西瓜叶斑病病原菌的鉴定及室内药剂筛选_曾蓉.pdf

2024 50 4 310 317PlantProtection 收稿日期 2 0 2 3 0 6 0 7 修订日期 2 0 2 3 0 7 3 1 基金项目 上海市西瓜甜瓜产业技术体系建设 沪农科产字 2 0 2 2 第1号 上海市农业科学院生态所揭榜挂帅 生科 J B 2 0 2 3 2 通信作者E m a i l f u m i n g d a i 1 6 3 c o m 西瓜叶斑病病原菌的鉴定及室内药剂筛选 曾 蓉1 徐丽慧1 陈灏岚2 成 玮3 高 萍1 高士刚1 宋志伟1 戴富明1 1 上海市农业科学院生态环境保护研究所 上海市设施园艺重点实验室 上海 2 0 1 4 0 3 2 上海市浦东新区 农业技术推广服务中心 上海 2 0 1 3 2 3 3 上海市农业技术推广服务中心 上海 2 0 1 7 9 9 摘要 2 0 2 2年在上海市浦东新区西瓜上发生一种深褐色 不规则至近圆形斑的叶部病害 采用组织分离法对病害 样本进行分离 分离物S H C C C 0 1经柯赫氏法则验证具有较强致病性 根据分离物的菌落特征 分生孢子形态 生 物学特征以及基于核糖体内部转录间隔区 i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r I T S 组蛋白基因 h i s t o n e His 真核翻译 延伸因子1 t r a n s l a t i o n e l o n g a t i o n f a c t o r 1 TEF1 和肌动蛋白 a c t i n Act 基因联合系统发育分析等 将病原 菌鉴定为瓜类尾孢Cercosporacitrullina 1 0种杀菌剂对该病原菌的毒力测定试验结果表明 氟啶胺 己唑醇 氟环 唑 戊唑醇等4种药剂对病原菌的抑菌活性较高 其E C 5 0分别为0 3 7 5 2 0 5 7 5 4 1 4 7 2 3 1 8 9 0 2 g m L 这些结 果为西瓜尾孢叶斑病的防控和杀菌剂登记提供了重要依据 关键词 西瓜 瓜类尾孢 多基因序列联合分析 毒力测定 中图分类号 S 4 3 6 5 文献标识码 A DOI 1 0 1 6 6 8 8 j z w b h 2 0 2 3 2 7 9 Identificationofthepathogencausingleafspotonwatermelonand fungicidescreeninginvitro ZENGRong1 XULihui1 CHENHaolan2 CHENGWei3 GAOPing1 GAOShigang1 SONGZhiwei1 DAIFuming1 1 Eco EnvironmentProtectionResearchInstitute ShanghaiKeyLaboratoryofProtectedHorticultureTechnology ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences Shanghai 2 0 1 4 0 3 China 2 PudongDistrictAgro technologyExtension Center Shanghai 2 0 1 3 2 3 China 3 ShanghaiAgro technologyExtensionCenter Shanghai 2 0 1 7 9 9 China Abstract AkindofwatermelonleafspotdiseasewasfoundinPudongdistrict Shanghai Theisolateswere obtainedfromdiseasedsamplesbytissueisolationmethod PathogenicityoftheisolateSHCCC0 1wasverifiedby Koch spostulates Thepathogenwasidentifiedbymorphology biologicalcharacteristics andmultilocus phylogeneticanalysisbasedontheinternaltranscribedspacer ITS histone His translationelongationfactor 1 TEF1 andactin Act