甜瓜镰刀菌果腐病菌拮抗菌筛选及其拮抗性研究.pdf

园艺学报 2023 50 10 2257 2270 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2022 0741 http www ahs ac cn 2257 收稿日期 2023 04 21 修回日期 2023 09 03 基金项目 新疆自治区科技援疆项目 2020E02094 农业科技创新稳定支持项目 xjnkywdzc 2022004 通信作者 Author for correspondence E mail 779556527 609160628 甜瓜镰刀菌果腐病菌拮抗菌筛选及其拮抗性研 究 何亚芳 1 2 包慧芳 2 王 宁 2 詹发强 2 张学军 3 史应武 2 杨 蓉 2 侯新强 2 龙宣杞 2 1 新疆大学生命科学与技术学院 乌鲁木齐 830046 2 新疆农业科学院微生物应用研究所 新疆特殊环境微生物重 点实验室 乌鲁木齐 830091 3 新疆农业科学院哈密瓜研究中心 乌鲁木齐 830091 摘 要 以新疆喀什地区伽师县盐碱地土壤为材料 通过平板对峙法和琼脂扩散法筛选获得对腐皮 镰刀菌 Fusarium solani BM1 具有显著拮抗作用的菌株 JS6 1 和 JS3 4 两菌株发酵上清液对甜瓜果腐 病病原菌的抑菌圈直径分别为 22 90 和 21 05 mm 通过形态学观察 生理生化试验和 16s rRNA 基因序列 分析初步鉴定为贝莱斯芽孢杆菌 Bacillus velezensis JS6 1 和暹罗芽孢杆菌 Bacillus siamensis JS3 4 抑菌谱 测定结果表明两株菌对尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum KW1 香梨黑斑病菌链格孢菌 Alternatia alternata HB2 香梨腐烂病菌 Valsa mali var pyri FL1 等 9 种植物病原菌均有较强的抑制作用 酶活及产铁载体测 定结果表明 两株菌可产生纤维素酶 蛋白酶 淀粉酶 葡聚糖酶和铁载体等物质 采用酸沉淀法提取 两株菌脂肽类物质 并以腐皮镰刀菌 Fusarium solani BM1为指示菌进行抑菌试验结果表明 两株菌脂肽 类粗提物对病原菌的抑菌圈直径分别为 20 55 和 19 05 mm 对病原菌孢子萌发抑制率分别为 100 和 93 77 综上 拮抗菌 JS6 1 和 JS3 4 对镰刀菌属病原菌具有较好的拮抗效果 具有进一步开发为生防菌 剂的潜力 关键词 甜瓜 镰刀菌 果腐病 生防菌 采后保鲜 中图分类号 S 652 文献标志码 A 文章编号 0513 353X 2023 10 2257 14 Screening of Antagonistic Bacteria Against Fusarium spp Causing Melon Fruit Rot and the Antagonistic Properties HE Yafang 1 2 BAO Huifang 2 WANG Ning 2 ZHAN Faqiang 2 ZHANG Xuejun 3 SHI Yingwu 2 YANG Rong 2 HOU Xinqiang 2 and LONG Xuanqi 2 1 College of Life Sciences and Technology Xinjiang University Urumqi 830046 China 2 Xinjiang Key Laboratory of Special Environmental Microbilogy Institute of Microbiology Xinjiang Academy of Agricultural Sciences Urumqi 830091 China 3 The Research Center of Hami melon Xinjiang Academy of Agricultural Sciences Urumqi 830091 China Abstract In this study the antagonistic bacteria JS6 1 and JS3 4 against Fusarium solani BM1 were screened from the saline alkali soil of Jiashi County