青枯病植物疫苗对番茄根系土壤微生物群落结构的影响.pdf
<p>33(3)385-393 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2017 年 6 月 收稿日期： 2016-12-29 基金项目：国家公益 性行业（农业）科研专项（ 201303015） ；福建省自然科学基金（ 2015J01103） ；福建省农业科学院青年人才创新基金（ YC2016-15） 作者简介：郑雪芳，副研究员， E-mail： zhengxuefangfz163.com； *通信作者，研究员， E-mail： liubofaas163.com。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2017.03.013 青枯病植物疫苗对番茄根系土壤微生物群落结构的影响 郑雪芳，刘 波*，朱育菁 （福建省农业科学院农业生物资源研究所，福州 350003） 摘要： 为了探讨青枯雷尔氏菌无致病力菌株 FJAT1458 作为青枯病植物疫苗菌株对番茄根系土壤微生物群落结构的影响， 利用磷脂脂肪酸 （ phospholipid fatty acids， PLFAs） 生物标记法研究植物疫苗菌株 FJAT1458接种处理后番茄根系土壤微生物 PLFAs 组成、含量、微生物群落结构及多样性的变化。结果表明，与清水对照相比，接种菌株 FJAT1458 后，番茄根系土壤微生物脂肪酸组成及含量发生了明显变化，可分为减少型、无变化型和增加型。进一步分析表明，菌株 FJAT1458 能促进番茄根系土壤微生物总量、细菌总量和真菌总量的增加，增加幅度分别为 5.98% 47.36%、 2.07% 58.07%和 5.65% 74.42%，对放线菌生长起到先抑制后促进作用。此外，接种菌株 FJAT1458 后番茄根系土壤微生物群落的 Shannonwiener 指数显著增加， 21 d 增加量最高（ 13.32%） 。聚类分析表明，菌株 FJAT1458 处理组与对照组的番茄根系土壤微生物均划分为 3 个群落类型（兰氏距离分别为 3.28 和 4.62） ，但它们各自群落组成及特征不同；同时主成分分析也将 2 种处理划分在 2 个不同类群中。 上述结果说明菌株 FJAT1458 处理能明显改变番茄根系土壤微生物群落结构，增加其多样性，从而提高土壤微生态系统的稳定性，增强土壤抑制病害能力。 关 键 词： 植物疫苗；番茄；土壤微生物群落结构；磷脂脂肪酸 中图分类号： S476 文献标识码： A 文章编号： 1005-9261(2017)03-0385-09 Effects of Avirulent Ralstonia solanacearum Strain as Plant Vaccine on Microbial Community in Rhizosphere Soil of Tomato ZHENG Xuefang, LIU Bo*, ZHU Yujing (Agricultural Bio-Resources Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China) Abstract: In order to explore the effect of avirulent Ralstonia solanacearum strain FJAT-1458 as plant vaccine on microbial community structures in tomato rhizosphere soil, tomato plants were inoculated by FJAT-1458 with water as a control. Then the rhizosphere soil was sampled at 3, 6, 9, 12, 15, 18 and 21 d after treatment, respectively. Phospholipid fatty acids (PLFAs) of soil samples were detected using Agilent 6890 N. The results showed that PLFAs composition and content in tomato rhizosphere soil were significantly altered by inoculation of FJAT-1458, which could be divided into decreasing type, unchanging type and increasing type. Further statistical analysis showed that the inoculation of FJAT-1458 could increase the content of total microbes, bacteria and fungi by 5.98% 47.36%, 2.07% 58.07% and 5.65% 