Theresultsshowedthatthepathogenofthewatermelonleafspotdiseasewas Cercosporacitrullina Amongthetentestedfungicides fluazinam hexaconazole epoxiconazoleandtebuconazole showedstronginhibitiontohyphalgrowthofC citrullinaisolateSHCCC0 1withtheEC5 0valueof0 3 7 5 2 0 5 7 5 4 1 4 7 2 3and1 8 9 0 2 g mL respectively Theseresultsprovideimportanttheoreticalbasisforcontrolof watermelonCercosporaleafspotdiseaseandregistrationoffungicides Keywords watermelon Cercosporacitrullina multilocusphylogeneticanalysis toxicity 西瓜Citrulluslanatus为一年生蔓生草本植 物 果实甘甜多汁 营养丰富 深受消费者喜爱 西瓜 生长周期短 经济价值高 深受种植户喜爱 据 F A O统计 2 0 2 1年我国西瓜种植面积为1 4 1万h m 2 左右 产量约为6 1 0 1万t w w w f a o o r g 上海市 西瓜常年种植面积约为2 0 0 0 h m 2 不仅是上海市郊 区农业致富的重要产业 也是品牌农业 休闲农业 生态农业的重要载体 西瓜在生长过程中会受到多 5 0卷第4期曾蓉等 西瓜叶斑病病原菌的鉴定及室内药剂筛选 种病害的侵袭 常发的病害有蔓枯病 白粉病 炭疽 病 叶斑病等 这些病害严重影响西瓜的产量和 品质 2 0 2 2年7月 本研究组在上海市浦东新区调查 时发现 多个农户的种植大棚中出现一种症状相似 的叶部病害 严重时整叶枯黄 影响植株光合作用和 正常生长 田间株发病率5 0 以上 为明确引起该 病害的病原菌 本研究对典型症状病样进行组织分 离 纯化 培养 并结合病原菌形态 生物学特征 致 病性 多基因联合系统发育分析对分离物进行鉴定 以明确引起上海市西瓜叶斑病的病原菌种类 并开 展了药剂室内毒力测定 以期为该病害的防控提供 参考 1 材料与方法 1 1 材料 病样 于上海市浦东新区公平村西瓜种植户采 集有典型病害症状的西瓜叶片 琼脂 葡萄糖 二甲基亚砜等生化试剂购自中国 医药集团有限公司 2 TaqM a s t e r M i x L o t P 1 1 2 0 1 购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司 2 k p l u s D N A M a r k e r购自北京全式金生物技术有 限公司 1 0种供试杀菌剂原药及来源 9 8 氟啶胺原药 江西禾田科技有限公司 9 5 4 己唑醇原药 江苏 七洲绿色化工股份有限公司 9 8 氟环唑原药 江 苏七洲绿色化工股份有限公司 9 7 戊唑醇原药 江苏七洲绿色化工股份有限公司 9 7 咪鲜胺原 药 上海悦联化工有限公司 9 8 嘧菌酯原药 山东 京博农化科技股份有限公司 9 8 氟吡菌酰胺原药 拜耳股份公司 9 5 2 苯醚甲环唑原药 上海生农 生化制品股份有限公司 9 6 9 异菌脲原药 江西 禾益化工股份有限公司 9 8 氟唑菌酰胺原药 巴 斯夫欧洲公司 1 2 试验方法 1 2 1 症状观察 2 0 2 2年7月 在上海市浦东新区公平村西瓜种 植户 观察西瓜叶斑病危害症状及程度等 1 2 2 病原菌的分离与纯化 将有典型症状的发病初期叶片洗净 在自来水 下冲洗2 h 按组织分离法分离病原菌 1 在病健交 界处剪取直径6 8 m m的圆形病斑 用2 次氯酸 钠浸泡消毒2 3 m i n 然后用灭菌水清洗3次 在无 菌的培养皿内晾干 均匀放置在含有5 0 g m L氯 霉素和5 0 g m L链霉素的P D A培养基上 2 6 黑 暗培养 挑取边缘菌丝到新的P D A培养基上 待分 离物产生孢子后 挑取单个孢子进行分离纯化 分离 物5 保存 1 2 3 分离物的形态学及生物学特性 参考方中达 1 的方法对分离物S H C C C 0 1进 行形态学鉴定 在2 6 下黑暗培养 