河北保定地区黄瓜花叶病毒与马铃薯Y病毒复合侵染叶用莴苣分子鉴定.pdf

doi 10 19928 ki 1000 6346 2024 0024 https veg org 河北保定地区黄瓜花叶病毒与马铃 薯 Y 病 毒复合侵染叶用莴苣分子鉴定 陈利达 李畅 李敬蕊 吕桂云 吴晓蕾 宫彬彬 高洪波 河北农业大学园艺学院 农业农村部华北节水农业重点实验室 河北省蔬菜产业协同创新中心 河北省 蔬菜种质创新与利用重点实验室 河北保定 071000 摘 要 利用 RT PCR 方法对采集自河北保定地区的疑似叶用莴苣病毒病样品进行分子生物学鉴定 并构建系统发育进化 树 结果表明 特异性引物 CMV 和 PVY 分别扩增得到大小为 260 420 bp 的单一条带 通过核苷酸序列 Blast 比对及系 统进化树分析 河北保定地区叶用莴苣病毒分离物分别与印度番茄 CMV 分离物 MN514839 1 印度马铃薯 PVY 分离物 JX945850 1 聚在同一分支上 同源性分别为 95 92 本研究首次检测到河北保定地区叶用莴苣病毒病是由 CMV 与 PVY 复合侵染所致 关键词 叶用莴苣 黄瓜花叶病毒 马铃薯 Y病毒 复合侵染 Molecular Identification of Co infection of Cucumber mosaic virus and Potato virus Y on Lettuce in Baoding Hebei CHEN Lida LI Chang LI Jingrui LYU Guiyun WU Xiaolei GONG Binbin GAO Hongbo College of Horticulture Hebei Agricultural University Key Laboratory of North China Water saving Irrigation Engineering Collaborative Innovation Center of Vegetable Industry in Hebei Hebei Key Laboratory of Vegetable Germplasm Innovation and Utilization Baoding 071000 Hebei China Abstract The suspected lettuce virus disease stain collected from Baoding City Hebei Province was molecular biology identified by RT PCR method and the phylogenetic tree was constructed The results showed that specific primers CMV and PVY amplified single bands with sizes of 260 bp and 420 bp respectively Through nucleotide sequence Blast alignment and phylogenetic tree analysis it was found that the lettuce virus isolate from Baoding City Hebei Province was clustered on the same branch as the Indian tomato CMV isolate MN514839 1 and the Indian potato PVY isolate JX945850 1 with homology of 95 and 92 respectively The research first detected that the lettuce virus disease was caused by the combined infection of CMV and PVY in Baoding City Hebei Province Keywords lettuce Cucumber mosaic virus CMV Potato virus Y PVY complex infection 陈利达 男 博士 副教授 主要从事设施蔬菜病害诊断与绿色生物防控研究 E mail 15369301173 通信作者 Corresponding author 高洪波 女 博士 教授 主要从事设施蔬菜逆境生理与分子生物学研究 E mail hongbogao 收稿日期 2023 08 04 接受日期 2023 10 15 基金项目 河北省现代农业产业技术体系设施蔬菜创新团队项目 