74.42%, respectively. Growth of actinomycetes was inhibited at the beginning and then improved by FJAT-1458 inoculation. Moreover, inoculation of FJAT-1458 could increase the microbial community diversity in tomato rhizosphere soil, and the enhancement of Shannon-wiene index was the most significant, with the highest value of 13.32% at 21 d after inoculation. Cluster analysis revealed that the microbe in tomato rhizosphere soil both in FJAT-1458 treatment and control could be divided into three communities at 3.28 and 4.62 Lance distance, but constitutes and characters of PLFAs between the two treatments were different. Principal component analysis demonstrated that the two treatments could also be distinguished into 386 中 国 生 物 防 治 学 报 第 33 卷 two different groups. All these suggested that inoculation of FJAT-1458 could alter microbial community structure in tomato rhizosphere soil and increase its diversity, and further improve the stability of soil micro-ecosystem and the ability for bacterial wilt disease control. Key words: plant vaccine; tomato; soil microbial community structure; PLFAs 番茄青枯病是由青枯雷尔氏菌 Ralstonia solanacearum 引起的一种毁灭性土传病害1。近年来，随着农业种植结构的调整，蔬菜种植面积扩大，复种指数连年提高，番茄青枯病的发生与危害呈逐年加重趋势，据调查，轻病田减产 10%，重病田减产 50%以上，严重制约着番茄种植面积的扩大和经济效益的提高2。尽管对番茄青枯病的防治已有很多研究报道，如栽培措施、作物轮作、抗性品种及药剂防治等，但当茬番茄发病未见有效的防治措施3。 青枯雷尔氏菌在自然条件下存在着丰富的致病力分化，形成强致病力菌株、过渡型菌株和无致病力菌株4-6，其无致病力菌株可以侵染植株，对植株不造成病害，在导管及相邻组织内蔓延，形成免疫抗病特性，延缓或防止植株发病7。利用青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株防治作物青枯病是目前国际上研究热点，研究人员通过自然分离筛选、辐射诱变、基因工程（转座子 Tn5 插入）等途径获得青枯雷尔氏菌的无致病力突变菌株，用于防治青枯病，均取得良好的防治效果8-10。刘波等11提出利用青枯雷尔氏菌无致病力菌株作为植物疫苗，在作物苗期预先接种，可对青枯病的防治起到良好的作用。作者经多年研究筛选到一株对番茄青枯病防效好， 性状稳定的青枯雷尔氏菌无致病力菌株 FJAT1458， 利用该菌株研发青枯病植物疫苗，在田间应用取得理想效果12。 许多研究证明青枯雷尔氏菌无致病力菌株能有效地控制青枯病的发展，并从多种途径解析其作用机理，如诱导抗性、营养竞争、免疫抗病等。已有文献报道青枯病发生与植株根系土壤微生物群落结构关系密切13,14，如匡传富等13研究表明烟草青枯病发病重土壤中细菌和真菌含量高，放线菌含量低，发病轻田块土壤则相反。传统对土壤微生物群落结构研究是稀释平板分离微生物，分离出的微生物只占总数 0.1%1%，不能全面反映土壤微生物多样性信息15。磷脂脂肪酸（ phospholipid fatty acids， PLFAs）生物标记具有微生物种类遗传稳定性16，可以标识出微生物种类和数量，用于检测土壤样本中微生物群落的变化，具有方法简便、可定量分析、精确度高等特点17。利用 PLFAs 生物标记研究，有望观察到青枯病植物疫苗施用到番茄根部控制青枯病过程根际微生物群落结构变化，从微生物群落的角度寻找植物疫苗防病机制。相关的研究未见报道。 