观察其在P D A 培养基上的菌落特征以及菌丝和分生孢子的显微 形态 同时观察光照对分离物色素产生的影响 先 2 6 全黑暗培养7 d 然后全光照培养 光强度 5 0 0 l x 光源高度4 0 c m 3 d 观察光照对红色素产 生的影响 参考方中达 1 的方法测试菌落生长适宜温度 用打孔器在活化的菌落边缘取直径6 m m的菌饼 接种在P D A培养基中央 设置培养温度范围1 8 3 4 温度梯度2 黑暗培养7 d后 用十字交叉法 测量菌落直径 试验重复4次 1 2 4 致病性测定 将分离物S H C C C 0 1接种于直径9 0 m m的 P D A平板上 2 0 m L培养基 皿 2 6 黑暗培养 1 0 d后 取2个平板的所有培养物连同培养基一 起置于匀浆杯中 加1 0 0 m L无菌水 高速组织捣 碎仪1 0 0 0 0 r m i n匀浆2 m i n 菌悬液终浓度调至 O D 6 0 0 n m 1 5 用手持喷雾器均匀喷雾接种2 3 叶期 早佳一号 西瓜苗2 0株 喷施等量无菌水的 早佳一号 西瓜苗2 0株为对照 在透光的塑料箱 内保湿 在2 6 L D 1 2 h 1 2 h条件下生长 每日观察记录植株发病情况 接种7 d后从发病植 株的叶片发病部位重新分离病原菌 进行柯赫氏法 则验证 1 2 5 病原菌多基因联合鉴定 将分离物S H C C C 0 1在P D A培养基上2 6 培 养7 d后 挑取少量菌丝 参考H a r j u的方法提取真 菌基因组D N A 2 对分离物分别选择核糖体内部 转录间隔区 i n t e r n a l t r a n s c r i b e d s p a c e r s I T S 引物 I T S 1 5 T C C G T A G G T G A A C C T G C G G 3 I T S 4 113 2 0 2 4 5 T C C T C C G C T T A T T G A T A T G C 3 3 组蛋白 基因 h i s t o n e g e n e His 引物h i s f 5 G C A G G T C C A C T G G T G G C A A G G 3 h i s r 5 A T G G T G A C A C G C T T G G C G T G G A 3 4 真核生物翻译延伸 因子1 t r a n s l a t i o n e l o n g a t i o n f a c t o r TEF1 引 物E F 1 7 2 8 F 5 C A T C G A G A A G T T C G A G A A G G 3 E F 1 9 8 6 R 5 T A C T T G A A G G A A C C C T T A C C 3 5 肌动蛋白基因 a c t i n g e n e Act 引物A C T 5 1 2 F 5 A T G T G C A A G G C C G G T T T C G C 3 A C T 7 8 3 R 5 T A C G A G T C C T T C T G G C C C A T 3 6 进 行D N A片段扩增和测序 引物合成及测序委托生 工生物工程 上海 股份有限公司完成 P C R扩增 体系 2 5 L 2 TaqM a s t e r M i x 1 2 5 L 上 下 游引物 1 0 m o l L 各0 5 L 模板D N A 1 L d d H 2 O补充体积至2 5 0 L P C R反应程序参考 各引物出处文献 以暹罗假尾孢Pseudocercosporathailandica C P C 1 0 5 4 7 为外群参考序列 将分离物的序列与 已经发表的I T S His TEF1 Act序列经C l u s t a l x 1 8 3 7 做完全比对 并将两端截齐 相关序列信息见 表1 使用S e q u e n c e M a t r i x 1 8 0软件 8 按I T S His TEF Act顺序连接成多基因联合序列 基于邻 接法 n e i g h b o r j o i n i n g N J 9 设置自展值 b o o t s t r a p s 为1 0 0 0 用M E G A 7构建系统发育树 1 0 表1 本研究所用菌株及其序列信息 Table1 Strainsandtheirsequenceinformationusedinthisstudy 