2株黄连根腐病生防菌的鉴定.pdf

试验研究 年第 期 总第 期 收稿日期 基金项目 菌株 抗黄连根腐病效果及代谢组学的研究 黔科院 字 号 作者简介 陈迎丽 女 宁夏固原人 高级工程师 主要从事农药分析 植物病害及其生物防治研究 生物农药创制及农药毒理学研 究 株黄连根腐病生防菌的鉴定 陈迎丽 余 水 曾 羲 陈贵廷 贵州省检测技术研究应用中心 贵州贵阳 广州市食品检验所 广东广州 摘要 本文采用平板对峙 分子生物学鉴定和不同指示培养基检测相结合的方法 筛选并鉴 定土壤中具有拮抗黄连根腐病菌的菌株并研究其抑菌机制 以期为黄连根腐病 的 防治提供更好的生物防治方法 结果表明 从土壤中筛选出 株对黄连根腐病具有明显拮抗效 果的芽孢杆菌 编号 均为贝莱斯芽孢杆菌 经抗菌谱实验证明 株菌株具有广谱抗菌性 对多种植物病原真菌均有明显拮抗作用 其中对辣椒炭疽病菌 的抑制效果最明显 分别为 特定平板测定发现 均能产生纤维素酶和磷酸酯酶 是有极高生物防治潜力的菌株 关键词 黄连 根腐病菌 抑制作用 贝莱斯芽孢杆菌 中图分类号 文献识别码 文献编号 黄连 是毛茛科 黄连属的多年 生草本植物 具有抗菌 抗毒和解毒的功效 主要产 于广西 云南 贵州等地区 是一味重要的民间中药 材 黄连根腐病是危害黄连生产的主要土传病害之 一 发病面积广 发病情况严重 主要危害黄连的地下 茎块 初期叶片发黄 后变黑褐色并干枯 极大影响了 黄连的生产 目前 防治黄连根腐病害的方法包括农 业防治 化学防治和生物防治 但农业防治效果 差 化学防治虽然效果好 操作便捷 价格低 但长期 使用容易造成农药残留量超标 中药材污染 危害人 类健康并造成环境污染 而且还易产生抗药性 随着人们对健康和环保意识的加强 安全无污 染的中药材根腐病的防治方法越来越受到重视 而 生物防治法可以弥补以上不足 不仅成本低且对环 境友好 是一种理想的防治手段 近年来 中药 材根腐病的生物防治多为微生物活菌体 沈永昶 等从三七植株中筛选出解淀粉芽孢杆菌 和枯草芽孢杆菌 对三七根腐病具有显著的拮抗效 果 其防治效果高达 游景茂等从白术体内 分离得到一株枯草芽孢杆菌 经田间防效试 验证明 抑菌率超过 具有促生效果 生物防治作为抗病研究的先锋 其中的芽孢杆 菌更是以可产生具有拮抗效果的次生代谢产物以 及抗逆性强的芽孢而倍受推崇 并且芽孢杆菌拮抗 机制多样化 能在植物根际有效定殖并保持较高群 体数量 而贝莱斯芽孢杆菌 是 芽孢杆菌中的一种 是连接土壤和植物的优势微生 物 对环境兼容性高 可抑制植物病原菌和促进植物 生长 具有广谱抗菌活性 在植物病虫害生物防治 提 年第 期 总第 期 试验研究 高粮食产量和品质以及生物农药开发应用上有较大 应用前景 陈爽等探究了贝莱斯芽孢杆菌 对大豆根腐病盆栽防治效果和防御酶活性 结果表 明 不仅具有促生作用 对大豆根腐病还具有 防治作用 可以诱导防御酶的活性 近年来 因黄连根腐病发病率高 严重制约了 黄连的产业化发展 但尚未见利用贝莱斯芽孢杆菌 防治黄连根腐病的报道 本文将以黄连根腐病菌 为防治对象 从土壤中分离出微生物 进行平板对峙试验 筛选并鉴定土壤中具有拮抗黄 连根腐病菌的菌株并探究其抑菌机制 以期为黄连 根腐病的最佳防治方法提供依据 材料与方法 试验材料 土壤 年 月在贵州省贵阳市白云区青山村采 集黄连根腐病发病较重地块的健康植株根际土壤 使 用 点取样法采集 深度的土壤 再用经 酒精灭菌 无菌水清洗 次的铁锹收集土壤于灭 菌过的牛皮纸信封袋中 在实验室进行分离培养 菌株 病原菌为黄连根腐病菌 烟草黑 胫病菌 番茄灰霉病菌 辣椒炭疽病菌 由贵 州大学农学院植物病理学教研室保存并提供 供试培养基 参照文献 配制 液体培养基 固体培 养基 固体培养基 纤维素酶检测培养基和磷 酸酯酶检测培养基 试验方法 菌株分离 将 