NY T 4489-2025 甜瓜品种鉴定SSR分子标记法.pdf

2025 01 09 发布 2025 05 01 实施 甜瓜品种鉴定 SSR分子标记法 05 中华人民共和国农业行业标准 备案号 XXXX XXXX 65 020 01 CCS B 4489 2025 Identification of melonvarieties SSR marker method 中华人民共和国农业农村部 发布 NY T 目 次 前言 范围 规范性引用文件 术语和定义 缩略语 原理 主要仪器设备及试剂 溶液配制 引物信息及使用 参照品种及使用 操作程序 结果判定与表述 附录A 规范性 主要仪器设备及试剂 附录B 规范性 溶液配制 附录C 规范性 引物及序列 附录D 资料性 引物相关信息 附录E 资料性 参照品种相关信息 附录F 资料性 引物分组 NY T 前 言 本文件按照GB T 标准化工作导则 第 部分 标准化文件的结构和起草规则 的规定起 草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本文件由农业农村部种业管理司提出 本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会 SAC TC 归口 本文件起草单位 新疆农业科学院农作物品种资源研究所 新疆农业科学院哈密瓜中心 农业农村部 科技发展中心 本文件主要起草人 颜国荣 韩瑞玺 邓超宏 杨永 王威 徐麟 刘宁 宋羽 王帆 赵连佳 张永兵 肖 菁 阿布都克尤木 阿不都热孜克 李嫒嫒 杨岩岩 何姝燃 NY T 甜瓜品种鉴定 SSR分子标记法 范围 本文件规定了利用简单重复序列 SSR 标记进行甜瓜 CucumismeloL 品种鉴定的术语和定义 缩略 语 原理 主要仪器设备及试剂 溶液配制 引物信息及使用 参照品种及使用 操作程序 结果判定与表述 本文件适用于甜瓜品种的DNA分子数据采集和品种鉴定 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 其中 注日期的引用文件 仅 该日期对应的版本适用于本文件 不注日期的引用文件 其最新版本 包括所有的修改单 适用于本文件 GB T 农作物种子检验规程 扦样 GB T 分析实验室用水规格和试验方法 NY T 植物品种鉴定DNA分子标记法 总则 术语和定义 NY T 界定的术语和定义适用于本文件 缩略语 下列缩略语适用于本文件 APS 过硫酸铵 ammoniumpersulphate bp 碱基对 basepair CTAB 十六烷基三甲基溴化铵 cetyltrimethylammoniumbromide DNA 脱氧核糖核酸 deoxyribonucleicacid dNTPs 脱氧核糖核苷三磷酸 deoxy ribonucleosidetriphosphates EDTA 乙二胺四乙酸 ethylenediaminetetraaceticacid PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamidegelelectrophoresis PCR 聚合酶链式反应 polymerasechainreaction SSR 简单重复序列 simplesequencerepeat Taq酶 耐热DNA聚合酶 Taq DNApolymerase TBE 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐乙二胺四乙酸 Tris borate EDTA TE 三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸 Tris EDTA TEMED 四甲基乙二胺 N N N N tetramethylethylenediamine Tris 三羟甲基氨基甲烷 Tris hydroxymethyl methylaminomethaneTHAM 原理 甜瓜品种基因组中存在着大量能够稳定遗传的SSR标记 不同甜瓜品种在同一SSR的重复次数存 在差异 这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测 进而区分不同的品种 主要仪器设备及试剂 主要仪器设备及试剂见附录A 溶液配制 溶液配制方法见附录B NY T 引物信息及使用 引物及序列见附录C 引物相关信息见附录D 利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 检测时选择普 通引物 利用荧光毛细管电泳检测时选择荧光标记引物 荧光标记位于正向引物 端 推荐的荧光标记见 附录D 可利用附录C中的引物序贯检测 当检测到的差异位点数能判定送检样品与对照样品不同时 停 止检测 参照品种及使用 