种 S p e c i e s 分离物 I s o l a t e 寄主 H o s t 来源地 R e g i o n G e n B a n k登录号 G e n B a n k a c c e s s i o n n o I T SHisTEF1 Act Cercosporacitrullina 瓜类尾孢I V F C L 0 1 Citrulluslanatus 西瓜中国M Z 4 2 0 1 9 9 M Z 4 3 7 9 8 7 M Z 4 3 7 9 8 4 M Z 4 3 7 9 9 0 C citrullina 瓜类尾孢H G 2 1 0 4 1 4 0 2 Lagenariasiceraria 葫芦中国M Z 4 3 2 7 4 3 M Z 4 3 7 9 9 8 M Z 4 3 7 9 9 6 M Z 4 3 7 9 9 4 C olivascens 马兜铃尾孢C B S 2 5 3 6 7 Aristolochiaclematitis 欧洲马兜铃罗马尼亚N R 1 1 1 7 7 3 J X 1 4 2 6 5 3 J X 1 4 3 3 9 1 J X 1 4 3 1 4 5 C kikuchii 菊池尾孢C B S 1 2 8 2 7 Glycinesoja 野大豆日本N R 1 1 9 6 1 6 D Q 8 3 5 1 6 1 D Q 8 3 5 0 8 8 D Q 8 3 5 1 0 7 C beticola 甜菜尾孢C P C 1 1 5 5 7 Betavulgaris 甜菜意大利N R 1 2 1 3 1 5 A Y 8 4 0 3 9 2 A Y 8 4 0 4 9 4 A Y 8 4 0 4 5 8 C apii 芹菜尾孢C B S 1 1 6 4 5 5 Apiumgraveolens 芹菜德国N R 1 1 9 5 2 5 A Y 8 4 0 3 8 4 A Y 8 4 0 4 8 6 A Y 8 4 0 4 5 0 C pseudochenopodii 藜尾孢C C T U 1 1 7 6 Chenopodiumalbum 藜伊朗N R 1 4 7 2 7 8 K J 8 8 6 1 9 6 K J 8 8 6 3 5 7 K J 8 8 6 0 3 3 C corchori 黄麻尾孢M U C C 5 8 5 Corchorusolitorius 长蒴黄麻日本N R 1 2 0 1 7 2 J X 1 4 2 6 0 4 J X 1 4 3 3 4 2 J X 1 4 3 0 9 6 C alchemillicola 羽衣草尾孢C P C 5 2 5 9 Alchemillamollis 柔毛羽衣草新西兰N R 1 1 1 7 6 9 J X 1 4 2 5 4 1 J X 1 4 3 2 7 9 J X 1 4 3 0 3 3 C fagopyri 荞麦尾孢C B S 1 3 2 6 2 3 Fagopyrumesculentum 荞麦韩国N R 1 4 7 2 6 3 J X 1 4 2 6 1 4 J X 1 4 3 3 5 2 J X 1 4 3 1 0 6 C delaireae 常春藤尾孢C B S 1 3 2 5 9 5 Delaireaodorata 内藤菊南非N R 1 4 7 2 6 1 J X 1 4 2 6 0 7 J X 1 4 3 3 4 5 J X 1 4 3 0 9 9 C pileicola 冷水花尾孢C B S 1 3 2 6 0 7 Pileapumila 透茎冷水花韩国N R 1 4 7 2 6 4 J X 1 4 2 6 5 5 J X 1 4 3 3 9 3 J X 1 4 3 1 4 7 C sojina 大豆尾孢C B S 1 3 2 6 1 5 G soja 野大豆韩国N R 1 4 7 2 6 5 J X 1 4 2 6 8 1 J X 1 4 3 4 1 9 J X 1 4 3 1 7 3 C apiicola 芹菜尾孢C B S 1 1 6 4 5 7 Apiums p 芹属植物委内瑞拉N R 1 1 9 5 2 6 A Y 8 4 0 4 0 1 A Y 8 4 0 5 0 3 A Y 8 4 0 4 6 7 Pseudocercosporathailandica 暹罗假尾孢C P C 1 0 5 4 7 Acaciamangium 马占相思泰国A Y 7 5 2 