Kashgar Xinjiang by plate confrontation method and the agar diffusion method The diameters of the inhibition zone of the melon and fruit rot pathogens were 22 90 and 21 05 mm respectively JS6 1 and JS3 4 were identified as Bacillus velezensis and Bacillus He Yafang Bao Huifang Wang Ning Zhan Faqiang Zhang Xuejun Shi Yingwu Yang Rong Hou Xinqiang Long Xuanqi Screening of antagonistic bacteria against Fusarium spp causing melon fruit rot and the antagonistic properties 2258 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2257 2270 siamensis by morphological observation physiological and biochemical tests as well as 16s rRNA gene sequence analysis respectively The results of bacteriostatic spectrum showed that the two strains had strong inhibitory effect to nine plant pathogens such as Fusarium oxysporum KW1 Alternatia alternata HB2 fragrant pear rot pathogen Valsa mali var pyri FL1 and so on The results of enzyme activity and iron carrier determination showed that the two strains could produce cellulase protease amylase glucanase and iron carrier Lipopeptides of two strains were extracted by acid precipitation method and bacteriostatic experiments were carried out against Fusarium solani BM1 The results showed that the diameters of bacteriostatic zone of the lipopeptides were 20 55 and 19 05 mm and the inhibition rate against spore germination of pathogenic bacteria were 100 and 93 77 respectively In conclusion JS6 1 and JS3 4 have good antagonistic effect against Fusarium solani and are expected to be used in the biological control of melon fruit rot Keywords melon Fusarium spp fruit rot biocontrol bacteria postharvest preservation 甜瓜 Cucumis melo L 为新疆特色瓜果资源 据统计中国甜瓜总产量约为 305 6 万 t 其中新 疆甜瓜总产量约为 165 万 t 占全国产量的 50 以上 Ritschel et al 2004 杨鸿基 等 2022 然 而甜瓜由于采摘期短又值高温季节 且果实糖度高 含水量大 贮藏和运输过程中极易受到病菌侵 染而腐烂变质 造成巨大经济损失 Cui et al 2022 其中由腐皮镰刀菌 尖孢镰刀菌等镰刀菌属 Fusarium spp 病原菌侵染引起的果腐病是主要病害 Sharma