参照品种用于辅助确定送检样品在某个位点的等位变异 宜与送检样品同时检测 参照品种相关信息 见附录E 操作程序 样品准备 送检样品可为种子 幼苗 叶片等组织或器官 种子样品需扦样时 应符合GB T 的规定 每 份样品不少于 个个体 等量混合分析 必要时进行个体检测 DNA提取 取混合样本约 mg 置于 mL圆底离心管中 经液氮冷冻后充分研磨 每管加入 L预热到 的CTAB提取液 充分混合 水浴 min min 每隔 min轻缓颠倒混匀一次 每管加入 与CTAB提取液等体积的三氯甲烷和异戊醇混合液 轻缓混匀后静置 min rpm离心 min 吸取上清液转移至新的离心管中 加入等体积预冷的异丙醇 轻轻颠倒混匀 放置 min rpm离心 min 弃上清液 用体积分数为 的乙醇溶液洗涤 遍 晾干 加入 L双蒸水 或TE缓冲液充分溶解 检测DNA浓度和质量 保存备用 注 以上为推荐的DNA提取方法 DNA质量能够满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法均适用于本标准 DNA 溶液的紫外吸光度OD 与OD 的比值宜介于 之间 注 三氯甲烷和异戊醇混合液中三氯甲烷与异戊醇的体积比为 PCR扩增 反应体系 PCR扩增反应体系的总体积和各组分的终浓度参照表 配制 可以依据试验条件调整 表 PCR扩增反应体系 反应组分原浓度终浓度推荐体积 L 缓冲液 含MgCl dNTPs mmol L mmol L Taq酶 U L U L 正向引物 mol L mmol L 反向引物 mol L mmol L DNA ng L ng L 双蒸水 总体积 反应程序 推荐反应程序 预变性 min 变性 s 退火 s 延伸 s 共 个循环 延伸 min 产物 保存 反应程序中各反应参数可根据PCR扩增仪型号 酶 引物等不同而做适当的调整 NY T PCR产物电泳 垂直板变性PAGE 制胶 用洗涤剂将玻璃板清洗干净 再用双蒸水 无水乙醇依次擦洗 遍 玻璃板干燥后 将 mL亲和 硅烷工作液均匀涂在长玻璃板上 将 mL剥离硅烷工作液均匀涂在带凹槽的短玻璃板上 操作过程 中应防止两块玻璃板互相污染 玻璃板彻底干燥后 将 mm厚的塑料隔条整齐放在长玻璃板两侧 盖 上凹槽短玻璃板 用夹子固定 用水平仪调平 取 mL质量分数为 的PAGE胶溶液 加入 L 四甲基乙二胺 TEMED 和 L质量分数为 的过硫酸铵 APS 迅速混匀 将胶灌入玻璃胶室 灌 胶过程中应防止出现气泡 待胶室灌满后 在凹槽处将 mm厚鲨鱼齿梳子平齐端向里轻轻插入胶液 约 mm 室温聚合 h以上 胶聚合后 清理胶板表面溢出的胶液 轻轻拔出梳子 用水洗净备用 变性 在 LPCR产物中加入 L 加样缓冲液 混匀 在PCR扩增仪上运行 变性 min 冷却 min以上备用 电泳 将胶板安装于电泳槽上 在电泳正极槽和负极槽 上槽 各加入 mL的 TBE缓冲液 使其没过 电极线 V恒压预电泳 min min 用移液器吹吸加样槽 清除气泡和杂质 将样品梳 鲨鱼 齿朝下 插入凝胶 mm mm 每一个加样孔点入 L L样品 除送检样品外 还宜同时加入参 照品种扩增产物和合适的DNA分子量标准 V恒压电泳 电泳时间参考二甲苯青指示带泳动的位 置和扩增产物预期片段大小范围 见附录D 加以确定 二甲苯青指示带在质量分数为 PAGE胶电泳 的泳动位置与 bp扩增产物泳动的位置大致相当 扩增产物片段大小在 bp bp bp bp范围的 电泳参考时间分别为 h h h h 当等位变异碱基对数 差异较小时 可适当延长电泳时间 电泳结束后关闭电源 取下玻璃板并轻轻撬开 凝胶附着在长玻璃板上 染色 将附着凝胶的长玻璃板胶面向上浸入固定液中 轻轻晃动 min后取出 在双蒸水中快速漂洗 时间 不超过 s 将胶板放入染色液中 轻轻晃动 min min后取出 在双蒸水中快速漂洗 时间不超过 s 将胶板放入显影液中 轻摇晃动待条带清晰后取出 再迅速放入固定液中定影 min取出 在双蒸水中 漂洗 min 取出胶板 晾干 放在胶片观察灯上观察 记录结果 拍照保存 注 固定液 染色液 双蒸水和显影液的用量 以淹没胶面为准 荧光毛细管电泳 PCR产物样品准备 根据预先确定的引物分组 见附录F 分别取等体积不同荧光标记引物的扩增产物 混匀稀释 吸取 L混合液 加入到DNA分析仪配套上样板中 注 稀释倍数通过荧光毛细管电泳预实验确定 变性 上样板各孔分别加入 L分子量内标和 L去离子甲酰胺 在PCR扩增仪上 变性 min 取出后立即置于冰上 冷却 min以上 瞬时离心 s后备用 电泳 按照DNA分析仪操作手册电泳 并保存电泳原始数据文件 数据分析 等位变异确定与记录 每个SSR位点的等位变异参照扩增片段大小确定 见附录D 对于变性PAGE 将送检样品在某一 位点扩增片段的迁移位置与对应的参照品种进行比较 确定送检样品在该位点的等位变异 