株 筛 选 A 正 常 生 长 辣 椒 B D 感 白 皮 病 辣 椒 A No rma l ch i l l i B D Ch i l l i wi t h wh i t e sk i n s ymp t oms 图 1 试 验 采 集 的 辣 椒 样 品 F i g 1 Co l l e c t ed ch i l l i s amp l e s 1 3 病 原 菌 的 致 病 性 检 测 选 取 健 康 的 辣 椒 果 实 用 质 量 分 数 1 的 次 氯 酸 钠 浸 泡 5 mi n 再 用 无 菌 水 冲 洗 3 次 晾 干 备 用 用 无 菌 接 种 针 刺 伤 辣 椒 果 实 在 伤 口 处 接 种 直 径 为 6 mm 的 分 离 菌 株 菌 饼 菌 丝 面 朝 向 辣 椒 透 明 胶 带 固 定 每 处 理 重 复 6 次 将 接 种 辣 椒 置 于 铺 有 双 层 纱 布 的 培 养 盘 中 25 16 h 光 照 8 h 黑 暗 相 对 湿 度 70 的 条 件 下 培 养 3 d 后 去 掉 胶 带 定 时 观 察 记 录 发 病 情 况 1 4 病 原 菌 鉴 定 1 4 1 形 态 学 鉴 定 将 分 离 的 致 病 菌 接 种 到 PDA 平 板 上 25 恒 温 培 养 15 d 观 察 其 菌 落 菌 丝 及 孢 子 形 态 1 4 2 分 子 生 物 学 鉴 定 收 集 病 原 菌 菌 丝 体 利 用 真 菌 DNA 提 取 试 剂 盒 提 取 病 原 菌 的 DNA 以 病 原 菌 DNA 为 模 板 进 行 PCR 扩 增 目 标 序 列 分 别 为 ITS i n t e rna l t r ans c r i bed spa c e r r eg i ons 6 ACT a c t i n gene 7 TUB be t a t ubu l i n 8 9 CHS 1 c h i t i n s yn t h a s e 1 7 GAPDH g l y c e r a l d e hyd e 3 pho s pha t e d e hyd r og e n a s e 10 和 HI S3 h i s t on e 3 11 所 用 引 物 及 其 序 列 见 表 1 PCR 反 应 体 系 为 2 M5 Hi p pe r 超 光 速 Mi x 10 L ddH2O 7 L DNA 模 板 1 L 上 下 游 引 物 各 1 L PCR 反 应 程 序 为 94 预 变 性 3 mi n 94 变 性 30 s 55 59 退 火 30 s 72 延 伸 30 60 s 各 引 物 退 火 温 度 和 延 伸 时 间 见 表 1 35 个 循 环 72 补 平 10 mi n PCR 扩 增 产 物 经 1 0 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 后 用 普 通 琼 脂 糖 凝 胶 DNA 回 收 试 剂 盒 Ti angen 北 京 回 收 纯 化 然 后 送 上 海 生 工 生 物 工 程 股 份 有 限 公 司 测 序 表 1 PCR 扩 增 所 用 引 物 信 息 Tab l e 1 I n f o rma t i on o f p r ime r s us ed f o r PCR amp l i f i c a t i on i n t h i s s t udy 引 物 名 称 Pr ime r s 引 物 序 列 5 3 Pr ime r s equenc e 5 3 退 火 温 度 Anne a l i ng t empe r a t ur e 延 伸 时 间 s Ex t end t ime 目 标 序 列 Ta r ge t s equenc e 目 标 序 列 长 度 bp Ta r ge t l eng t h ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 55 40 ITS 558 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ACT 512F ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC 58 30 ACT 250 ACT 783R TACGAGTCCTTCTGGCCCAT TUB T1 AACATGCGTGAGATTGTAAGT 59 60 TUB 759 TUB 2b ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC CHS 79F TGGGGCAAGGATGCTTGGAAGAAG 59 30 CHS 291 CHS 354R TGGAAGAACCATCTGTGAGAGTTG GAPDH F GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA 59 30 GAPDH 248 GAPDH R GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT HI S3 F AGGTCCACTGGTGGCAAG 55 30 HI S3 387 HI S3 R AGCTGGATGTCCTTGGACTG 2 6 西 北 农 林 科 技 大 学 学 报 自 然 科 学 版 第 51 卷 采 用 Ve c t o rNTI Advanc e 11 The rmo F i she r Sc i en t i f i c USA 软 件 对 测 序 结 果 进 行 校 正 利 用 BLASTn 对 校 正 后 的 测 序 结 果 进 行 同 源 序 列 检 索 下 载 参 考 序 列 本 研 究 涉 及 的 菌 株 信 息 见 表 2 按 照 ITS ACT TUB CHS GAPDH HI S3 的 顺 序 进 行 首 尾 相 连 使 用 MEGA 6 0 软 件 以 邻 接 法 n e i ghbo r j o i n i ng NJ 7 构 建 多 基 因 序 列 的 系 统 发 育 进 化 树 形 态 学 结 合 多 基 因 序 列 确 定 分 离 菌 株 的 分 类 地 位 表 2 研 究 涉 及 的 菌 株 及 其 有 关 信 息 Tab l e 2 S t r a i ns i nvo l ved i n t he s t udy and t he i r r e l e van t i n f o rma t i on 菌 株 S t r a i n 采 样 地 点 Lo c a t i on GenBank 号 GenBank numbe r ITS ACT TUB CHS GAPDH HI S3 LJ 1 中 国 吉 林 白 城 Ba i cheng J i l i n Ch i na OP090642 OP156900 OP156906 OP156912 OP156918 OP156924 LJ 2 中 国 吉 林 白 城 Ba i cheng J i l i n Ch i na OP090643 OP156901 OP156907 OP156913 OP156919 OP156925 LJ 3 中 国 吉 林 白 城 Ba i cheng J i l i n Ch i na OP090644 OP156902 OP156908 OP156914 OP156920 OP156926 LJ 4 中 国 吉 林 白 城 Ba i cheng J i l i n Ch i na OP090645 OP156903 OP156909 OP156915 OP156921 OP156927 LJ 5 中 国 吉 林 白 城 Ba i cheng J i l i n Ch i na OP090646 OP156904 OP156910 OP156916 OP156922 OP156928 KLLJ 9 中 国 内 蒙 开 鲁 Ka i l u I nne r Mongo l i a Ch i na OP090647 OP156905 OP156911 OP156917 OP156923 OP156929 C o l l e t o t r i c h u m c u r c u m a e IMI 288937 印 度I nd i a GU227893 GU227991 GU228187 GU228383 GU228285 GU228089 C o l l e t o t r i c h u m t r u n c a t u m CBS 151 35 美 国USA GU227862 GU228254 GU228352 GU228058 GU227960 GU228156 C o l l e t o t r i c h u m o r c h i d o p h i l u m CBS 632 80 美 国USA JQ948151 JQ949472 JQ949802 JQ948812 JQ948481 JQ949142 C o l l e t o t r i c h u m o r c h i d o p h i l u m CBS 631 80 美 国USA JQ948152 JQ949473 JQ949803 JQ948813 JQ948482 JQ949143 C o l l e t o t r i c h u m p h o r m i i CBS 118201 新 西 兰New Ze a l and JQ948449 JQ949770 JQ950100 JQ949110 JQ948780 JQ949440 C o l l e t o t r i c h u m p h o r m i i CBS 102054 新 西 兰New Ze a l and JQ948448 JQ949769 JQ950099 JQ949109 JQ948779 JQ949439 C o l l e t o t r i c h u m a u s t r a l e CBS 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