et al 2018 武华文 2020 由 于化学杀菌剂防腐保鲜存在药剂残留 环境污染和易产生耐药性等问题 Deng et al 2015 低成 本 安全无毒 污染小的生物保鲜已成为果蔬防腐保鲜技术发展的新方向 魏雪 等 2021 张晓勇 等 2021 本研究中采集了新疆喀什地区伽师县盐碱地土壤 通过平板对峙法和琼脂扩散法筛选出对甜瓜 果腐病致病菌具有明显拮抗作用的生防菌 并进行抑菌活性研究 评估其生防潜力及作用机理 以 期为甜瓜镰刀菌果腐病的生物防治提供优良的菌种资源 为后续生防制剂的研制与应用提供理论基 础 1 材料与方法 1 1 试验材料 土壤样品 采自新疆喀什地区伽师县盐碱地 抑菌谱供试菌株 致病菌腐皮镰刀菌 Fusarium solani BM1 香梨腐烂病菌 Valsa mali var pyri FL1 和香梨黑斑病菌链格孢菌 Alternatia alternata HB2 均由本实验室分离及保存 甜瓜枯萎病 菌 Fusarium oxysporum KW1 由新疆农业科学院哈密瓜研究中心提供 马铃薯黑痣病菌立枯丝核 菌 Rhizoctonia solani ZN5 马铃薯早疫病菌茄病链格孢菌 Alternatia solani ZN6 西瓜枯萎病尖 孢镰刀菌 Fusarium oxysporum ZN10 水稻恶苗串珠镰刀菌 Fusarium moniliforme ZN12 番茄 早疫病菌茄链格孢菌 Alternatia solani ZN18 和核桃腐烂病 Cytcospora sp ZN19 由中国农业大 学种子健康中心赠与 何亚芳 包慧芳 王 宁 詹发强 张学军 史应武 杨 蓉 侯新强 龙宣杞 甜瓜镰刀菌果腐病菌拮抗菌筛选及其拮抗性研究 园艺学报 2023 50 10 2257 2270 2259 1 2 拮抗菌筛选 称取 5 g 土壤样品于 45 mL 无菌水中 28 180 r min 1 恒温摇床上震荡 30 min 用无菌水依 次稀释 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 倍 分别取 100 L 各梯度土壤稀释液涂布至 NA 培养基平板上 于 30 恒温培养 2 d 选择梯度合适的平板 挑取形态差异明显的单菌落在 NA 培养基上划线纯化并 编号保存备用 制备 PDA 培养基平板 在其中央接种直径为 9 mm 的腐皮镰刀菌 BM1 菌饼作为指 示菌 采用十字交叉法将分离纯化好的单菌落点接于距离菌饼中心 2 5 cm处 以只接种病原菌的平 板为对照 每个处理重复 3 次 置于 28 恒温培养箱中培养 7 d 后观察抑菌效果 测量抑菌带宽度 挑选抑菌效果良好的拮抗菌菌株进行复筛 将拮抗菌分别接种于 NA 平板上划线培养 48 h 挑取单菌落接种至灭菌的 LB 液体培养基 王 瑞昊 等 2021 中 于 30 180 r min 1 恒温摇床振荡培养 12 h 得到拮抗菌种子液 将种子液按 照 1 的接种量接种至 100 mL LB 液体培养基中 于 30 180 r min 1 恒温摇床培养 48 h 将发酵 液移入无菌离心管 于 10 000 r min 1 离心 20 min 制得拮抗菌发酵上清液 将 100 L 的病原菌孢 子悬浮液 10 7 CFU mL 1 均匀涂布于 PDA 培养基平板上 采用灭菌的打孔器 直径 9 mm 在 平板上打孔 并加入 50 L 发酵上清液 于 28 培养 4 d 后观察并记录抑菌圈直径 1 3 抑菌谱测定 将筛选出的拮抗菌株分别与 9 种抑菌谱供试菌株进行平板对峙试验 将病原菌菌饼接种于 PDA 培养基中央 将拮抗菌以十字交叉法点接于距离病原菌菌饼中心位置 2 5 cm处 以只接种病原菌的 平板为对照 置于 28 恒温培养箱中培养 5 7 d 后观察抑菌效果 待对照病原菌长满平板后 测 量抑菌带宽度 抑菌率 对照菌落直径 处理菌落直径 对照菌落直径 100 1 4 拮抗菌鉴定 形态学鉴定 将拮抗菌用划线法接种至 NA 培养基平板上 30 培养 48 h 进行菌落形态特征 观察 记录菌落生长情况 颜色 质地和形态特征等 并进行革兰氏染色和显微形态观察 生理生化试验 参照 常见细菌系统鉴定手册 东秀珠和蔡妙英 2001 及 伯杰氏细菌鉴 定手册 Buchanan Gibbons 1984 的方法对菌株进行生理生化测定 生长特性测定 挑取单菌落接种至 100 mL LB 液体培养基中 30 180 r min 