银耳的分子生物学研究进展

北方园艺（）： ·专题综述·第一作者简介：王东（），男，硕士，副研究员，现主要从事转基因生物安全评价与研究等工作。：责任作者：郭灵安（），男，本科，副研究员，现主要从事食品安全风险评价等研究工作。： 基金项目：四川省财政创新能力提升工程专项资金资助项目（）。收稿日期：银耳的分子生物学研究进展王东，宋君，赵 树 海，雷 绍 荣，常 丽 娟，郭 灵 安（四川省农业科学院 分析测试中心，四川 成都；巴中市通江银耳科学技术研究所，四川 通江）摘要：银耳是我国珍贵的食用菌，具有很大的营养作用和药用功效，市场前景广阔。该研究初次系统地概述了银耳在分子生物学方面的研究进展，着重阐述了银耳的生物学分类，基因克隆、遗传转化、分子标记、基因组学等方面在银耳研究中的应用与发展，以期为进一步开展银耳的分子生物学研究提供参考依据。关键词：银耳；分子生物学；食用菌中图分类号： 文献标识码： 文章编号：（）银耳（ ），又名白木耳、雪耳，食、药两用，其营养价值和药用功效极高，是非常珍贵的食用真菌，有“菌中之冠”的美称。我国银耳的研究与栽培在全世界处于领先地位，以四川通江和福建古田等地区为银耳的道地产区，分别以段木（青杠木）栽培和代料（瓶栽、袋栽）栽培为代表；通江段木银耳的产量和质量居全国首位，全国的银耳为古田代料银耳。对银耳的研究主要集中在生物学特性、生产栽培、病虫害防治、加工技术、分离纯化、药用功能、经济价值、遗传育种等方面。基于核酸的银耳分子生物学研究始于世纪年代初，至今仍是研究的热点和前沿。该研究首次对基于核酸的银耳研究结果及现状进行了比较全面的综述，以期为银耳的分子生物学研究提供参考依据。 生物学分类传统的真菌分类依据是孢子的类型和有性态的有无，银耳隶属于真菌门（）、担子菌纲（）、银耳目（）、银耳科（）、银耳属（）。从系统学来看，根据形态特征对真菌分类存在诸多诟病和问题，不能充分反映物种的进化关系；从应用和方法学来说，真菌的形态结构也复杂多变，获得有性或无性器官所需时间较长。传统的真菌命名方法导致真菌命名复杂化，给相关研究带来诸多不便。随着以核酸（、）序列分析为主的分子系统学的广泛应用，“一种真菌一个名称”新规则为广大学者所接纳。等依据核糖体的个标记分子（、）的序列构建了银耳纲（）的分子系统发育关系。等通过比较分析（）、的核酸序列，结合形态与生理特征，构建了含银耳目（）等个目的世系分类。银耳在生物学分类中的最新研究结果为：真菌界（），担子菌门（），伞形亚门（），银耳纲（），银耳目（），银耳科（），银耳属（）。 核酸提取高质量的核酸是进行后续分子试验（、遗传转化、基因克隆等）的前提和保证。刘娟等采用法等种方法分别提取银耳芽孢基因组，通过评估的得率、纯度，扩增和酶切效果，确定法是这种提取方法中最适合银耳芽孢基因组提取的方法。银耳芽孢是核酸提取的主要材料，少有菌丝体和子实体提取报道。王凡华等用改良法的质量分数法提取银耳干品的，获得了较高质量的，适于扩增反应；此法提取的也适于分子标记和转基因成分检测。等以银耳子实体为材料，商品化的植物试剂盒提取出银耳的总，获得了，通过获得了编码银耳免疫调节蛋白（）基因的全序列。总的来讲，法提取的核酸质量较好，得率高，而商业化的试剂盒提取的核酸质量好，但得率相对较低。 基因克隆在食用菌中，大量的香菇和双孢蘑菇的基因被克隆，银耳的基因克隆也取得了一定的进展。微管蛋白是微管的重要组成蛋白，微管蛋白基因在真核生物中具有高度的序列保守性，作为管家基因之一，常用作内参照基因在荧光定量、抑制差减杂交、基因芯片和 等分子生物学试验中使用。