不同栽培基质对铁皮石斛根基因表达的影响_陈宏宇.pdf

收稿日期 修订日期 基金项目 贵州省科技计划项目 黔科合基础 一般 贵州中医药大学博士启动基金 贵中医博士启动 号 作者简介 陈宏宇 男 汉族 黑龙江齐齐哈尔人 贵州中医药大 学讲师 博士学位 主要从事药用植物研究工作 不同栽培基质对铁皮石斛根基因表达的影响 陈宏宇 于 莹 杨 烨 黄 园 孙庆文 贵州中医药大学药学院 贵州贵阳 贵州中医药大学基础医学院 贵州贵阳 摘要 目的为了研究铁皮石斛根在不同栽培基质下的基因表达差异和调控通路 方法对栽培于碎松树皮 泥炭土等 种基质中的铁皮石斛根部进行转录组测序并比较分析 结果从全部样本中共获得 条单基因 其中 个单基因在 等 个数据库中获得注释 与对照相比 栽培于碎松树皮 泥炭土 水苔 碎花生壳 刨花 椰 糠和森林腐叶土中的铁皮石斛根分别有 和 个差异表达基因 结论实验 说明不同栽培基质对铁皮石斛根部的基因表达有较大影响 这些差异表达基因可能是铁皮石斛适应不同栽培基质的重 要分子机理 对深入研究铁皮石斛人工栽培技术提供参考和帮助 关键词 铁皮石斛 基质 转录组 基因 标识 中图分类号 文献标识码 文章编号 铁皮石斛 是兰科石斛属 的名贵药用植物 铁皮石斛性微寒 味甘 滋阴清热 益胃生津 主要用于热病伤津 病后虚热 口干烦渴的治疗 现代药理学表 明 铁皮石斛具有降血糖 抗衰老 增强人体免疫力和促进消化等 作用 铁皮石斛生长环境要求高 自然繁殖缓慢 野生资源 急剧减少 为了满足市场需要 目前主要通过附石 附树或大棚 等仿野生栽培对铁皮石斛进行人工种植 除种苗质量 温湿 度 光照和病虫害等常见因素外 栽培基质对铁皮石斛的成活率 产量和品质有重要影响 研究铁皮石斛在不同栽培基质中的 基因表达差异 揭示分子调控机制 可为铁皮石斛人工栽培工作 提供帮助 铁皮石斛栽培基质要求通风 透水 营养适合以及良好的微 生物环境 常用的基质包括松树皮 苔藓 泥炭 木屑等 混合一 定比例的天然矿物 对铁皮石斛的生长发育和药效物质形成有较 好作用 例如 研究表明在铁皮石斛组培苗移栽驯化时期 细陶 粒 腐殖土 珍珠岩 刨花 椰糠 木炭 松树皮 红火山岩 和松树皮 木屑 等 基质的移栽成活率较高 在铁皮石斛大棚栽培时期 移栽 后 松树皮 锯末 碎瓦片 的株高为 茎粗为 泥炭 树皮 刨花 的株高为 茎粗 为 松鳞 碎石子 刨花 的株高为 茎粗为 松树皮 香菇废菌糠 的株高为 茎粗为 利用高效液相色谱法 研究了松树皮 椰子椰壳和松树皮 椰子椰壳 种基质对铁皮石斛茎代 谢物的影响 实验说明不同栽培基质或不同基质组合对铁皮 石斛人工栽培有较大影响 转录组是细胞或组织内全部 转录本的总和 高通量测 序技术用于大规模分析基因表达并识别基因调控通路 转录 组测序在铁皮石斛功能基因识别 生长发育机制和分子标记等方 面有广泛应用 利用铁皮石斛茎转录组数据 识别石斛碱等多种 次生代谢产物生物合成关键基因 利用数字基因表达谱对铁 皮石斛茎不同发育阶段进行基因表达比较 识别茎发育关键基 因 利用铁皮石斛低温胁迫转录组 预测 和 等 低温调控基因 利用不同发育程度铁皮石斛转录组 研究果 糖和甘露糖等多糖合成基因 利用铁皮石斛早期 中期花蕾 和开放花朵转录组 识别 叶绿素和类胡萝卜素生物合成 关键基因 栽培基质对铁皮石斛的生长发育有重要影响 为了探究铁 皮石斛在不同栽培基质下的基因应答机制 本研究对栽培于碎松 