1 摇床振荡培 养 12 h 作为种子液 分别设置不同梯度 pH 值 3 0 5 0 7 0 9 0 11 0 不同 NaCl 浓度 2 5 5 7 5 8 8 5 9 9 5 10 和不同温度 4 25 37 50 和 60 按 1 的接种量 接入 LB 液体培养基中 30 180 r min 1 培养 48 h 观察生长情况并记录 16S rRNA 分子生物学鉴定 使用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取拮抗菌株的 DNA 利用细 菌通用引物 27F 5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 和 1492R 5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3 Myo et al 2019 扩增 16S rRNA 基因序列 PCR 预混液体系 50 L 2 PCR 缓冲液 25 L DNA 模板 2 L 上 下游引物各 1 L 用 ddH 2 O 补至 50 L 反应条件 95 预变性 5 min 95 变性 45 s 57 退火 30 s 72 延伸 90 s 30 个循环 72 延伸 10 min 采用 1 5 琼脂糖凝胶电 泳进行 PCR 产物检测后将 PCR 扩增产物送至生工生物工程 上海 股份有限公司进行 16S rRNA 测序 将测序所得序列提交至 https NCBI 数据库申请基因登录 号 采用 MEGA7 0 软件构建系统发育树 He Yafang Bao Huifang Wang Ning Zhan Faqiang Zhang Xuejun Shi Yingwu Yang Rong Hou Xinqiang Long Xuanqi Screening of antagonistic bacteria against Fusarium spp causing melon fruit rot and the antagonistic properties 2260 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2257 2270 1 5 拮抗菌生长曲线和产铁载体测定 挑取活化后的拮抗菌单菌落接种至 50 mL LB 液体培养基中 于 30 摇床 180 r min 1 振荡培 养 12 h 后获得种子液 按 1 的接种量转接至含有 100 mL LB 培养液内 同样条件培养 每 2 h 取 样 1 次 96 h 后结束取样 通过比色法测定菌液的 OD 600 值 以 LB 培养液为空白对照 产铁载体 定性测定 挑取拮抗菌单菌落接种至 MKB CAS 固体平板 杨常娥 等 2017 30 恒温培养箱培养 3 d 每个处理重复 3 次 产铁载体 定量测 参照文献 何翔 等 2020 将培养 12 h 的拮抗菌种子液按 1 接种量转 接 100 mL 无菌 MKB 液体培养基中 30 180 r min 1 振荡培养 72 h 10 000 r min 1 离心 10 min 取上清液与等体积的 CAS 检测液混合 静置 1 h 后在紫外可见分光光度计 630 nm 处测量吸光度值 As 空白培养基 630 nm 处的吸光度值为对照 Ar 铁载体活性单位 Su Ar As Ar 100 1 6 菌株产酶能力测定 淀粉酶测定 将活化好的拮抗菌接种淀粉酶检测培养基平板 刘延波 等 2020 中 于 30 培养 72 h 在培养皿中加入碘液 显色后弃去培养皿中的碘液 观察是否产生透明圈 蛋白酶 几丁质酶测定 将活化好的拮抗菌分别接种于蛋白酶检测 几丁质酶培养基 韩松 2011 陈显玲 2014 中 于 30 培养 72 h 观察是否产生透明圈 纤维素酶测定 将活化好的拮抗菌接种于纤维素酶检测培养基 金伟 等 2017 中 于 30 培养 72 h 在培养皿中加入 1 mg mL 1 的刚果红染液 染色 1 h 弃染液 加入 1 mol L 1 的氯化钠 溶液脱色 30 min 弃去脱色液观察是否产生透明圈 葡聚糖酶测定 将活化好的拮抗菌接种于葡聚糖酶检测培养基 韩松 2011 中 于 30 培养 72 h 观察是否产生水解圈 根据菌株产酶定性结果进行定量测定 纤维素酶 葡聚糖酶和淀粉酶的酶活力的定量采用 DNS 法 蛋白酶酶活力测定采用福林酚法 崔小蕾 2017 1 7 脂肽类粗提物的提取 