本研究对番茄植株接种青枯病植物疫苗菌株 FJAT1458（青枯雷尔氏菌无致病力菌株），采用 PLFAs标记研究接种后番茄植株根系土壤微生物脂肪酸组生态学特性的变化， 分析植物疫苗菌株 FJAT1458 对番茄根系土壤微生物群落结构的影响，从生态学角度揭示青枯病植物疫苗构建的根际微生物群落影响番茄免疫抗病的机制，为青枯病植物疫苗作用机制的解析提供新思路。 1 材料与方法 1.1 供试材料 供试番茄品种为金石王 1 号（厦门如意集团开发有限公司）。青枯病植物疫苗菌株 FJAT1458 分离于感染番茄青枯病的田块中表现健康的植株，由福建省农业科学院农业生物资源研究所菌种库收集保存。培养青枯雷尔氏菌的固体培养基 TTC 的配制参照 Kelman18，液体培养基为 SPA（蔗糖 20 g，蛋白胨 5 g，KH2PO4 0.5 g， MgSO4 0.025 g，定容至 1 L， pH 7.0）。 1.2 菌株 FJAT1458 接种番茄植株和取样方法 菌株 FJAT1458 在 TTC 平板上活化后，接种于 SPA 培养基中， 30 、 170 r/min 培养 48 h，菌液稀释至 1× 108cfu/mL，伤根接种于 5 6 叶龄的番茄盆栽苗上（番茄苗种植于直径 15 cm，高 10 cm 的塑料盆，育苗基质土购自厦门银农种苗有限公司， 3 kg/盆， 1 棵 /盆），接种量为 80 mL/盆，每个处理 30 盆，设清水对照 30 盆。在接种后第 3、 6、 9、 12、 15、 18 和 21 d 取样。取样方法：分 3 组取样，为 3 个重复，即每 10 盆处理组和 10 盆对照组为 1 组，收集离表层约 5 cm 的根系土壤，每盆土样约 5 g，再将相同处理 第 3 期 郑雪芳等：青枯病植物疫苗对番茄根系土壤微生物群落结构的影响 387 组和对照组的各小样混合、拌匀、碾碎，通风阴凉处自然晾干，过 40 目筛， 80 冰箱保存备用。 1.3 PLFAs 分析方法 土壤样本 PLFAs 提取和分析方法参照 Frostegård 等19和 Kourtev 等20方法进行。 具体步骤如下： 50 mL离心管中加入 10 g 土壤样本和 20 mL 0. 2 mol/L 的 KOH 甲醇溶液，涡悬、充分混匀， 37 水浴 1 h，释放脂肪酸并甲酯化；加入 3 mL 1.0 mol/L 醋酸溶液，涡悬、充分混匀，中和 pH；加入 10 mL 正己烷，充分摇匀，使脂肪酸转到有机相中， 2000 r/min 离心 15 min，将上层正己烷相转入干净玻璃试管中，利用 N2吹仪吹干有机溶剂；加入 0.5 mL 体积比为 1:1 的正己烷和甲基叔丁基醚混合溶液，充分溶解，转入 GC 小瓶，用于 PLFAs 测定。 采用 Agilent 6890 N 型气相色谱仪测定样本的 PLFAs：分流进样，分流比为 100:1，进样量 l L，载气为氢气，流速 2 mL/min，尾吹气为氮气，流速为 30 mL/min。二阶程序升高柱温：以 5 /min 的速率使柱温由 170 升至 260 ；再以 40 /min 的速率升温至 310 ，保持 90 s。汽化室温度为 250 ，检测器温度为 300 ，柱前压 10.00 Psi。采用美国 MIDI 公司开发的 Sherlock MIS 4.5 系统进行 PLFAs 成分分析，系统根据各组分保留时间计算等链长（ ECL）值以确定目标组分的存在，采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量。 1.4 数据统计与分析 1.4.1 微生物种类的 PLFAs 生物标记的识别 磷脂脂肪酸是活体微生物细胞膜的重要组分， 可以很好地标识微生物的生物量21。其中， 16:15c、 18:15c、 18:17c、 18:19c、 18:26,9c 等多烯脂肪酸为真核生物所独有22，其总和可指示真菌生物量；而一些含有以酯链与甘油相连的饱和或单不饱和脂肪酸如 i15:0、a15:0、 16:0、 i16:0 等的总和可代表细菌生物量，指示土壤细菌分布数量23；指示放线菌的脂肪酸种类有10Me16:0、 10Me17:0 和 10Me18:024，各类群微生物对应的磷脂脂肪酸标记具体见表 1。 微生物总量 每种 PLFAs 含量；细菌总量 （ 12:0 14:0 16:0 18:0 19:0 20:0 i14:0i15:0 i16:0 i17:0 a15:0 a16:0 a17:0 cy17:0 cy19:08c i15:0 2OH 16:1 2OH）；真菌总量 （ 16:15c 18:15c 18:17c 18:19c 18:26,9c）；放线菌总量 （ 10Me16:0 10Me17:010Me18:0）。 