董吉元等分别用和方法克隆了银耳微管蛋白基因的和全长序列，其全长 ，全长 ，含个内含子，编码个氨基酸；氨基酸序列中存在保守的结合区域，编码的蛋白质属于 超家族中的微管蛋白亚家族，银耳微管蛋白基因的序列与新型隐球酵母的相似性为，系统发育树显示银耳与新型隐球酵母距离最近。该研究可为鉴定银耳二型态相关的差异表达基因、银耳分子育种和系统发育研究提供参考，也可利用银耳微管蛋白基因的启动子构建高效的表达载体进行银耳转化与基因功能研究。聂燕华等用技术对用纤维二糖和乙醇种碳源诱导培养银耳芽孢的差异细胞，克隆了条特异性的差异表达基因片段，有条差异序列在纤维二糖、乙醇培养样品中各有表达，其中条与编码细胞色素基因具有较高同源性的序列在纤维二糖、乙醇下均表达，条与磷脂酶相关蛋白基因具有较高同源性的序列只在纤维二糖碳源下表达，条与编码细胞色素氧化酶亚基的基因具有较高同源性的序列只在乙醇碳源下表达。等用法克隆到银耳的序列，并用法从银耳中分离到编码银耳上游启动子序列，克隆的启动子能有效地驱动外源基因在银耳中表达。用反向长距离技术克隆了个具有活性的银耳内源启动子，分别为、，酶活测定表明大片段的启动子的表达活性更高，表明大片段具有更完整的表达元件，与已报道的其它启动子差异较大。用硫酸铵分级和离子交换层析分离到一种能激活原代小鼠巨噬细胞的免疫调节银耳蛋白，分子量为，为不含糖残基的同型二聚体蛋白；用末端快速扩增技术克隆到基因的序列，该序列长个核苷酸，其中开放阅读框由个核苷酸组成，编码的蛋白质含个氨基酸。 遗传转化 限制性内切酶介导转化谢宝贵等用限制性内切酶介导将人工合成的人胰岛素基因转化银耳芽孢，获得了个人胰岛素基因转化子；、这种内切酶都可介导转化获得大量转化子，并证明了银耳没有酶活性，对卡那霉素有较强的抗性，对潮霉素敏感。吴小平等用双酶切法成功构建了含人工合成的蜜蜂抗菌肽基因的银耳表达载体，表达载体的启动子为，终止子为，报告基因为。等用限制性内切酶法将透明颤菌血红蛋白基因（）转化银耳芽孢，在 启动子调节下，经和杂交分析，外源基因导入了银耳芽孢中。北方园艺月（下） 介导转化郭丽琼等首次利用香菇启动子和构巢曲霉启动子分别驱动潮霉素抗性基因在银耳芽孢中的表达，通过连续代转基因芽孢继代检测证明，的 能高效介导银耳原生质体的转化，香菇启动子能显著驱动外源基因在银耳芽孢中稳定遗传。阮玲云等首次用强启动子，利用介导转化法，将转入银耳芽孢中，验证结果表明红色荧光蛋白基因成功转入到银耳芽孢中且能表达。 电击转化法郭丽琼等首次利用电击法，以灵芝启动子分别与外源基因和选择性标记基因构建表达载体质粒和，共转化进银耳芽孢完整细胞，共转化率为；外源目的基因以单拷贝随机插入银耳芽孢转化子基因组中，能够在银耳芽孢中高效率表达。朱坚等用电穿孔转化法，以银耳菌株为受体，转化人乳铁蛋白基因，转化率达到×个·质粒，插入位点不专一，插入的拷贝数也不相同，基因在银耳中能正常转录成，但未检测是否有活性的人乳铁蛋白的产生。孙淑静等用电击法，将由双孢蘑菇启动子调节的绿色荧光蛋白基因成功地转化到银耳芽孢中，并能正确表达。 根癌农杆菌转化谢宝贵等最早报道了新霉素磷酸转移酶基因和潮霉素磷酸转移酶基因可用作转化银耳的筛选标记，基因可作为报告基因。等建立了一种根癌农杆菌转化方法，在含外源基因的载体转化银耳芽孢之前，先用金属微粒混合振荡损伤银耳芽孢，这种损伤法极显著地提高了根癌农杆菌转化效率。等以 为启动子，根癌农杆菌共转化乙肝表面抗原基因至银耳芽孢中，经、斑点杂交和小鼠口服转化的银耳芽孢试验证明，成功地转入银耳芽孢中且能获得表达蛋白。