1 5 6 A Y 7 5 2 2 7 9 D Q 8 3 5 1 0 2 A Y 7 5 2 2 1 7 213 5 0卷第4期曾蓉等 西瓜叶斑病病原菌的鉴定及室内药剂筛选 1 2 6 室内药剂毒力测定 采用菌丝生长抑制法 具体步骤参考刘欣 等 1 1 曾蓉等 1 2 的方法 测试1 0种杀菌剂原药对分 离物S H C C C 0 1的室内毒力 将供试菌株在P D A 平皿上2 6 黑暗培养7 d后 在菌落边缘打取直径 6 m m的菌饼 菌丝面朝下接入含有药剂的P D A平皿 中央 所有药剂用二甲基亚砜 D M S O 溶解成相应 浓度后加入P D A平皿 设置不同浓度梯度 氟啶胺 和己唑醇浓度设置为0 0 5 0 1 0 5 1 0 2 0 g m L 和5 0 g m L 氟环唑和戊唑醇浓度设置为0 1 0 5 1 0 2 0 5 0 g m L和1 0 0 g m L 咪鲜胺 嘧菌酯和氟吡菌酰胺浓度设置为0 5 1 0 5 0 1 0 0 2 0 0 g m L和5 0 0 g m L 苯醚甲环唑 异 菌脲和氟唑菌酰胺浓度设置为1 0 0 5 0 0 1 0 0 0 2 0 0 0 g m L和3 0 0 0 g m L 以上药剂均使用 D M S O溶解 以添加1 0 0 L D M S O的P D A平皿为 对照 每个处理重复4次 2 6 黑暗培养7 d后 用 十字交叉法测量菌落直径 用如下公式计算菌丝生 长抑制率 菌丝生长抑制率 对照菌落直径 处理菌落 直径 对照菌落直径 6 m m 1 0 0 试验数据使用W P S O f f i c e 2 0 2 3进行处理 线 性回归采用D P S 7 0 5进行分析 1 3 计算线性方程 斜率 s l o p e 标准误 S E 卡方值 2 自由度 df 抑制中浓度 E C 5 0 9 5 置信限 2 结果与分析 2 1 田间症状 在夏秋季西瓜设施大棚内 病原物主要侵染西 瓜叶片 表现为发病初期叶片上出现直径1 2 m m 大小深褐色不规则或近圆形斑点 湿度高时发病部 位扩大至1 0 m m或更大斑 病斑褐色 中心部位灰 白色 病斑周围时有黄色 有典型的尾孢病害 蛙眼 状圆斑 严重时整叶枯死 严重影响西瓜正常生长 图1 在调查中发现 上海市主栽西瓜品种 早佳 一号 大都易感病 株发病率高于5 0 图1 西瓜叶斑病田间症状 Fig 1 SymptomsofCercosporaspotonwatermeloninfield 2 2 病原菌形态及生物学特性 组织分离后5 d组织块周围长出灰褐色菌落 菌落边缘菌丝白色 取菌落边缘纯化后 待分离物产 生孢子后 挑取单个孢子进行分离纯化 对5个病 样进行分离 共获得2 0个分离物 命名为S H C C C 0 1 S H C C C 2 0 这些分离物的菌落形态特征 生长速 度基本一致 本研究选取了分离物S H C C C 0 1进行 后续的试验 分离物S H C C C 0 1菌丝在P D A培养基上生长 较慢 紧贴培养基生长 在黑暗条件下 正面白色或 灰色 背面灰褐色或暗褐色 图2 在光照培养条件 下 菌落四周会产生鲜红色或暗红色色素 图3 图2 分离物SHCCC01在PDA上的菌落形态 26 黑暗培养7d Fig 2 ColoniesofisolateSHCCC01onPDAplate incubatedat26 indarkforsevendays 313 2 0 2 4 图3 分离物SHCCC01在PDA上产生的红色素 26 黑暗培养7d 接着连续光照3d Fig 3 RedpigmentofisolateSHCCC01onPDAplate incubatedat26 indarkforsevendays followed bycontinuouslighteningforthreedays 西瓜叶斑病菌菌丝生长最适宜温度是 2 6 在该温 度下在P D A上培养7 d菌落直径为2 2 6 m m 培养 1 4 d后菌落直径为4 0 2 m m 在1 8 和3 4 时 分 离物生长速度缓慢 在P D A上培养7 d菌落直径分 别为1 2 3 m m和9 0 m m 培养1 4 d菌落直径分别 为2 2 8 m m和9 9 m m 在自然发病的叶片发病部位能观察到分生孢子 梗和分生孢子的产生 其分生孢子梗多为簇生 基部 棕褐色 顶端浅褐色 直立或弯曲 有多个屈膝状折 点 有多个隔膜 图4 a 分生孢子无色 