HBCT2021030213 河北省重点研发计划项目 21326903D 承德市科技计划项 目 202305B044 69 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究论文 2024 5 69 74叶用莴苣 Lactuca sativa L 为菊科莴苣属草 本植物 在世界各地广泛栽植 具有降低胆固醇 清热促血及养胃等食用和药用价值 Altunkaya Goekmen 2008 Dannehl Suhl 2016 李雅博 等 2017 田原源 等 2024 伴随叶用莴苣的消费需 求量日益增长 其栽培面积不断扩大 连作现象较 为普遍 随之病害日益加重 成为影响叶用莴苣产 量和品质的重要因素 给农户造成巨大的经济损失 病毒病是叶用莴苣上常见的病害 感病植株常 表现叶片皱缩 褪绿 花叶和畸形等典型症状 目 前 国际上已知报道的叶用莴苣病毒种类高达 20 余种 主要包括黄瓜花叶病毒 Cucumber mosaic virus CMV 莴苣花叶病毒 Lettuce mosaic virus LMV 番茄斑萎病毒 Tomato spotted wilt virus TSWV 马铃薯 X 病毒 Potato virus X PVX 莴苣褪绿病毒 Lettuce chlorosis virus LCV 马铃薯Y 病毒 Potato virus Y PVY 芜菁花叶病毒 Turnip mosaic virus TuMV 马 铃薯 S 病毒 Potato virus S PVS 蚕豆萎蔫病 毒 Broad bean wilt virus BBWV 苜蓿花叶病 毒 Alfalfa mosaic virus AMV 甜菜西方黄化病 毒 Beet western yellows virus BWYV 烟草环 斑病毒 Tobacco ring spot virus TRSV 烟草线 条病毒 Tobacco streak virus TSV 南芥菜花叶 病毒 Arabis mosaic virus ArMV 烟草坏死病 毒 Tobacco necrosis virus TNV 等 而我国现 已报道的叶用莴苣病毒种类主要为 LMV PVX CMV TSWV PVS 等 Stubbs et al 1969 Soleimani et al 2011 Aranzazu Alberto 2012 常泽 2014 Sharma et al 2016 卢蝶 2019 李 静汝 等 2022 叶用莴苣病毒病受当地的环境 品种 栽培管 理等因素影响较大 不同地区的病毒种类存在较大 差异 本试验对采集自河北保定地区的疑似叶用莴 苣病毒病叶片进行分子生物学鉴定 以期探明引起 该地区叶用莴苣病毒病的病毒种类 并对蔬菜病毒 病检测预警及综合防控提供有效技术支撑 1 材料与方法 1 1 试验材料 2023 年 在河北农业大学教学试验基地发现 水培叶用莴苣植株表现为新叶皱缩 卷曲等疑似病 毒病症状 随后采集 3份叶用莴苣叶片样本 液氮 处理后送至实验室 保存于 70 冰箱 叶用莴苣品种为罗马宝石绿 购自瑞克斯旺 中国 农业科技有限公司 1 2 叶用莴苣叶片总 RNA 提取及反转录 采用常规 TRIzol 法 萨姆布鲁克和拉塞尔 2002 提取叶用莴苣叶片总 RNA 全程在离心机 上低温 4 离心 取 200 mg 叶片于液氮中研磨 将 0 2 g粉末移入 1 5 mL离心管并加入 1 mL TRIzol 试剂 英潍捷基 上海 贸易有限公司 振荡混匀 室温静置 5 min 12 000 r min 1 离心 10 min 将上 清液转入 1 5 mL 离心管并加入 0 2 mL 氯仿混匀 室温放置 5 min 12 000 r min 1 离心 10 min 取水 相 400 L 加入等体积异丙醇 室温静置 10 min 12 000 r min 1 离心 10 min 弃上清液并加入 1 mL 75 乙醇洗涤沉淀2 次 12 000 r min 1 离心5 min 自然晾干加入 50 L RNase Free ddH 2 O溶解 以叶用莴苣健康植株叶片总 RNA 为阴性对照 80 保存备用 以叶用莴苣发病叶片总 RNA 为模板 使用 cDNA 反转录试剂盒 天根生化科技 北京 有限 公司 合成病毒 cDNA 反应体系 10 L 和反 应程序参考陈利达等 2020 的方法进行 1 3 RT PCR 检测 利用 15 种叶用莴苣常见病毒的特异性引物 表 1 对反转录 cDNA 进行 RT PCR 检测 3 次 重复 PCR 扩增体系 2 Taq PCR Master Mix 10 L 上 下游引物各 0 5 L cDNA 模板 1 L ddH 2 O补足至 20 L PCR 扩增条件 95 