树皮 泥炭土 水苔 碎花生壳 刨花 椰糠和森林腐叶土中的铁皮 石斛根进行转录组测序并比较分析 利用基因表达差异和基因 调控通路 初步揭示铁皮石斛根在不同栽培基质中的应答信息 为铁皮石斛人工栽培研究提供参考 时珍国医国药 年第 卷第 期 材料与方法 试验材料铁皮石斛由本实验室提供 初始基质为碎松树皮 刨花 人工气候室 光照 天 经贵州中医药 大学杨烨鉴定准确 取生长发育程度基本相同的植株 小心冲洗 去除原栽培基质后 静置 期间每天向根喷水保湿 待处理 时 将植株分为 组 其中 组继续保湿放置作为 对照 另外 组分别用碎松树皮 泥炭土 水苔 碎花生壳 刨花 椰糠和森林 腐叶土仔细覆盖根部 喷水保湿 后 洗净根部基质 各取等 量样本 混样液氮冷冻 提取与测序利用 提取 去除 检查 质量和纯度后反转录 利用 平台进行测序 原始测 序数据利用软件 去除接头序列 即接头污染 含 碱基大于 以及低质量读序 即质量值低于 的碱基 占该 总碱基数比例大于 利用 程序 从头拼接组装 拼接 聚类和去冗余处理后 得到非 冗余单基因 序列 利用 和 等数据 库进行基因注释 基因表达与调控通路分析利用 程序 的 方法计算基因 表达量 利用 计算差异表达基因 以 个样本间基因 表达差异 大于 倍 且 定义为显著差异表达 基因 利用 数据库 对差异表达基因 进行聚类分析 定义为显著富集 利用 数 据库 对基因进行调控 通路注释 推测基因生物功能 结果 测序与注释对铁皮石斛根 个对照和 个处理 共 个样 本进行测序 去除低质量数据后 分别获得 和 的 数据 所有样本 检测值均大于 检测值均大于 从头组装后 共获得 条长的 非冗余单基因 在单基因中识别编码区 共得到 个 序 列 长度分布在 之间 含量为 利用 和 数据库分别 注释了 和 个单基 因 共 个单基因 其中 个数据库均有注释的基因有 个 差异表达基因分析不同基质对铁皮石斛根诱导基因表达 的数量不同 经过计算 与对照相比 栽培于碎松树皮 泥炭土 水苔 碎花生壳 刨花 椰糠和森林腐叶土中的铁皮石斛根分别有 和 个差异表达基 因 表 结果表明 铁皮石斛根接触基质后均发生较大程度的 基因表达变化 说明基质中所含的营分或其它成分对根部产生了 强烈信号 并引起相应基因表达 而且不同栽培基质对铁皮石斛 根基因表达有较大差异 水苔和刨花对根基因表达的影响相对 较小 而其它基质对根基因表达的影响相对较大 其中 碎花生 壳对根上调表达基因最多 表 铁皮石斛在不同栽培基质下的差异表达基因数量 基质种类上调表达基因下调表达基因总差异表达基因 碎松树皮 泥炭土 水苔 碎花生壳 刨花 椰糠 森林腐叶土 基因调控通路分析利用 聚类分析对显著差异表达基 因进行功能分类 研究具有相同代谢过程或细胞途径的基因类 群 结果表明 铁皮石斛根对于不同基质应答基因有 个显著 富集功能聚类 分为 大类 生物过程 细胞组 分 和分子功能 分别有 和 个功能聚类 表 结果表明 不同基质对根基因表 达影响在基因类别上是不同的 如生物过程类别中的生物粘附 功能基因 水苔基质对应的应答基因有 个 明显多于其它基 质 而生物间相互作用的生物学过程功能基因 水苔基质和刨花 基质对应的应答基因分别有 个和 个 明显低于其它基质 总体上 生物过程类别中的细胞过程和代谢过程 细胞组分类别 中的细胞结构体 分子功能类别中的结合和催化活性等包含的差 异表达基因数量最多 