直或弯 短 小的孢子呈倒棍棒状 基部平截 顶端近尖至钝 有 3个以上隔膜 部分孢子有多达3 0余个隔膜 孢子 大小为 2 5 5 2 m 3 5 3 2 4 0 3 m 黑暗 条件下在P D A上培养1 4 d 会有少量分生孢子产 生 形态特征与叶片上相似 图4 b e 这些特征 与郭兰英等描述的侵染葫芦科作物的瓜类尾孢 Cercosporacitrullina较相似 1 4 与叶云峰等在甜 瓜上发现的C citrullina形态特征等也相似 1 5 初 步判断引起西瓜叶斑病的病原为尾孢菌 图4 西瓜叶斑病菌分离物SHCCC01的形态特征 Fig 4 MorphologicalcharacteristicsofisolateSHCCC01causingleafspotonwatermelon 2 3 分离菌株对西瓜的致病性 2 0株2 3叶期 早佳一号 西瓜接种S H C C C 0 1 后7 d 被接种叶片出现坏死斑 中间灰白色 后期病 斑变大 整叶枯萎 与田间症状相似 而对照植株叶 片上无症状 图5 从接种植株的发病部位重新进 行组织分离 得到了与S H C C C 0 1分离物形态特征 一致的分离物 进一步说明了S H C C C 0 1是引起西 瓜叶斑病的病原菌 2 4 分子生物学鉴定 利用I T S His TEF1 和Act4个基因序列的引 413 5 0卷第4期曾蓉等 西瓜叶斑病病原菌的鉴定及室内药剂筛选 图5 西瓜叶斑病病原菌致病性试验 Fig 5 PathogenicitytestofCercosporaisolateSHCCC01 物对西瓜叶斑病菌分离物 S H C C C 0 1进行P C R扩增 分别得到长度为5 3 6 3 9 1 3 0 8 2 2 5 b p的D N A片段 上传到N C B I的G e n B a n k数据库 获得登录号分别 为 O R 0 5 4 0 6 8 O R 0 8 8 0 5 1 O R 0 8 8 0 5 2 O R 0 8 8 0 5 3 在G e n B a n k数据库中进行各序列B L A S T n 结果显 示 菌株S H C C C 0 1的I T S序列与瓜类尾孢C cit rullina 辣椒尾孢C capsici 烟草尾孢C nicoti anae 甜菜尾孢C beticola 马来尾孢C malayensis 芹菜尾孢C apii等诸多尾孢分离物的相似性都高 达1 0 0 His基因序列与数据库中瓜类尾孢 C citrullina相似性都高于9 8 0 TEF1 基因序 列与瓜类尾孢C citrullina相似性都高于9 9 0 与其他尾孢种的相似性在9 8 0 左右 Act基因序 列与瓜类尾孢C citrullina相似性都高于9 9 0 与其他尾孢种的相似性在9 7 0 9 8 0 左右 分离物S H C C C 0 1的I T S His TEF1 和Act 4个基因序列与尾孢相应序列的相似性最高 基于 I T S His TEF1 和Act4个基因联合序列 经N J 法构建了分离物S H C C C 0 1的多基因系统进化树 图6 在该进化树中 分离物S H C C C 0 1 S H C C C 0 3与瓜类尾孢C citrullina的2个分离物聚集 在一个分支 自展值为9 2 2 5 室内药剂毒力测定 应用菌丝生长抑制法 测试1 0种药剂对分离 物S H C C C 0 1的室内毒力作用 结果显示 表2 抑菌作用最好的是氟啶胺 己唑醇 氟环唑 戊唑 醇等4种药剂 E C 5 0分别为0 3 7 5 2 0 5 7 5 4 1 4 7 2 3 1 8 9 0 2 g m L 其次为嘧菌酯 咪鲜胺 氟吡菌酰胺3种药剂 其E C 5 0分别为1 1 7 0 1 2 1 2 4 4 8 0 2 1 2 6 2 5 g m L 试验中 苯醚甲环唑 异 表2 8种杀菌剂对西瓜叶斑病菌SHCCC01菌丝生长的毒力测定 Table2 ToxicityofeightfungicidestomycelialgrowthofCercosporaisolateSHCCC01 杀菌剂 F u n g i c i d e 斜率 标准误 S l o p e S E 卡方值 2 自由度 df 抑制中浓度 9 5 置信限 g m L E C 5 0 9 5 c o n f i d e n c e i n t e r v a l 9 8 