预变性 3 min 95 变性 30 s 55 退火 30 s 72 延伸 45 s 共 35 个循环 72 补充延伸 10 min PCR 产物经 1 5 琼脂糖凝胶电泳检测 利用全自动凝 胶成像系统拍照 1 4 序列分析及系统发育进化树构建 选取具有明显条带的 PCR 产物 配制 50 L 体系送至博迈德科技 北京 有限公司进行基因组 测序 通过NCBI http blast ncbi nlm nih gov 网站在线进行 Blast 比对 采用邻接法 Neighbor joining NJ 构建系统发育进化树 确定检测病毒 的种类 70 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究论文2 结果与分析 2 1 叶用莴苣病毒病的田间症状 河北保定地区叶用莴苣病毒病的发病症状如图 1所示 主要表现为叶片皱缩 心叶扭曲 老叶边 缘处伴有褐色坏死斑点及坏死支脉 新叶则是在生 长期出现大量的水泡状凸起 2 2 叶用莴苣病毒的 RT PCR 检测结果 利用 15 种叶用莴苣病毒的特异性引物对发病 叶片 cDNA进行 RT PCR扩增 结果表明 图 2 3 表 1 15 种叶用莴苣病毒的特异性引物信息 病毒 种类 引物序列 5 3 PCR 产 物 bp 参考文献 CMV F GGGGTACCTAGTGAGCGCTGTAAACCTGGAT 260 王少立 等 2017 R GCTCTAGAAATTTGTTGTTGGCTTGAACGC LMV F CATCAACGCAGGGCTACATGGTAAACACA 272 向均 等 2018 R TCCCGTTTTCTATACACCAAACCATCAATC PVX F AGTGGTATGGAACTGGATG 308 孙琦和张春庆 2003 R TTATGGTGGTGGTAGAGTGA PVY F GCTCTAGAAGTTTGGGTTATGATGGATGGGGATG 420 王少立 等 2017 R CGGAATTCAATCACCCTGCCACCTCTATC BBWV F TTGAACCCGGAAAAAGGGAGTGTG 1 300 张建云 等 2013 R TTGCTAGGYCCAGGYAAATTGTA PVS F AAAGTGTGCAGGCTGTATGC 302 程胜群 等 2020 R ATCTCAGCGCCRAGCAT AMV F CGAATCGAACGTAAGCAA 321 高艳玲 等 2022 R ATGATTCGTTGAAGAAGATAA BWYV F GAYTGYTCYGGTTTTGACTGG 1 410 左琳彧 等 2016 R CGTCTACCTATTTSGGRTTN TSWV F AACCCCGAACATTTCATAGA 425 陈利达 等 2020 R TCAGACAGGATTGGAGCCAC TuMV F TAAACGGAATGTGGGTGATGATGG 377 王少立 等 2017 R GTCCTCGGTCGTATGCCTTTCC LCV F GATGGCAGATCATG 1 380 冯丽肖 等 2022 R TGTGTTTGTTCTTCAACAACAC TRSV F TATTATGACGCCAACACTCT 437 郇晓雪 等 2021 R AGTATCAGACCTCCAACCA TSV F TTTGG GTAACTCGC AAAGCGAGT 404 魏梅生 等 2006 R TCTTCTGGTGGCATCAAG GGA GCTGGTT ArMV F CCAGTGCCTACAAGAGTGTGTC 580 于翠 等 2008 R TGAGCAAAAGGATTGTCTCCAAGG TNV F AAGA T C T A CAA T C ACATT A T C A T G ATCG 3 530 席德慧 等 2007 R A C T TA G A A C T G A TTCAT T G G T A T G GG G A TTGA 图 1 河北保定地区叶用莴苣病毒病的发病症状 A B C 71 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究论文特异性引物 CMV F CMV R 和 PVY F PVY R 分 别在 260 bp 和 420 bp 处扩增出唯一条带 且病毒 检测重复性较好 而其他叶用莴苣病毒引物和阴性 对照均未扩增出相应条带 表明 河北保定地区叶 用莴苣病毒病是由 CMV 和 PVY 两种病毒复合侵 染所致 2 3 CMV 和 PVY 系统进化树构建 由图 4 5 可见 河北保定地区叶用莴苣病 毒病分离物中 一类与 CMV 核苷酸序列有较高 的相似性 60 95 与印度番茄CMV 分 离物 