这些基因可能是铁皮石斛应答基质的关 键基因 同时 不同基质间的基因分类差异可能是铁皮石斛应答 不同基质的关键基因 表 铁皮石斛差异表达基因的 聚类分析 类别分类差异表达基因 数量碎松树皮泥炭土水苔碎花生壳刨花椰糠森林腐叶土 生物过程生物粘附 生物间相互作用的生物学过程 生物种内相互作用的生物学过程 生物调节 碳利用率 细胞过程 解毒 发育过程 生长 免疫系统过程 定位 移动 代谢过程 多细胞生物过程 生物过程负调节 氮利用 生物过程的正调节 生物过程调控 生殖 生殖过程 刺激应答 节律过程 信号 病毒过程 时珍国医国药 年第 卷第 期 续表 类别分类差异表达基因 数量碎松树皮泥炭土水苔碎花生壳刨花椰糠森林腐叶土 细胞组分细胞结构体 含蛋白质复合物 分子功能抗氧化活性 依赖性活性 结合 运货受体活性 催化活性 细胞骨架运动活性 一般转录起始因子活性 分子接头活性 分子载体活性 分子功能调控因子 分子转导活性 养分储存活性 蛋白质折叠伴侣 蛋白质标签 小分子感受活性 结构分子活性 毒素活性 转录调控活性 翻译调控活性 转运活性 利用 数据库对差异表达基因进行生物学功能分析 推 测参与生化代谢或信号转导途径基因的相互协调特征 结果表 明 铁皮石斛根对于不同基质应答基因归属通路分为 大类 细 胞过程 环境信息过程 遗传信息过程 代谢和生物系统分别有 和 个通路 表 结果表明 不同基质对根基因表达 影响在调控通路上是不同的 如遗传信息分类中的复制和修复 通路基因 刨花基质对应的应答基因有 个 明显少于其它基 质 总体上 代谢分类中的定位通路包含的差异表达基因数量最 多 细胞过程分类中的转运和分解代谢通路 环境信息过程分类 中的信号转导通路 遗传信息分类中的折叠 分类和降解 转录和 翻译通路 代谢分类中的氨基酸代谢 次级代谢产物生物合成 碳 水化合物代谢 能量代谢 脂质代谢 辅助因子和维生素的代谢通 路 生物系统分类中的环境适应通路也包含了较多差异表达基 因 与 功能聚类类似的 这些基因可能是铁皮石斛应答基质 和不同基质差异的关键基因 表 铁皮石斛差异表达基因的 分析 类别分类差异表达基因 数量碎松树皮泥炭土水苔碎花生壳刨花椰糠森林腐叶土 细胞过程转运和分解代谢 环境信息过程膜转运 信号转导 遗传信息折叠 分类和降解 复制和修复 转录 翻译 代谢氨基酸代谢 次级代谢产物生物合成 碳水化合物代谢 能量代谢 定位 聚糖生物合成和代谢 脂质代谢 辅助因子和维生素的代谢 其它氨基酸代谢 萜类化合物和聚酮类化合物代谢 核苷酸代谢 生物系统环境适应 转录因子转录因子主要调控其它基因表达 本实验基因 中 有 个被注释为转录因子 表 列举了几种转录因子在 不同基质中的表达差异 钙调蛋白结合转录激活因子 受钙调蛋白 的 调控 参与植物生长发育过程和非生物胁迫耐受调控 本实 验识别了 个可能的 基因 表 在碎松树皮 泥炭土 碎花生壳 椰糠和森林腐叶土中被诱导表达 是乙烯信号重 要转录因子 的同源基因 与植物发育 过程有关 本实验识别了 个可能的 基因 表 包括 个乙烯敏感性 类似蛋白 和 个乙烯不敏感 类似蛋白 除水苔和刨花外 乙烯敏感性 类似蛋白 被诱导表达的程度 高于乙烯不敏感 类似蛋白 家族 是一类转录抑制因子 与其它转录因子互作或直接调控靶基因表 达 进而调控植物生长发育 本实验识别了 个可能的 基因 表 注释为转录抑制因子 在水 苔基质中被明显诱导表达 