抑菌活性测定及对病原菌孢子萌发的影响 将拮抗菌发酵液于 4 8 000 r min 1 离心 20 min 取上清液 用 6 mol L 1 的盐酸调节至 pH 2 0 4 冰箱沉淀过夜后 4 8 000 r min 1 离心 20 min 取上清液 用甲醇溶解沉淀 并采用 1 mol L 1 NaOH 调节至 pH 7 0 室温萃取 8 h 4 10 000 r min 1 离心 20 min 取上清液 同样方法萃取 3 次 合并萃取液 以腐皮镰刀菌 F solani BM1 为指示菌 采用琼脂扩散法测定脂肽粗提物拮抗效果 田丹丹 等 2020 用 28 恒温培养箱中生长 7 d 的病原菌制备成孢子悬浮液 并调整浓度至 10 7 CFU mL 1 分 别与稀释 10 10 2 10 3 10 4 倍的脂肽粗提液按照 1 1 混合 以无菌 NB 培养液与孢子悬浮液等体 积混合为对照 每组试验重复 3 次 于 28 下 180 r min 1 振荡培养 10 h 观察孢子萌发情况 计 算孢子萌发抑制率 2 结果与分析 2 1 拮抗菌的分离筛选 从新疆喀什地区伽师县盐碱地土壤中共分离纯化出 58 株细菌菌株 通过平板对峙试验 筛选 何亚芳 包慧芳 王 宁 詹发强 张学军 史应武 杨 蓉 侯新强 龙宣杞 甜瓜镰刀菌果腐病菌拮抗菌筛选及其拮抗性研究 园艺学报 2023 50 10 2257 2270 2261 出 11 株对甜瓜果腐病病原菌有较强拮抗作用的菌株 其中 5 株抑菌带宽度大于 5 mm 表 1 菌株 JS6 1 与 JS3 4 的抑菌带宽度最宽 分别为 7 39 和 6 67 mm 拮抗效果较强 表 1 图 1 采用琼脂扩散法对初筛所获得的 5 株具有较强抑菌活性的菌株进行复筛 发现菌株 JS6 1 和 JS3 4 的发酵上清液对甜瓜果腐病病原菌的抑制效果显著高于其他菌株 其抑菌圈直径分别为 22 90 和 21 05 mm 表 1 图 1 表 1 甜瓜镰刀菌果腐病菌拮抗菌筛选结果 Table 1 Screening results of antagonistic bacteria against Fusarium melon fruit rot 菌株 Strain 抑菌带宽度 mm Inhibition zone width 发酵上清液抑菌圈直径 mm The fermentation supernatant inhibition zone diameter JS6 1 7 39 0 07 a 22 90 0 74 a JS3 4 6 67 0 08 b 21 05 0 28 b JS1 1 5 74 0 17 c 13 29 0 11 c JS55 2 5 12 0 11 d 9 81 0 47 d JS15 5 08 0 21 d 9 27 0 30 d 注 表中数据为平均值 标准差 同列不同字母表示差异显著 P 0 05 Note The data were average SD The different letters indicate significant difference at 0 05 level 图 1 拮抗菌 JS6 1 A JS3 4 B 及其发酵上清液 C 对腐皮镰刀菌的拮抗作用 Fig 1 Antagonistic effect of antagonistic bacteria JS6 1 A JS3 4 B and their fermentation supernatant C on Fusarium solani 2 2 拮抗菌抑菌谱测定 拮抗菌 JS6 1 和 JS3 4 对供试 9 株病原菌都有不同程度的抑制作用 表现出较明显的广谱性抑 制效果 抑菌率为 50 76 表 2 图 2 菌株 JS6 1 对病原真菌 KW1 ZN6 和 ZN18 的拮抗效 果优于 JS3 4 而 JS3 4 对病原真菌 ZN5 ZN12 和 ZN19 的拮抗效果优于 JS6 1 表 2 拮抗菌 JS6 1 和 JS3 4 的抑菌谱 Table 2 Antibacterial spectrum of antagonistic bacteria JS6 1 and JS3 4 病原菌 抑菌率 Inhibition rate Pathogen JS6 1 JS3 4 香梨腐烂病菌 Valsa mali var pyri FL1 58 02 1 28 c 59 26 1 44 b 马铃薯黑痣病菌立枯丝核菌 Rhizoctonia