MN514839 1 聚类在同一分支 同源性 高达95 另一类与印度马铃薯PVY 分离物 图 5 基于 PVY 基因组部分核苷酸序列构建的系统进化树 图 3 CMV 和 PVY 特异性引物的 RT PCR 扩增结果 M BM2000 DNA Marker 1 3 CMV 4 6 PVY 2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp M 1 2 3 4 5 6 图 2 15 种叶用莴苣病毒特异性引物的 RT PCR 扩增结果 M BM2000 DNA Marker 1 CMV 2 LMV 3 PVX 4 PVY 5 BBWV 6 PVS 7 AMV 8 BWYV 9 TSWV 10 TuMV 11 LCV 12 TRSV 13 TSV 14 ArMV 15 TNV N 阴性对照 2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 N 图 4 基于 CMV 基因组部分核苷酸序列构建的系统进化树 Bulgaria Citrullusl anatus LN810058 1 China Yunnan Banana KT302202 1 Spain Lycopersicone sculentum AJ829778 1 India Lycopersicone sculentum M N China Hebei Lactuca sativa Spain Cucumis melo KU976474 1 SouthK orea Capsicuma nnuum ON759513 1 SouthK orea Stellariaa quatica A B109909 1 China Zhejiang Raphanuss ativus AJ632088 1 Malaysia Pipern igrum AM Japan Torilis japonica L C626023 1 514839 1 084369 1 95 93 85 72 86 81 60 75 Kazakhstan Solanum tuberosum MK639792 1 Iran Solanum tuberosum HM243480 1 India Solanum tuberosum JX945850 1 China Hebei Lactuca sativa Hungary Solanum tuberosum AJ390300 1 France Solanum tuberosum MZ673227 1 Germany Solanum tuberosum MH937417 1 France Solanum lycopersicum MN216363 1 Germany Solanum lycopersicum OP525288 1 Slovakia Solanum tuberosum MW595183 1 82 88 81 98 Finland Solanum tuberosum JX432982 1 92 78 94 84 72 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究论文 JX945850 1 聚类在同一分支 同源性达到 92 进一步明确河北保定地区叶用莴苣病毒病分 离物为 CMV和 PVY复合型病毒 3 结论与讨论 本试验采用 RT PCR 方法对河北保定地区叶 用莴苣病毒病进行分子生物学鉴定并构建系统发育 进化树 结果表明河北保定地区的叶用莴苣病毒病 是由 CMV和 PVY复合侵染所致 CMV 为雀麦花叶病毒科 Bramoviridae 黄瓜 花叶病毒属 Cucumovirus 可侵染 85 科 365 属 1 200 种单 双子叶植物 主要通过蚜虫传毒 种 苗带毒或者汁液摩擦等方式传播 是目前侵染寄 主范围最多 分布最广 破坏性最强的植物病毒 之一 Scholthof et al 2011 CMV 侵染叶用莴苣 后叶片形成不规则的斑驳 叶缘皱缩伴有不规则 斑点 叶缘向下卷曲等症状 李静汝 等 2022 PVY 属于马铃薯病毒科 Potyviridae 马铃薯病毒 属 Potyvirus 其寄主范围已达到 9科 14属 Gray et al 2010 PVY于 1931年首次在马铃薯上被发 现 主要通过蚜虫传毒 寄主组织摩擦 种苗带毒 以及嫁接等方式传播 Smith 1931 近年来 多种病毒复合侵染单一作物的现象频 繁发生 绝大多数植物病毒均为系统性侵染方式 并且多数病毒侵染植株后发病症状大同小异 导致 无法准确鉴别病毒种类并对症用药 基于分子生物 学方法检测蔬菜病毒的种类是目前较为常见 实用 性较强的手段 2015年云南地区发现叶用莴苣 莴 