对于荧光毛 NY T 细管电泳 通过参照品种消除不同批次或者不同型号DNA分析仪可能存在的系统误差 使用片段分析软 件读取送检样品在该位点的等位变异 纯合位点的等位变异数据记录为X X 杂合位点的等位变异数据记录为X Y 其中X Y分别为该位 点上的两个等位变异 小片段数据在前 大片段数据在后 缺失位点的等位变异数据记录为 示例 样品在某个位点上仅出现一个等位变异 为 bp 则该位点的等位变异数据记录为 示例 样品在某个位点上有两个等位变异 分别为 bp bp 则该位点的等位变异数据记录为 数据比对与差异位点统计 逐一比对送检样品与对照样品每个位点的等位变异数据 按照位点相同 位点差异 数据缺失 无法判 定情形 记录每个位点的比对结果 统计检测位点数和差异位点数 结果判定与表述 判定规则 当差异位点数大于 判定为 不同 当差异位点数小于等于 判定为 疑同 结果表述 送检样品与对照样品 或对照样品指纹 采用检测 检 测位点数为 差异位点数为 判定为 NY T 附 录 A 规范性 主要仪器设备及试剂 A 主要仪器设备 A PCR扩增仪 A 高压电泳仪 最高电压不低于 V 具有恒电压 恒电流和恒功率功能 A 垂直电泳槽及配套的制胶附件 A 离心机 A 水平摇床 A 胶片观察灯 A 电子天平 感量为 g和 g A 微量移液器 规格分别为 L L L L L 连续可调 A 磁力搅拌器 A 核酸浓度测定仪或超微量紫外分光光度计 A 微波炉 A 高压灭菌锅 A 酸度计 A 水浴锅 A 低温冰箱 A 制冰机 A 凝胶成像系统或紫外透射仪 A DNA分析仪 基于毛细管电泳 有片段分析功能和数据分析软件 最低区分力 bp A 其他相关仪器和设备 A 主要试剂 除非另有说明 均使用分析纯试剂 A 十六烷基三甲基溴化铵 CTAB C H CH NBr CAS号 A 三氯甲烷 CHCl CAS号 A 异戊醇 C H O CAS号 A 异丙醇 CH CHOH CAS号 A 乙二胺四乙酸二钠 EDTA Na C H N Na O CAS号 A 三羟甲基氨基甲烷 Tris C H NO CAS号 A 浓盐酸 HCl CAS号 A 氢氧化钠 NaOH CAS号 A PCR缓冲液 含Mg mmol L A 种脱氧核糖核苷酸 dATP dTTP dGTP dCTP A SSR引物 A 氯化钠 NaCl CAS号 NY T A TaqDNA聚合酶 Taq酶 CAS号 A DNAMarker DNA片段分布范围在 bp bp A 甲酰胺 CH NO CAS号 A 溴酚蓝 C H Br O S CAS号 A 二甲苯青 C H N NaO S CAS号 A 甲叉双丙烯酰胺 H C CHCONH CH CAS号 A 丙烯酰胺 C H NO CAS号 A 硼酸 H BO CAS号 A 尿素 CH N O CAS号 A 亲和硅烷 A 二甲基二氯硅烷 C H Cl Si CAS号 A 无水乙醇 C H O CAS号 A 四甲基乙二胺 TEMED C H N CAS号 A 过硫酸铵 APS NH S O CAS号 A 冰醋酸 CH COOH CAS号 A 硝酸银 AgNO CAS号 A 甲醛 HCHO CAS号 A DNA分析仪用丙烯酰胺胶液 A DNA分析仪用分子量内标 A DNA分析仪用电泳缓冲液 A DNA分析仪用光谱校准基质 NY T 附 录 B 规范性 溶液配制 试剂配制用水应符合标准GB T 的要求 B DNA提取溶液的配制 B mol LEDTA溶液 称取 gNa EDTA H O溶于 mL水中 充分搅拌溶解 加NaOH调pH至 加水定容 至 mL 高压灭菌 min B mol LHCl溶液 量取 mL浓盐酸 质量分数为 加水定容至 mL B mol LNaOH溶液 称取 gNaOH溶于 mL水中 充分搅拌溶解 加水定容至 mL B mol LTris HCl溶液 称取 gTris碱溶于 mL水中 充分搅拌溶解 加HCl调pH至 加水定容至 mL 高压灭菌 min B CTAB提取液 称取 gCTAB gNaCl置于 mL烧杯中 量取 mL mol LTris HCl溶液和 mL mol LEDTA溶液倒入烧杯中 加 mL水 充分搅拌溶解 加水定容至 mL 高压灭菌 min B TE缓冲液 量取 mL mol LTris HCl溶液和 mL mol LEDTA溶液 加水定容至 mL 高压 灭菌 min 保存 B PCR扩增试剂的配制 B dNTPs溶液 分别配制dATP dTTP dCTP dGTP终浓度为 mmol L的储存液 各取 L混合 加 L TE缓冲液定容 配制成每种脱氧核糖核苷酸终浓度为 mmol L的工作液 高压灭菌 min 保存 B SSR引物溶液 开盖前瞬时离心 s 按照说明书加TE缓冲液 分别配制正向引物和反向引物终浓度为 mol L的储存液 分别取 L正向引物和反向引物储存液 