solani ZN5 51 85 0 42 de 56 79 1 28 bc 番茄早疫病菌茄链格孢菌 Alternatia solani ZN18 58 02 1 26 c 53 09 1 91 de 核桃腐烂病 Cytcospora sp ZN19 70 41 2 22 a 75 37 1 18 a 甜瓜枯萎病 Fusarium oxysporum KW1 59 32 0 84 c 54 60 0 74 cd 水稻恶苗串珠镰刀菌 F moniliforme ZN12 54 26 1 48 d 58 52 1 29 b 马铃薯早疫病菌茄病链格孢菌 A solani ZN6 62 28 1 18 b 57 72 2 17 bc 西瓜枯萎病尖孢镰刀菌 F oxysporum ZN10 50 12 0 65 e 50 65 1 01 e 香梨黑斑病菌链格孢菌 A alternata HB2 58 25 1 26 c 57 98 1 87 bc He Yafang Bao Huifang Wang Ning Zhan Faqiang Zhang Xuejun Shi Yingwu Yang Rong Hou Xinqiang Long Xuanqi Screening of antagonistic bacteria against Fusarium spp causing melon fruit rot and the antagonistic properties 2262 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2257 2270 图 2 拮抗菌 JS6 1 和 JS3 4 抑菌谱图 Fig 2 Antibacterial spectrum of antagonistic bacteria JS6 1 and JS3 4 2 3 拮抗菌鉴定 2 3 1 形态学鉴定 拮抗菌株 JS6 1 菌落为圆形 白色 不透明 边缘不整齐 表面褶皱 革兰氏染色呈阳性 菌 体杆状 拮抗菌株 JS3 4 菌落呈圆形 乳白色 表面干燥有褶皱 革兰氏染色呈阳性 菌体杆状 图 3 图 3 拮抗菌 JS6 1 和 JS3 4 菌落及菌体形态 Fig 3 Colony and morphology of antagonistic bacteria JS6 1 and JS3 4 2 3 2 拮抗菌生理生化测定 对上述两株拮抗菌的生理生化特性 表 3 进行分析 对碳源的利用试验表明 两株菌均可利 何亚芳 包慧芳 王 宁 詹发强 张学军 史应武 杨 蓉 侯新强 龙宣杞 甜瓜镰刀菌果腐病菌拮抗菌筛选及其拮抗性研究 园艺学报 2023 50 10 2257 2270 2263 用葡萄糖 淀粉 甘油 果糖 蔗糖 甘露醇 麦芽糖 海藻糖 但对乳糖的利用存在一定差异 且均不可利用鼠李糖和壳聚糖 对氮源利用试验结果表明 两株菌均可利用硫酸铵 L 酪氨酸 草酸铵 磷酸二氢铵 柠檬酸二铵 但对谷氨酸的利用存在一定差异 两株菌在明胶液化 淀粉水 解 v p 试验和接触酶反应均呈阳性 柠檬酸盐利用 吲哚试验和 H 2 S 试验均呈阴性 而甲基红试 验中两株菌存在一定差异 对两株菌生长特性进行分析 NaCl 浓度 pH 耐受和温度耐受试验结果 表明 JS6 1 在 NaCl 浓度 2 5 9 5 pH 5 0 11 0 温度 15 50 时生长良好 在 4 条件下 生长较弱 JS3 4 在 NaCl 浓度 2 5 9 0 pH 5 0 9 0 温度 4 50 时生长良好 在 NaCl 浓 度为 9 5 时生长较弱 由此可见 两株菌具有较强的盐碱和温度耐受能力 表 3 拮抗菌生理生化特性 Table 3 Physiological and biochemical characteristics of antagonistic bacteria 指标分类 Index classification 测定指标 Identification index JS6 1 JS3 4 氮源利用 Nitrogen source utilization 硫酸铵 Ammonia sulfate 草酸铵 Sodium oxalate 柠檬酸二铵 Ammonium citrate L 酪氨酸 L tyrosine 磷酸二氢铵 Ammonium dihydrogen phosphate 谷氨酸 Glutamate 碳源利用 Carbon source