氟啶胺T C f l u a z i n a m 9 8 T C 5 3 1 1 8 0 0 3 0 7 9 0 1 0 0 4 0 3 7 5 2 0 3 1 3 1 0 4 4 9 7 9 5 4 己唑醇T C h e x a c o n a z o l e 9 5 4 T C 5 1 9 8 7 0 0 3 6 8 8 8 5 2 6 4 0 5 7 5 4 0 4 7 7 1 0 6 9 4 0 9 8 氟环唑T C e p o x i c o n a z o l e 9 8 T C 4 8 7 2 6 0 0 5 8 0 9 0 2 6 6 4 1 4 7 2 3 1 0 4 6 8 2 0 7 0 8 9 7 戊唑醇T C t e b u c o n a z o l e 9 7 T C 4 8 8 8 8 0 0 2 9 5 9 4 7 7 8 4 1 8 9 0 2 1 3 5 1 7 2 6 4 3 2 9 7 咪鲜胺T C p r o c h l o r a z 9 7 T C 4 1 0 8 2 0 1 3 4 7 8 8 5 7 6 4 1 2 4 4 8 0 6 9 6 6 9 2 2 2 4 1 4 9 8 嘧菌酯T C a z o x y s t r o b i n 9 8 T C 4 1 5 9 1 0 0 9 7 8 8 8 7 8 6 4 1 1 7 0 1 2 7 6 1 6 4 1 7 9 7 6 7 9 8 氟吡菌酰胺T C f l u o p y r a m 9 8 T C 4 0 5 7 8 0 0 7 4 3 8 9 4 4 5 4 2 1 2 6 2 5 1 3 8 5 3 8 3 2 6 3 3 2 9 5 2 苯醚甲环唑T C d i f e n o c o n a z o l e 9 5 2 T C 2 4 4 9 9 0 3 5 8 6 7 0 1 9 8 4 1 7 8 1 8 7 6 1 1 2 7 0 5 1 2 8 1 7 1 5 8 513 2 0 2 4 图6 基于ITS His TEF1 和Act多基因序列联合构建的NJ系统发育树 Fig 6 NJphylogenetictreebasedonITS His TEF1 andActsequences 菌脲和氟唑菌酰胺对分离物 S H C C C 0 1的抑制活性 较差 苯醚甲环唑E C 5 0为1 7 8 1 8 7 6 g m L 而异菌 脲和氟唑菌酰胺两种药剂在试验中设置终浓度为 3 0 0 g m L时 仍未能测得有效的E C 5 0 3 结论与讨论 本研究对采自上海市浦东新区的 早佳一号 西 瓜叶片上致病菌进行了分离 共获得了2 0株培养形 态一致的分离物 经过柯赫氏法则验证 选取了分 离物S H C C C 0 1进一步进行了菌落形态 生物学特 性 致病性测定 并通过分子生物学方法获得了该 分离物的I T S His TEF1 和Act的部分序列 通 过多基因序列联合建立N J系统发育树 综合分析 结果表明 引起上海浦东新区西瓜叶斑病的分离物 S H C C C 0 1为瓜类尾孢C citrullina 引起西瓜叶部斑点症状的病害较多 有西瓜蔓 枯病 细菌性叶斑病 西瓜炭疽病 尾孢叶斑病 等 1 6 1 9 且这些病害仅通过症状难以确认病原 本 研究中在叶片上观察到的症状与陈益果等 1 9 的描 述十分相似 通过分生孢子梗 分生孢子形态 病原 菌生物学特性和致病性等的鉴定 都和尾孢菌引起 的植物病害特征相吻合 然而 尾孢属近缘种之间 的看家基因序列相似性高 仅凭单个基因序列信息 很难准确鉴定到种 I n g l i s等 2 0 C o n w a y 2 1 M o n t e n e g r o C a l d e r n等 2 2 也证实 仅通过I T S序列分 析无法区分大多数尾孢属以下的分类 多基因联合 建树的方法是尾孢菌较常用的进化分类方法 G r o e n e w a l d等应用I T S TEF1 Act和Cal基因序列 联合建树的方法将6 7株尾孢分离物分为甜菜尾孢 C beticola 芹菜尾孢C apii和C appiicola3 组 2 3 曾蓉等也应用相同的方法成功地鉴定了引起 上海市茼蒿叶斑病的病原 1 2 本文也采用了相同的 方法成功将西瓜叶斑病病原鉴定到种 多基因序列 联合建树方法鉴定病原菌已经成为植物病害的常用 研究手段之一 2 4 