等以银耳组成型启动子调节，银耳芽孢为受体，根癌农杆菌转化平菇疏水蛋白基因，经、杂交、显微荧光、实时和蛋白电泳证实，转化成功并有活性蛋白产生。 超声波介导转化谢宝贵等用超声波介导转化银耳芽孢，获得了高达个· 以上转化子，这是比较理想的转化银耳芽孢的方法，有助于开展食用菌的遗传转化研究。 分子标记潘丽歌等用序列分析了一种危害银耳栽培的病菌真菌的序列与好食脉孢霉同源性超过，分子进化鉴定与形态分类结果一致，鉴定结果该病原真菌为好食脉孢霉；且好食脉孢霉的敏感药剂主要为多菌灵可湿性粉剂、三唑酮和百菌清。张春雷等用对个银耳段木栽培杂菌进行了系统发育分析，遗传距离为时，个菌株可以形成个明显分枝，分枝与地理来源之间没有明显的相关性；用分子标记分析了个杂菌的相关性，聚类分析表明，在的相似水平时，个菌株可划分为个类群，类群的划分也与地理来源没有明显相关性；因供试菌株的序列明显小于香灰菌，利用序列容易将杂菌与香灰菌分开。曲绍轩等用、和分子标记鉴定了个银耳菌株、，个标记都将个菌株分成了组，结果一致。鉴定的遗传相似性为平均值，鉴定的遗传相似性为平均值，鉴定的遗传相似性为平均值为，且种分子标记均未能将栽培上的色泽性状区分出来。 遗传多样性序列分析与扩增表明，银耳栽培杂菌之间在水平上存在比较显著的遗传变异，遗传相似性较低，具有较丰富的遗传多样性，且与地理来源之间无明显相关性。孙淑静等用个和个分子标记分析了福建省不同来源的株银耳芽孢多样性，聚类分析结果表明，福建省栽培菌株的芽孢与野生采集分离的银耳菌株的芽孢存在一定的差异，但栽培菌株之间没有差异，表明其栽培菌种来源单一，遗 第期北方园艺传背景狭窄。香灰菌是银耳菌的重要伴生菌，一直以来关于香灰菌的分类存在较大争议，等用序列分析和有性态的形态分析认为，在中国野生和栽培用的香灰菌均为暗色环纹炭团菌 。 基因组学研究杨双熙等用抑制性差减杂交技术，以银耳芽孢和菌丝为检测对象分别构建了正向差减文库和反向差减文库，个文库中分别有和的基因得到功能注释，这些基因包含信号传导、调控翻译、分子伴侣、催化、调节、结合与运输等方面；用技术进一步对种型态的个基因片段检测发现，丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶催化亚基、锌指肽酶结合域基因、激酶基因、细胞壁生化合成相关蛋白基因、琥珀酰辅酶基因、酮酸辅酶转移酶基因等在正、反个文库中表达差异明显。这个文库的构建为克隆银耳二型态相关基因和从分子水平上阐明银耳二型态的发生机理奠定了基础。黄晓星等以大肠杆菌为宿主细胞，构建了银耳菌株芽孢的文库，通过密码子在线软件分析，确定了个编码银耳蛋白基因的高频密码子，银耳密码子含量为，且密码子第三位碱基的含量高达，表明编码银耳基因的密码子偏好以或结尾。等对银耳菌株进行基因组测序，测试结果表明，基因组全长，预测基因为 个，编码 个蛋白，与数据库匹配值为；与银耳属的其它种相比，银耳密码子第三位碱基特别偏爱以或结尾。邓优锦等对个银耳栽培菌株和个野生菌株进行了全基因组重测序，其线粒体基因组大小在 ，含量为；个线粒体基因组均包含有个保守的蛋白编码基因，各一个大小亚基和数量不同的基因。各线粒体基因组的内含子含量为个，总计检测到个不同的内含子，利用内含子的多态性设计了对特异性分子标记，检测结果为不同来源的个菌株为同一品系，表明这些菌种厂的种质资源单一，遗传背景狭窄。 展望银耳是非常珍贵的药食用菌，已作为营养保健食品、休闲方便食品、食品添加剂、护肤化妆品和环境保护等方面得到广泛应用，其商业价值和市场潜力较大。