utilization D 葡萄糖 D glucose 甘油 Glycerinum 蔗糖 Saccharose D 果糖 D fructose 乳糖 Lactose 淀粉 Amylum 甘露醇 Mannitol 鼠李糖 Rhamnose 壳聚糖 Chitosan 海藻糖 Trehalose 麦芽糖 Maltose 其他指标 Other indicators 接触酶反应 Contact enzyme test 柠檬酸盐利用 Citrate utilization 甲基红 Methy red 明胶液化 Liquefy glutin 淀粉水解 Starch hydrolysis V P 试验 V P test 吲哚试验 Indole test 硫化氢 Hydrogen sulfide 生长特性 Growth characteristics NaCl 浓度 NaCl concentration 2 5 9 5 2 5 9 0 生长温度 Growth temperature 15 50 4 50 pH 5 0 11 0 5 0 9 0 注 阳性 阴性 Note Positive Negative 2 3 3 分子生物学鉴定 结果显示 菌株 JS6 1 与贝莱斯芽孢杆菌同源性达 99 以上 菌株 JS3 4 与暹罗芽孢杆菌同源 性达 99 以上 采用 MEGA7 0 软件构建系统发育树 图 4 结果表明 菌株 JS6 1 与贝莱斯芽孢 杆菌在系统发育树的同一个分支上 根据菌株的形态学特征 生理生化试验及 16S rRNA 基因分子 鉴定 此菌株初步鉴定为贝莱斯芽孢杆菌 基因登录号为 ON799151 菌株 JS3 4 与暹罗芽孢杆菌在 系统发育树的同一个分支上 根据菌株的形态学特征 生理生化试验及 16S rRNA 基因分子鉴定 此菌株初步鉴定为暹罗芽孢杆菌 基因登录号为 ON799152 He Yafang Bao Huifang Wang Ning Zhan Faqiang Zhang Xuejun Shi Yingwu Yang Rong Hou Xinqiang Long Xuanqi Screening of antagonistic bacteria against Fusarium spp causing melon fruit rot and the antagonistic properties 2264 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2257 2270 图 4 基于 16S rRNA 序列构建的菌株 JS6 1 和 JS3 4 系统发育树 Fig 4 Phylogenetic tree of JS6 1and JS3 4 based on 16S rRNA gene sequences 2 4 拮抗菌菌株的生长曲线 由图 5 可以看出 菌株 JS6 1 在培养 2 4 h 处于延迟生长期 4 10 h 处于对数生长期 10 h 后进入稳定期 72 h 后进入衰退期 菌株 JS3 4 在 2 4 h 处于延迟生长期 4 12 h 处于对数生长 期 12 h 后进入稳定期 生长速度相对稳定 由此可知 可选取培养 10 12 h 的培养液作为两株菌 种子液 图 5 菌株 JS6 1 和 JS3 4 生长曲线 Fig 5 Growth curves of strains JS6 1 and JS3 4 2 5 拮抗菌菌株产铁载体的能力 铁载体可通过和病原菌竞争铁元素从而达到抑制病原菌生长的效果 是一种重要的生防因子 由图 6 可以看出 拮抗菌 JS6 1 和 JS3 4 在 MKB CAS 培养基上生长良好 两株菌周围出现橙黄色 的显色反应以及晕圈 表明两菌株均可产生铁载体 如表 4所示 菌株 JS6 1的 As Ar的比值为 0 689 铁载体活性为 31 10 菌株 JS3 4 的 As Ar 的比值为 0 789 铁载体活性为 21 11 这表明菌株 JS6 1 分泌铁载体的能力优于菌株 JS3 4 何亚芳 包慧芳 王 宁 詹发强 张学军 史应武 杨 蓉 侯新强 龙宣杞 甜瓜镰刀菌果腐病菌拮抗菌筛选及其拮抗性研究 园艺学报 2023 50 10 2257 2270 2265 表 4 拮抗菌 JS6 1 和 JS3 4 产铁载体能力 Table 4 The ferritic capacity of antagonistic bacteria JS6 1 and JS3 4 