叶云峰等 2 5 药剂筛选结果发现 7 0 代森锰锌 可湿性粉剂等药剂对甜瓜尾孢叶斑病有较好的抑制 作用 本研究选取了1 0种杀菌剂原药对分离物 613 5 0卷第4期曾蓉等 西瓜叶斑病病原菌的鉴定及室内药剂筛选 S H C C C 0 1进行毒力测定 结果显示 杀菌剂原药抑 菌活性大小为 氟啶胺 二硝基苯胺类 己唑醇 戊 唑醇 氟环唑 三唑类 咪鲜胺 咪唑类 嘧菌酯 甲氧基丙烯酸类 氟吡菌酰胺 吡唑酰胺类 苯 醚甲环唑 三唑类 氟唑菌酰胺 羧酰胺类 异菌 脲 二甲酰亚胺类 氟啶胺 己唑醇 戊唑醇 氟环 唑对分离物S H C C C 0 1的抑制活性较强 E C 5 0值在 0 3 7 5 2 1 8 9 0 2 g m L之间 这些结果为后续西 瓜叶斑病防治药剂田间药效评价及药剂种类的选择 提供重要的技术支持 参考文献 1 方中达 植病研究方法 M 3版 北京 中国农业出版社 1 9 9 8 2 H A R J U S F E D O S Y U K H P E T E R S O N K R R a p i d i s o l a t i o n o f y e a s t g e n o m i c D N A B u s t n G r a b J O L B M C B i o t e c h n o l o g y 2 0 0 4 4 1 8 D O I 1 0 1 1 8 6 1 4 7 2 6 7 5 0 4 8 3 W H I T E T B R U N S T L E E S e t a l A m p l i f i c a t i o n a n d d i r e c t s e q u e n c i n g o f f u n g a l r i b o s o m a l R N A g e n e s f o r p h y l o g e n e t i c M P C R p r o t o c o l s a g u i d e t o m e t h o d s a n d a p p l i c a t i o n s 1 9 9 0 4 C R O U S P W G R O E N E W A L D J Z R I S E D E J e t a l C a l o n e c t r i a s p e c i e s a n d t h e i rCylindrocladiumanamorphs s p e c i e s w i t h s p h a e r o p e d u n c u l a t e v e s i c l e s J S t u d i e s i n M y c o l o g y 2 0 0 4 5 0 4 1 5 4 3 0 5 J A K L I T S C H W M K O M O N M K U B I C E K C P e t a l Hypocreavoglmayriis p n o v f r o m t h e A u s t r i a n A l p s r e p r e s e n t s a n e w p h y l o g e n e t i c c l a d e i nHypocrea Trichoderma J M y c o l o g i a 2 0 0 5 9 7 6 1 3 6 5 1 3 7 8 6 C A R B O N E I K O H N L A m e t h o d f o r d e s i g n i n g p r i m e r s e t s f o r s p e c i a t i o n s t u d i e s i n f i l a m e n t o u s a s c o m y c e t e s J M y c o l o g i a 1 9 9 9 9 1 3 5 5 3 5 5 6 7 J E A N M O U G I N F T H O M P S O N J D G O U Y M e t a l M u l t i p l e s e q u e n c e a l i g n m e n t w i t h C l u s t a l X J T r e n d s i n B i o c h e m i c a l S c i e n c e s 1 9 9 8 2 3 1 0 4 0 3 4 0 5 8 V A I