加 LTE缓冲液配制成终浓度 mol L的 工作液 B 变性PAGE试剂的配制 B 质量分数为 的丙烯酰胺溶液 称取 g丙烯酰胺和 g甲叉双丙烯酰胺溶于 mL水中 充分搅拌溶解 加水定容至 mL 置于棕色瓶中 储存 B 质量分数为 的变性PAGE胶溶液 称取 g尿素置于 mL烧杯中 加入 mL TBE缓冲液和 mL质量分数为 的丙烯酰胺溶液 定容至 mL B 亲和硅烷缓冲液 NY T 分别量取 mL无水乙醇和 L冰醋酸 加水定容至 mL B 亲和硅烷工作液 分别量取 mL亲和硅烷缓冲液和 L亲和硅烷原液 混匀 B 剥离硅烷工作液 分别量取 mL二甲基二氯硅烷和 mL三氯甲烷 混匀 B 质量分数为 的APS溶液 称取 gAPS溶于 mL水中 混匀 于 保存 不超过 天 B TBE缓冲液 称取Tris g 硼酸 g 溶于 mL水中 加入 mLEDTA溶液 mol L pH 定 容至 mL B TBE缓冲液 量取 mL TBE缓冲液 加水定容至 mL 混匀 B 加样缓冲液 分别称取 g溴酚蓝和 g二甲苯青 加入 mL去离子甲酰胺和 mLEDTA溶液 mol L pH 搅拌溶解 B 银染溶液的配制 B 固定液 量取 mL冰醋酸 加水定容至 mL B 染色液 称取 g硝酸银 加水定容至 mL B 显影液 称取 g氢氧化钠溶于 mL水中 用前加 mL甲醛 NY T 附 录 C 规范性 引物及序列 引物及序列见表C 表C 引物及序列 引物编号引物名称染色体定位正向引物序列 反向引物序列 ME TGGAATACCATCTTACACCTTTCATCCATAAACATTTCCCCGTT ME GGCCACGTGACCTTATGATTCCTTCATCATTTCCAAGGGA ME TTGGCTCCTCTTAGTGTCCTCATGTCAATGCCTTGTGAAGC ME ATGGGCTTTTGGTGATTGATTTCTTCCCACCAAACCTACG ME ACACACCTAATCTCCCTACCTTCAAAGCCAACCCATATCCCAT ME CCCTCAATTACAAGAAAAGCATTACTGGGTTTTGCCGATTT ME GCGCAAATCAAGGGATTTTAATCCAAGGGAAAATGGGAAC ME GGAGGACGAAAGACCAATGAAACCGCAAATACGAGACCTG ME GACAGTAATCACCTCATCAACGCTCCTCCTTAACTCTATAC ME CCCCAAGATTCGTATTAATCAGATTCTTGAAATGGTGGCG ME GCCTTTTGTGATGCTCCAATAATGACACTGCCCACATTCT ME CCACCAACATAACACACAACAGAGTCTCATTCCTCTCGACG ME GGTCGGTCCCCTATTCTCTTGTGCAAATGCAAGATCGAAG ME CATCTCGAACCTAAGAGCCGGCCCTCCCAAAAATTTCAGT ME ATGGTCTCCCCAACCTATCCGAACAATGCAAGAAAATGGGA ME GCGTTTCCAAACAAACATGAAAATGGCAGAGAGCGAGAAA ME CTCAAACAACGTCAGCTGGTACCCAGAAGTGCTTTTCCCT ME TGAACTGTGCAACCACCTGTAATTCCGTATTCAACTCTCC ME ATGATTGGAAGCCACCAAAGTTGAGCCCCAAAATAAATGG ME CGACCGCCATTAATCAAAACTCTCCTGCATAAACCCCAAG ME GGGAATGTAAATTGGATATGGCATTATTACCCATGTACGAG ME TGGTAGTAGAGATGATATACTCAATCTCCGGTTCCAACTC ME AAACAAACATGGAAATAGCTTTCAAGGTTTTTCAATGGAGGGGA ME CTCTCACACTGTTGGGAAGATGTGTATGGAGGGCTTTTCC NY T 附 录 D 资料性 引物相关信息 引物相关信息见表D 表D 引物相关信息 引物编号引物名称荧光标记等位变异范围 bp 主要等位变异 bp 参照品种 ME FAM 卡拉其里甘 八一香梨 PMR ME HEX 白皮脆 安农 号 哈莫尼 白兰瓜 伯些克辛 光皮胜金白瓜 ME FAM 青皮白肉冬瓜 ME FAM 铁皮 劈山 卡拉可口奇 金棒子 鲁薄二号 ME HEX 景甜 号 黑眉毛密极甘 哈莫尼 酥皮菜瓜 ME TAMRA 卡拉可口奇 ME ROX 白兰瓜 阿克可口奇 伯些克辛 ME TAMRA 光皮胜金白瓜 阿克可口奇 伯些克辛 白兰瓜 ME HEX 酥皮菜瓜 安农 号 哈莫尼 阿克可口奇 白兰瓜 金棒子 ME HEX 安农 号 哈莫尼 伯些克辛 白皮脆 NY T 表D 续 