银耳的生活史上具有酵母状的分生孢子，并因银耳无食副毒作用，银耳孢子已成为理想的遗传转化受体，用 、灵芝、香菇、双孢蘑菇、内源等启动子调节，终止子用、作为报告基因，作为选择标记基因，已成功转化了多个外源基因至银耳芽孢中。银耳的基因克隆和分子标记等也取得了一些进展。伴随着生活水平的提高，人们对转基因的食用性安全也非常关注，在棉籽壳栽培银耳中已检出和基因的特异片段，未检到转基因棉花外源基因的特异片段，也应重视银耳的转基因食用安全性研究。截止到年月日，在数据库中有关银耳的数据，登记的基因组数据为个，条核苷酸（和）序列，个蛋白质序列，个功能基因，个分子系统发育和种群的研究；香灰菌是银耳的生伴生菌，而香灰菌的的分子生物学研究报道核苷酸（和）序列只有条，个蛋白质序列，个分子系统发育和种群的研究。相对其它作物和食用菌的研究来讲，银耳的分子生物学研究还需加强；也应开展银耳菌和香灰菌伴生关系的分子研究，从分子水平揭示二者的遗传和进化关系，进一步为银耳的育种和生产奠定理论基础。随着分子生物学技术和生物信息学的发展，银耳菌和香灰菌基因组信息的不断丰富，更多的基因功能被注释，培育出更多的优质银耳新品种，对银耳的种质资源开发和生产应用具有重要意义。（该文作者还有张富丽、刘文娟、尹全，单位同第一作者。）参考文献景晓卫，赵树海，李晓通江银耳产业发展竞争力对比分析山西农业科学，（）：彭卫红，王勇，黄忠乾，等我国银耳研究现状与存在问题食用菌学报，（）：北方园艺月（下）黎勇，王晓东，高敏我国银耳的研究历史及现状北方园艺，（）：罗信昌中国银耳研究之历史回顾中国菌物学会第四届会员代表大会暨全国第七届菌物学学术讨论会论文集： ， ，：余霞，杨丹玲，陈进会，等真菌的分类现状及鉴定方法中国植物病理学会年学术年会： ： ，（）： ， ， ， （，） ，： ， ， ， ，：刘娟，马爱民，杨江涛，等银耳芽孢基因组五种提取方法的比较食品科学，（）：王凡华，马务迢，谭庆云，等银耳干品的提取及随机扩增多态性分析食品科学，（）： ， ， ， ，：董吉元，杨双熙，陈叶叶，等银耳微管蛋白基因的克隆及序列分析园艺学报，（）：聂燕华，王杰，林俊芳，等银耳芽孢的诱导培养及其差异基因片段的克隆现代食品科技，（）：， ， ， ， 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曲周实验站，河北 邯郸；山东乐陵市农业局，山东 乐陵）摘要：裂果是我国枣生产中面临的主要问题之一。作为果实发育过程中一种生理性病害，裂果会导致枣果商品价值严重降低，给枣产业发展带来严重损失。该研究主要从枣裂果的类型、枣树品种、果实解剖结构、矿质元素含量和分布、果皮性能、遗传因素、外界环境等方面对裂果机理的研究进行汇总分析，并结合生产中枣裂果问题提出相应的防治管理措施。关键词：枣裂果；影响因素；防治措施中图分类号： 文献标识码： 文章编号：（）枣（ ）属鼠李科（）枣属（）植物，是我国特有的果品之一，因其营养价值丰富，深受广大消费者喜爱。我国占有世界上以上的枣树资源和近的枣产品国际贸易。枣树在我国大部分地区均有栽培，但传统经济枣树主要分布在河北、山东、河南、山西和陕西省，栽培面积约占全国的以上。近几年，新疆枣产业发展迅猛，截至年，枣种植面积已达到万，产量占到全国总产量的。目前，我国枣树栽培面积约为万，位居全国果树面积第三，居干果之首。尽管如此，枣生产中存在诸多问 ， ， ， ， ， ， ， ， （ ， ， ； ， ）： ， ， ， ， ： ； ；