笋等叶菜类蔬菜出现叶片黄化 褪绿和坏死斑的疑 似病毒病症状 经 ELISA 病毒基因检测 结果表 明侵染叶用莴苣的病毒种类为 TSWV 郑宽瑜 等 2015 冯黎霞等 2017 采用 ELISA 方法证实了 TSWV 可存活于叶用莴苣种子上 属于种传病毒 常泽 2014 通过非序列依赖性 PCR 扩增 SIA 方法 检测发现山西太谷地区的叶用莴苣病毒病是 由 CMV 与 PVS 复合侵染所致 本试验采用 RT PCR方法首次检测出河北保定地区叶用莴苣病毒病 是由 CMV 与 PVY 复合侵染所致 这可能是由于 农事操作管理不当或昆虫交互传毒引起的 成为叶 用莴苣病毒交叉感染的重要因素之一 此外 青玲 等 2009 采用 ELISA 方法检测出重庆地区葎草 CMV 和 PVY 复合侵染现象较为严重 鉴于葎草 是植物病毒的潜在中间寄主 常生长在棚室角落 路边或水渠处 极有可能成为蔬菜病毒病的潜在初 侵染源 应加以重视与检疫 因此 需做好叶用莴 苣病毒病的相关调查 在生产中采取综合防控措 施 既要加强种子检疫工作 也要注意防治病害和 清除种植地周边杂草 减少病毒病造成的农田经济 损失 参考文献 常泽 2014 生菜病毒病病原鉴定及其病毒全基因组序列测定与分 析 硕士论文 晋中 山西农业大学 陈利达 石延霞 谢学文 曹金强 柴阿丽 李宝聚 2020 我国 不同地区番茄主要病毒病种类的分子检测与分析 华北农学 报 35 1 185 193 程胜群 吕文河 高艳玲 白艳菊 范国权 2020 马铃薯 S病毒 RT qPCR 通用检测体系的建立与应用 华北农学报 35 6 187 194 冯黎霞 武目涛 于翠 吴兴海 2017 由美国进境生菜种子上番 茄斑萎病毒的检测鉴定 中国植保导刊 37 1 9 12 冯丽肖 胡荣 卜姗 张德咏 罗香文 李凡 丁铭 张卓 张松 柏 刘勇 2022 云南省番茄莴苣褪绿病毒分子检测及遗传 进化分析 园艺学报 49 1 141 147 高艳玲 范国权 程胜群 张威 邱彩玲 申宇 聂先舟 白艳菊 吕文河 2022 苜蓿花叶病毒 RT PCR 和 RT qPCR 检测技术 体系的建立与应用 植物保护学报 49 2 515 527 郇晓雪 刘晓宇 房乐 杜传印 李广强 耿超 李向东 田延平 2021 烟草环斑病毒 RT PCR检测体系的优化 山东农业科学 53 6 98 102 李静汝 张磊 孙平平 王永 付崇毅 司鲁俊 张称心 李正男 2022 侵染 5种叶菜类蔬菜的病毒研究进展 北方农业学报 50 4 122 134 李雅博 李婷 韩莹琰 范双喜 2017 叶用莴苣热激蛋白基因 LsHsp70 2711 的克隆及高温胁迫下的功能分析 中国农业科 学 50 8 1486 1494 卢蝶 2019 北京地区生菜病害调查及防治药剂筛选 硕士论文 北京 北京农学院 青玲 杨水英 孙现超 王进军 周常勇 2009 从葎草中检出复 合侵染的多种病毒 植物保护 35 4 138 140 萨姆布鲁克 J 拉塞尔 D W 2002 分子克隆实验指南 北京 科 学出版社 孙琦 张春庆 2003 马铃薯 X病毒的 RT PCR 检测 园艺学报 30 6 687 689 田原源 查凌雁 王座祺 段逸文 魏仕伟 章竞瑾 2024 红光 补充 UV A 对叶用莴苣倍半萜内酯类化合物的调控效应 中 国蔬菜 3 51 58 王少立 谭玮萍 杨园园 代惠洁 孙晓辉 乔宁 竺晓平 2017 山东省辣椒主要病毒种类的分子检测与鉴定 中国农 73 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究论文业科学 50 14 2728 2738 魏梅生 相宁 张春泉 Said A G 2006 烟草线条病毒 RT PCR 检测方法 植物检疫 3 136 138 席德慧 李江 曹淳 韩成贵 李大伟 于嘉林 周雪平 2007 烟草坏死病毒 A 大豆分离物的分子鉴定 植物病理学报 37 6 595 603 向均 王垚 文朝慧 张永江 2018 莴苣花叶病毒 RT RPA 检测 方法的建立 植物检疫 32 4 48 51 于翠 杨翠云 张舒亚 乔艳艳 2008 南芥菜花叶病毒的几种 PCR 检测方法的建立和比较研究 植物病理学报 38 4 388 393 张建云 许文博 刘升学 黄家风 2013 侵染加工番茄的 BBWV2 的分子鉴定及田间检测 石河子大学学报 自然科学 版 31 6 675 679 郑宽瑜 吴阔 董家红 方琦 张仲凯 2015 番茄斑萎病毒对云 南莴苣类蔬菜的侵染危害 植物保护 41 5 174 178 左琳彧 雍容婧 袁雯 杜开通 周涛 2016 北京地区辣椒上黄 瓜花叶病毒和甜菜西方黄化病毒复合侵染的分子鉴定 植物 保护 42 3 