菌株编号 Strain number As Ar 铁载体活性 Siderophore activity JS6 1 0 689 0 008 31 10 0 06 JS3 4 0 789 0 015 21 11 0 11 2 6 拮抗菌菌株产酶的能力 2 6 1 溶菌酶定性测定 利用选择性培养基检测拮抗菌的产酶活性 产生透明圈代表菌株次生代谢物中含有相应的酶 结果表明 菌株 JS6 1 和 JS3 4 在淀粉酶 蛋白酶 纤维素酶和葡聚糖酶 4 种检测培养基上均能产 生脱色圈或透明圈 但在几丁质酶检测培养基上未形成水解圈 说明两菌株在生长代谢过程中均产 生纤维素酶 蛋白酶 淀粉酶和葡聚糖酶 图 6 可能不产几丁质酶 或产几丁质酶能力比较弱 图 6 纤维素酶 A 蛋白酶 B 淀粉酶 C 和葡聚糖酶 D 选择性培养基检测及产铁载体 E 检测 Fig 6 Cellulase A protease B amylase C and glucanase D selective medium detection and siderophore detection E 2 6 2 溶菌酶活性测定 结果 图 7 表明 菌株 JS6 1 和 JS3 4 在发酵期间产蛋白酶 纤维素酶 淀粉酶和葡聚糖酶的 能力整体呈现先升高后降低的趋势 在发酵 96 h 时产蛋白酶活最高 分别为 13 55 和 13 05 U mL 1 菌株 JS6 1 纤维素酶活在发酵 72 h 最高 为 5 55 U mL 1 而菌株 JS3 4 纤维素酶活在发酵 48 h 最 高 为 6 15 U mL 1 菌株 JS6 1 和 JS3 4 在发酵 48 h 产淀粉酶和葡聚糖酶活最高 分别为 2 5 和 2 59 U mL 1 5 43 和 7 66 U mL 1 综上所述 菌株 JS3 4 除蛋白酶外 其他 3 种酶均为 48 h 酶活 最高 而 JS6 1 除蛋白酶和纤维素酶外 其他两种酶均为 48 h 酶活最高 菌株 JS6 1 产蛋白酶活较 JS3 4 高 而发酵 48 h 后 JS3 4 产葡聚糖酶活较 JS6 1 高 两株菌产纤维素酶活和淀粉酶活能力相 当 He Yafang Bao Huifang Wang Ning Zhan Faqiang Zhang Xuejun Shi Yingwu Yang Rong Hou Xinqiang Long Xuanqi Screening of antagonistic bacteria against Fusarium spp causing melon fruit rot and the antagonistic properties 2266 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2257 2270 图 7 菌株 JS6 1 和 JS3 4 的产酶活性 Fig 7 The enzyme activity of strain JS6 1 and JS3 4 was determined 2 7 拮抗菌脂肽粗提物对甜瓜镰刀菌果腐病的抑制作用 菌株 JS6 1 和 JS3 4 发酵上清液中的脂肽类粗提物对甜瓜果腐病致病菌抑菌圈直径分别为 20 55 和 19 05 mm 图 8 说明两株菌脂肽类粗提物都能对致病菌腐皮镰刀菌起较明显的抑制作用 且 抑菌效果无显著差异 图 8 菌株 JS6 1 和 JS3 4 脂肽类粗提物对致病菌的拮抗作用 Fig 8 Antagonistic effects of crude lipopeptide extracts JS6 1 and JS3 4 on pathogenic bacteria 2 8 拮抗菌脂肽类粗提物对病原菌孢子萌发的影响 从表 5 可知 菌株 JS6 1 和 JS3 4 脂肽类粗提物对甜瓜果腐病致病菌孢子萌发的抑制率随着稀 何亚芳 包慧芳 王 宁 詹发强 张学军 史应武 杨 蓉 侯新强 龙宣杞 甜瓜镰刀菌果腐病菌拮抗菌筛选及其拮抗性研究 园艺学报 2023 50 10 2257 2270 2267 释倍数的升高而降低 其原液对孢子萌发的抑制作用最强 抑制率分别为 100 00 和 93 77 在显 微镜下观察发现 与对照相比 脂肽类粗提物不仅影响孢子萌发 而且使萌发的孢子牙管变形 表 5 菌株 JS6 1 和 JS3 4 脂肽类粗提物稀释倍数对致病菌孢子萌发的影响 Table 5 Antagonistic effects of l