引物编号引物名称荧光标记等位变异范围 bp 主要等位变异 bp 参照品种 ME ROX 青皮白肉冬瓜 白皮脆 安农 号 PMR 酥皮菜瓜 ME FAM 安农 号 酥皮菜瓜 哈莫尼 卡拉其里甘 八一香梨 ME TAMAR 哈莫尼 鲁薄二号 含笑 ME ROX 景甜 号 白兰瓜 卡拉可口奇 ME HEX 鲁薄二号 阿克可口奇 八一香梨 卡拉可口奇 白皮脆 ME TAMRA 黑眉毛密极甘 白皮脆 哈莫尼 光皮胜金白瓜 ME TAMRA 景甜 号 黑眉毛密极甘 铁皮 金棒子 ME ROX 卡拉其里甘 哈莫尼 光皮胜金白瓜 白兰瓜 ME FAM 青皮白肉冬瓜 八一香梨 白皮脆 鲁薄二号 ME HEX 伯些克辛 光皮胜金白瓜 八一香梨 PMR 酥皮菜瓜 ME FAM 金棒子 光皮胜金白瓜 白兰瓜 阿克可口奇 NY T 表D 续 引物编号引物名称荧光标记等位变异范围 bp 主要等位变异 bp 参照品种 ME FAM 卡拉可口奇 白兰瓜 哈莫尼 ME FAM 哈莫尼 安农 号 鲁薄二号 含笑 黑眉毛密极甘 ME ROX 青皮白肉冬瓜 阿克可口奇 景甜 号 注 附录D中采用的荧光标记仅为示例 采用其他类型荧光标记时 应使用参照品种校正数据 注 对于附录D中未包括的等位变异 应按本文件方法 确定其大小和相应参照品种 注 附录D中所列参照品种仅为示例 与参照品种具有相同等位变异的其他品种也可用作该等位变异的参照品种 注 同一名称不同来源的参照品种 在某些位点上的等位变异可能不相同 使用前应确认其等位变异 NY T 附 录 E 资料性 参照品种相关信息 参照品种相关信息见表E 表E 参照品种相关信息 编号品种名称品种来源编号品种名称品种来源 卡拉其里甘 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 黑眉毛密极甘 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 白皮脆 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 含笑 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 八一香梨 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 安农 号 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 光皮胜金白瓜 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 哈莫尼 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 伯些克辛 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 PMR 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 白兰瓜 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 酥皮菜瓜 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 金棒子 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 阿克可口奇 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 铁皮 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 卡拉可口奇 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 鲁薄二号 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 劈山 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 景甜 号 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 青皮白肉冬瓜 国家中亚特色作物种质 资源中期库 乌鲁木齐 NY T 附 录 F 资料性 引物分组 引物分组见表F 表F 引物分组 组别FAM标记引物TAMRA标记引物ROX标记引物HEX标记引物 ME ME ME ME ME ME ME ME ME ME ME ME ME ME ME ME ME ME ME ME ME ME ME ME 注 括号内是各引物的等位变异范围 注 同组别内引物的扩增产物可以多重电泳 注 可结合引物等位变异范围 更换荧光标记 调整分组