181 183 Altunkaya A Goekmen V 2008 Effect of various inhibitors on enzymatic browning antioxidant activity and total phenol content of fresh lettuce Lactuca sativa Food Chemistry 107 3 1173 1179 Aranzazu M Alberto F 2012 Virus diseases in lettuce in the Mediterranean Basin Advances in Virus Research 84 247 288 Dannehl D B C Suhl J 2016 Reuse of organomineral substrate waste from hydroponic systems as fertilizer in open field production increases yields flavonoid glycosides and caffeic acid derivatives of red oak leaf lettuce Lactuca sativa much more than synthetic fertilizer Journal of Agricultural and Food Chemistry 64 7068 7075 Gray S de Boer S Lorenzen J Karasev A Whitworth J Nolte P Singh R Boucher A Xu H M 2010 Potato virus Y an evolving concern for potato crops in the United States and Canada Plant Disease 94 12 1384 1397 Scholthof K B G Adkins S Czosnek H Palukaitis P Jacquot E Hohn T Hohn B Saunders K Candresse T Ahlquist P Hemenway C Foster G D 2011 Top 10 plant viruses in molecular plant pathology Molecular Plant Pathology 12 9 938 954 Sharma P Sharma S Singh J Saha S Baranwal V K 2016 Incidence of Lettuce mosaic virus in lettuce and its detection by polyclonal antibodies produced against recombinant coat protein expressed in Escherichia coli Journal of Virological Methods 230 53 58 Smith K M 1931 On the composite nature of certain potato diseases of the mosaic group as revealed by the use of plant indicators and selective methods of transmission Proceedings of the Royal Society of London 109 251 266 Soleimani P Mosahebi G Habibi M K 2011 Identification of some viruses causing mosaic on lettuce and characterization of Lettuce mosaic virus from Tehran Province in Iran African Journal of Agricultural Research 6 13 3029 3035 Stubbs L L Guy J A D Stubbs K J 1969 Control of lettuce necrotic yellows virus disease by the destruction of common sowthistle Sonchus oleraceus Australian Journal of Experimental Agriculture 9 10 215 218 74 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究论文