氮元素吸收相关基因 基因家族是硝酸盐转运 肽转 运蛋白 的统 称 运输羧酸盐 生长素 脱落酸和硫代葡萄糖苷等物质 与氮元 素吸收有关 表 列举了部分与氮元素吸收有关的基因及其 在不同基质中的表达量差异 本实验识别了 个可能的 基 因 表 和 注释为 家 族转运蛋白 只在水苔基质中被诱导表达 其余基因在碎松树 皮 泥炭土 碎花生壳 椰糠和森林腐叶土中被诱导表达 如 注释为 家族 在碎松树皮 泥炭土 和森林腐叶土中被明显诱导表达 时珍国医国药 年第 卷第 期 表 铁皮石斛几种转录因子在不同栽培基质下的表达量 基因家族基因 编号基因注释 对照碎松树皮泥炭土水苔碎花生壳刨花椰糠森林腐叶土 钙调素结合转录激活剂 样亚型 钙调素结合转录激活剂 样亚型 钙调素结合转录激活剂 样亚型 钙调素结合转录激活剂 样亚型 假定蛋白 蛋白 类似 蛋白 类似 乙烯敏感性 类似蛋白 乙烯不敏感 类似蛋白 乙烯敏感性 类似蛋白 乙烯敏感性 类似蛋白 乙烯敏感性 类似蛋白 乙烯不敏感 类似蛋白 同源盒蛋白结合 类似 亚型 同源盒蛋白结合 类似 同源盒蛋白结合 类似 亚型 同源盒蛋白结合 类似 同源盒蛋白结合 类似 亚型 同源盒蛋白结合 类似 亚型 转录抑制因子 转录抑制因子 转录抑制因子 假定蛋白 转录抑制因子 转录抑制因子 锌指同源结构域蛋白 锌指同源结构域蛋白 简化的锌指蛋白 锌指同源结构域蛋白 类似 简化的锌指蛋白 类似 表 铁皮石斛氮吸收相关基因在不同栽培基质下的表达量 基因家族基因 编号基因注释 对照碎松树皮泥炭土水苔碎花生壳刨花椰糠森林腐叶土 家族转运蛋白 家族转运蛋白 家族 类似 家族 亚基 家族 家族 亚基 家族 家族 类似 家族 亚基 硝酸盐转运蛋白 家族 家族 亚基 家族 亚基 家族 亚基 家族 亚基 家族 亚基 预测的肽 硝酸盐转运蛋白 高度关联硝酸盐转运蛋白 家族 家族 类似 家族 家族 家族 亚基 预测的肽 硝酸盐转运蛋白 硝酸盐转运蛋白 家族 亚基 硝酸盐转运蛋白 家族 预测的肽 硝酸盐转运蛋白 家族 家族 亚基 家族 亚基 生长调控因子 类似 生长调控因子 生长调控因子 生长调控因子 信号相关基因 是促分裂原活化蛋白激酶 家族 分为 和 按信 号来源分类 分别逐级激活调控下游其它基因的表达 表 列举 了识别得到的 基因和 基因 及其在不同基质中的表 达量差异 本实验识别了 个可能的 基因 表 在不同基 质中呈现多样的表达方式 如 注释为 在 水苔基质中被明显诱导表达 注释为 在刨 花基质中被明显诱导表达 注释为 亚基 时珍国医国药 年第 卷第 期 在椰糠基质中被明显诱导表达 表 铁皮石斛 和 基因在不同栽培基质下的表达量 基因家族基因 编号基因注释 对照碎松树皮泥炭土水苔碎花生壳刨花椰糠森林腐叶土 亚基 类似 类似亚基 亚基 亚基 类似 亚基 类似 类似 同系物 预测的 类似 类似 亚基 亚基 类似亚基 亚基 类似 亚基 类似 亚基 类似 预测的 类似 部分 类似 类似 亚基 是钙依赖性蛋白激酶 家族 是植物重要的 感受器之一 将 信号转为磷 酸化级联反应 在植物发育和环境信号转导中起重要作用 表 列举了部分 基因家族及其在不同基质中的表达量差 异 本实验识别了 个可能的 基因 表 与 家 族类似 在不同基质中也呈现多样的表达方式 如 注释为 在水苔基质中被明显诱导表达 注释为 在碎松树皮 碎花生壳 椰糠和森林 腐叶土中被明显诱导表达 但在泥炭土中诱导不明显 