试验土壤添加至盛有 无菌水的 锥形瓶中 于 水浴锅中水浴 每隔 振荡锥形瓶 使混合液中大部分细菌除芽孢杆菌外 被杀死 摇培结束后静置 将 混合液添 加至 无菌水中 并采用梯度稀释法 分别得到 的稀释液 取 稀释液 均匀涂抹至固体 培养基上 待菌液干渍后密 封 倒置存放于细菌培养箱中 在 下培养 菌液制备 挑取菌株单菌落接种划线于固体 培养基上 纯化菌株 将纯化后的菌株接种到 的离心管 中 内有 的 液体养基 在摇床中以 黑暗条件下培养 培养结束后以 离心收集离心管底部菌体 最后加入 无菌水悬浮制备成细菌悬浮液 另外取 的菌液与 灭过菌的 甘油混合 保存于 冰箱中 拮抗芽孢杆菌筛选及抑菌谱测定 以黄连根腐病菌为靶标病原菌 烟草黑胫病菌 番茄灰霉病菌 辣椒炭疽病菌为对峙病原菌 采用平 板对峙法 同 制备悬浮菌液 再将病原菌菌 饼 使用打孔器切割直径约 接种至 平板 中央处 距菌饼 处对称滴加细菌悬浮液 以只接病原菌 板为对照组 培养 待 空白对照病原菌菌落长满整个平板时 观察并记录菌 落直径 采用十字交叉法 计算抑菌率 抑菌率 对照菌落直径 处理菌落直径 对照菌落直径 菌落形态观察 根据 制备的悬浮液滴 加 至 平板中 央 密封于培养箱中 条件下暗培养 观察 生理生化特征测定 根据 常见细菌系统鉴定手册 进行生理生化 特性测定 分子生物学鉴定 利用细菌 提取试剂盒 无锡百泰克生物 技术有限公司 提取待测菌株基因组 以菌株 为模板 通用引物 和 对菌 株 进行 扩增 扩增采用 的反应体 系 引物各 反应程序 预变性 变性 退火 延伸 个 循环后 延伸 的 反应程序与 相似 但退火温度为 扩增产物 送生工生物工程 上海 有限公司进行测序 将获取的基因序列在 基因数据库中 通过 进行同源序列相似性比对分析 再在 上下载相关 权威菌种对应序列 使用 软件将所测序列 试验研究 年第 期 总第 期 和从 下载的相关序列进行人工调整以保证各 对碱基的同源性 利用 软件 进行 分析 系统构建采用启发式搜索 以随机添加序列方式 次重复 自展 法检验 用于评估系统树各节点的支持 率 在测试中重复 次分别构建 和 的多基因系统发育树 机制测定 通过制备特定平板检测菌株是否产生纤维素 酶 磷酸酯酶等 测定其生防机制 数据统计与分析 试验所得数据采用 分析软件处理 新复极差法进行显著性分析 结果与分析 拮抗菌筛选 初筛 通过平板对峙筛选出对黄连根腐病菌有 拮抗效果的菌株 分别编号 图 图 黄连根腐病菌拮抗菌初筛 复筛 再次对菌株 进行平板对峙 拮抗效果明显 的抑菌率为 的抑菌率为 图 图 黄连根腐病菌复筛 拮抗真菌菌丝 将黄连根腐病菌菌丝置于显微 镜下观察 发现处理组菌丝出现畸形或膨大的现象 图 拮抗菌鉴定 菌株生理生化测定 测定结果表明 菌株和 菌株革兰 氏染色 甲基红 硫化氢 亚硝酸还原及 反应均 图 处理组菌丝变化情况 呈阳性 可以产生过氧化氢酶 淀粉水解酶 使明胶 液化 葡萄糖氧化发酵 并能分解麦芽糖 鼠李糖和 甘露醇 表 表 菌株和 菌株的生理生化测定结果 特征结果特征结果 革兰氏染色反应 甘露醇 甲基红 麦芽糖 鼠李糖 过氧化氢 淀粉水解 硫化氢试验 反应 明胶液化 山梨醇 葡萄糖氧化反应 亚硝酸还原 硝酸还原酶 注 阳性 阴性 拮抗菌分子鉴定 经过 基因比对发现 与贝莱斯 芽孢杆菌 的同源性为 与贝莱斯芽孢杆菌 的同源性为 通过 的基因比对发现 与贝莱斯芽孢杆菌 的同源性为 与贝莱斯芽 孢杆菌 及 的同源性为 图 图 拮抗菌形态 通过芽孢杆菌形态鉴定可知 均为圆形乳 黄色菌落 为圆形乳白色菌落 有一圈隆 起状圈中部分干燥 中心光滑呈花状 图 图 菌落形态 结合以上部分 通过形态学 分子生理学鉴定 得知 菌株 均为贝莱斯芽孢杆菌 生防机制 抑菌谱测定 室内对 株芽孢杆菌抑菌谱进行测定 并对其 年第 期 总第 期 试验研究 图 芽孢杆菌 的 系统发育树 图 芽孢杆菌 的 系统发育树 抑菌率进行方差分析 结果如图 和表 所示 发 现 菌株对辣椒炭疽病的抑菌效果最明 显 抑菌率分别为 株菌株对烟 草黑胫病也有抑制效果 抑菌率分别为 此外 对番茄灰霉病抑制效果较差 抑制率 分别为 株菌株对烟草黑胫病 番 茄灰霉病 辣椒炭疽病的抑制率不存在明显差异 图 株芽孢杆菌抑菌谱测定 表 株芽孢杆菌对 株病原真菌抑菌率测定结果 菌株辣椒炭疽病菌番茄灰霉病菌烟草黑胫病菌 注 不同小写字母表示差异显著 机制测定 由图 可知 株芽孢杆菌均在磷酸酯酶和纤 维素酶检测平板产生消解圈 表明其均能产生磷酸 酯酶和纤维素酶等物质 图 株芽孢杆菌纤维素酶和磷酸酯酶检测 试验研究 年第 期 总第 期 结论与讨论 本研究从采集的土壤中分离得到对黄连根腐 病有明显生防能力的 菌株 经形态学 生理生化和分子学鉴定 株菌株均为贝莱斯芽孢杆 菌 并发现 可以使黄连根腐病菌菌丝 膨大和畸形 对烟草黑胫病菌 番茄灰霉病菌和辣 椒炭疽病菌的病原菌均具有明显的抑制效果 对 株菌株的抑菌机理进行了初步的探究 发现其均可 产生纤维素酶和磷酸酯酶 具有降解真菌细胞壁 去磷酸化促进生长的潜力和产生伊枯草菌素 伊枯草菌素 等脂肽类物质从而防治植物病 原菌 程欢欢等研究发现 从辣椒根部土壤中筛选获 得的贝莱斯芽孢杆菌 可以抑制多种病原菌 生长 并且能产生纤维素酶和磷酸酯酶 而倪方 方等发现芽孢杆菌分泌的蛋白质酶 纤维素酶等能 致使真菌细胞壁破坏 导致真菌结构不稳定 使得 真菌菌丝膨大 畸形 从而直接抑制真菌的生长 菌株 不仅拥有广泛的抑菌谱 还可产 生纤维素和磷酸酯酶 这说明菌株 可 以分泌纤维素酶等物质直接抑制病原真菌的生长 自然环境下 能被植物直接吸收利用的无机磷较 少 但却有较多的有机磷 而有机磷可以被溶磷类 菌株有效地分解成无机磷并直接被植物吸收利用 有研究指出菌株 能够产生磷酸 酯酶 能高效地分解土壤中的有机磷 其解磷量可 高达 而菌株 和菌株 能使磷酸酯酶检测培养基产生消解圈 证明菌株 和菌株 具有分解土壤有机磷促进植物 生长的能力 生物防治是当代的研究热门方向之一 大量拮 抗菌如芽孢杆菌被用于生物防治 且已有芽孢杆菌 成为商业产品投入作物生产中 本次研究表明 菌 株 和菌株 具有较高的生防潜力 下一 步 将继续更深入的研究菌株 和菌株 的盆栽防效和促生作用 并对防御酶活性及主要抑 菌物质进行探究 以期为黄连根腐病菌提供更好的 生物防治方法 推动黄连的产业化发展 参考文献 程欢欢 杨芳 高晋 等 黄连根腐病病原鉴定及其对杀菌剂敏 感性测定 植物病理学报 穆向荣 马逾英 杨枝中 等 药用植物根腐病防治的研究进展 中药与临床 郑禄宇 常见根茎类中药材根腐病的为害与防治 植物医 生 沈永昶 曹贝贝 胡淼 等 三七根腐病原菌拮抗菌的筛选与活性分 析 浙江理工大学学报 自然科学版 游景茂 熊坤 穆森 等 内生细菌 的鉴定及对白术根腐 病的生物防治研究 中国中药杂志 郭庆港 王培培 董丽红 等 双组分系统对枯草芽 胞杆菌 菌落形态和芽胞形成的影响 植物病理学 报 蔡高磊 张凡 欧阳友香 等 贝莱斯芽孢杆菌 研究进展 北方园艺 陈爽 王继华 张必弦 等 贝莱斯芽孢杆菌对大豆根腐病盆 栽防效及防御酶活性检测 分子植物育种 方中达 植病研究方法 第 版 北京 中国农业出版 社 邱德文 我国植物病害生物防治的现状及发展策略 植物 保护 东秀珠 蔡秒英 常见细菌系统鉴定手册 北京 科学出版 社 程欢欢 姚伟伟 彭丽娟 等 一株辣椒炭疽病生防芽孢杆菌 的筛选 北方园艺 倪方方 徐红梅 宋腾蛟 等 生防菌对白术根腐病菌的拮抗 作用及盆栽防治效果 浙江中医药大学学报 晋婷婷 任嘉红 刘瑞祥 南方红豆杉根际解有机磷细菌的鉴 定及其解磷特性和促生作用研究 西北植物学报