表 铁皮石斛 基因在不同栽培基质下的表达量 基因 编号基因注释 对照碎松树皮泥炭土水苔碎花生壳刨花椰糠森林腐叶土 类似 类似 类似 类似 类似亚基 类似 部分 类似亚基 类似 类似 时珍国医国药 年第 卷第 期 讨论 铁皮石斛是名贵的药用植物 栽培基质是其人工种植的重要 影响因素之一 关于铁皮石斛基质对生长发育和药用品质的影 响已有较多报道 也因此总结获得了大量利于其种植的基质或基 质组合 但是 铁皮石斛为代表的石斛属植物在不同栽培 基质中的应答分子调控机制尚不明确 涉及的关键基因也未探 明 本研究利用松树皮 泥炭土等 种常见栽培基质对铁皮石斛 根进行诱导处理 并对其进行转录组测序 探讨铁皮石斛在不同 基质中的差异表达基因及其功能分类和调控通路 为揭示铁皮石 斛应答不同基质的分子机制奠定基础 本实验发现铁皮石斛在碎松树皮 泥炭土 水苔 碎花生壳 刨花 椰糠和森林腐叶土 种基质中均有很多基因被不同程度地 诱导表达 说明铁皮石斛根在接触这些基质后 都产生明显的信 号响应 根据差异基因的数量 发现碎松树皮 泥炭土 碎花生 壳 椰糠和森林腐叶土基质对铁皮石斛基因的影响较大 而水苔 和刨花基质对其基因的影响相对较小 可能与碎松树皮等基质 包含更为丰富的营养物质有关 而水苔和刨花基质能提供给石斛 的养分物质可能较少 或是其诱导基因相对较少的主要原因 转录组测序技术的优势是相对完整的反应全部基因的表达 本实验通过几个热点基因类别对分子调控机制进行分析 转录 因子是一个很大的基因类别 也是在机体中起到关键调控作用的 基因之一 本实验通过基因注释 识别了 个转录因子 选 择了几种与植物生长发育和环境胁迫应答有关的几种转录因子 进行列举 表 此外 在表 中列举了氮元素吸收有关的几个 典型基因 表 和表 分别列举了细胞中信号的相关基因 家族和 家族 通过这些基因在碎松树皮 泥炭土 水苔 碎 花生壳 刨花 椰糠和森林腐叶土 种基质中的表达量差异 为揭 示铁皮石斛在不同基质的响应机制提供参考 虽然这些零散的 基因表达数据尚不能形成完整的分子响应机制 但是随着研究的 深入 以及对基因功能的挖掘与验证 能逐步揭示铁皮石斛根对 基质的适应机理 参考文献 邵 华 张玲琪 李俊梅 等 铁皮石斛研究进展 中草药 宋广青 刘新民 王 琼 等 石斛药理作用研究进展 中草 药 陈文强 汪小福 陈笑芸 等 基于 和 技术鉴定浙江铁 皮石斛的初步研究 浙江农业学报 谭道鹏 何芋岐 石斛类药材人工栽培发展概述 遵义医科大 学学报 陈宜均 李康琴 邓绍勇 等 铁皮石斛栽培基质研究进展 江 西林业科技 李关艳 苏有勇 李思梅 等 铁皮石斛栽培基质的筛选研究 安徽农业科学 陈宝玲 陈 尔 王华新 等 不同基质配比对铁皮石斛试管苗移 栽的影响 北方园艺 谢腾飞 张华通 何旭君 等 铁皮石斛组织培养工厂化育苗及原 生态栽培技术研究 特产研究 张华通 吴坤林 何旭君 等 金钗石斛工厂化育苗试管苗移栽技 术研究 中国热带农业 兰 海 潘宏兵 和献锋 等 铁皮石斛种植基质筛选研究 四 川林业科技 吴 雅 史骥清 滕士元 等 铁皮石斛组培苗移栽基质的筛选 现代农业科技 刘洪见 肖三哲 郑 坚 等 铁皮石斛栽培基质的筛选 浙江 农业科学 胡传久 李海波 陈友吾 等 香菇废菌糠栽培铁皮石斛的研究 食药用菌 王尧龙 黄璐琦 袁 媛 等 药用植物转录组研究进展 中国 中药杂志 时珍国医国药 年第 卷第 期