表 1 估算各类群微生物的磷脂脂肪酸标记 Table 1 PLFAs biomarkers for calculating soil microbial biomass 微生物类型 Microbial type 磷脂脂肪酸标记 PLFAs biomarkers 参考文献 Reference 细菌 Bacteria in genera 12:0、 14:0、 16:0、 18:0、 19:0、 20:0、 i14:0、 i15:0、 i16:0、 i17:0、 a15:0、a16:0、 a17:0、 cy17:0、 cy19:08c、 i15:0 2OH、 16:1 2OH 23,25 革兰氏阳性菌 Gram positive bacterial i14:0、 i15:0、 i16:0、 i17:0、 a15:0、 a16:0、 a17:0 26,27革兰氏阴性菌 Gram negative bacterial cy17:0 26,28 好氧细菌 Aerobic bacteria i14:0、 i15:0、 a15:0、 i15:0 2OH 29 嗜热解氢杆菌 Hydrogeno bacteria 18:0 30 伯克霍尔德菌 Burkholderia bacteria cy19:08c 19放线菌 Actinobacteria 10Me16:0、 10Me17:0、 10Me18:0 21,24真菌 Fungi 16:15c、 18:15c、 18:17c、 18:19c、 18:26,9c 22 1.4.2 微生物群落多样性指数分析 引入群落生态学丰富度指数 ShannonWiener 和优势度指数 Simpson分析不同处理及时间番茄根系土壤微生物群落的多样性。按照计算物种指数方法31计算各指数值。ShannonWiener 指数： H PilnPi； Simpson 指数： C 1 （ ni/N）2。式中， S 为群落中的脂肪酸总种类数， Pi ni/N， ni为 i 类脂肪酸个数， N 为该试验中总脂肪酸个数。 1.4.3 聚类分析 采用 DPS 7.05 软件，以 PLFAs 生物标记为样本，以其在不同处理及取样时间分布数量为指标，构建矩阵，将数据进行中心化处理，以兰氏距离为聚类尺度，类平均法对数据进行聚类，分析接种植物疫苗对番茄根系土壤微生物群落结构的影响。 1.4.4 主成分分析 采用 DPS 7.05 软件，以供试样品为样本，以每种 PLFAs 在供试样品的分布量为指标， 388 中 国 生 物 防 治 学 报 第 33 卷 进行主成分分析，主成分分析过程采用 DPS 7.05 软件的相关模块进行处理，主要包括求协方差矩阵、计算特征方程中所有特征值、根据特征值累积百分率确定主成分的数量、计算主成分载荷值和主成分分析因子得分等，具体步骤参见文献 32。 2 结果与分析 2.1 植物疫苗接种后番茄根系土壤微生物 PLFAs 测定 菌株 FJAT1458 接种后第 3、 6、 9、 12、 15、 18 和 21 d 的番茄根系土壤分别检测到 25、 25、 24、 24、24、 25 和 24 种 PLFAs，对照组第 3、 6、 9、 12、 15、 18 和 21 d 的番茄根系土壤分别检测到 23、 21、 20、23、 21、 21 和 18 种 PLFAs。 PLFAs 的种类繁多，包含各种饱和磷脂脂肪酸如 12:0、 14:0、 16:0 等，不饱和的磷脂脂肪酸如 16:15c、 18:15c、 18:17c 等，分支的磷脂脂肪酸如 a15:0、 a16:0、 a17:0 等，环化脂肪酸如 cy17:0 和 cy19:08c。 2.2 植物疫苗接种番茄根系土壤微生物 PLFAs 组成及含量变化 统计菌株 FJAT1458 接种处理和对照组的番茄根系土壤在取样期内各微生物 PLFAs 总含量，计算植物疫苗菌株 FJAT1458 接种后番茄根系土壤各类微生物 PLFAs 总量增加或降低百分比。与对照相比，菌株 FJAT1458 处理后，可将 PLFAs 含量的变化分为 3 类，第 1 类为减少型：（ 1）指示细菌的饱和脂肪酸12:0、 14:0、 18:0、 19:0 和 20:0 含量减少幅度为 15.49% 41.12%；（ 2）指示革兰氏阳性细菌的分支脂肪酸 i17:0 和 a16:0，二者的含量分别降低 15.00%和 16.67%；（ 3）环化脂肪酸 cy19:08c 和羟基脂肪酸16:1 2OH 含量分别降低 23.03%和 17.99%。第 2 类为无变化型：包含了细菌特征的脂肪酸 16:0 和放线菌特征的脂肪酸 10Me16:0。 第 3 类型为增加型： （ 1） 指示真菌的不饱和脂肪酸 16:15c、 18:15c、 18:17c、18:19c 和 18:26,9c 的含量均增加，增加幅度为 9.53% 91.40%；（ 2）分支脂肪酸除了 i17:0 和 a16:0为减少型，其他均为增加型，其含量增加幅度为 29.14% 207.27%。（ 3）指示革兰氏阴性细菌的环化脂肪酸 cy17:0 含量增加了 56.68%（图 1）。 12:014:016:018:019:020:0i14:0i15:0i16:0i17:0a15:0a16:0a17:010Me 16:010Me 17:010Me18:016:1 5c18:15c18:1 7c18:19c18:26,9ccy17:0cy19:0 8ci15:0 2OH16:1 2OHPLFAs含量增加或降低百分比Percentage ofincreasing or decreasing PLFAscontent (%)图 1 菌株 FJAT1458 接种后取样期内番茄根系土壤微生物各类型 PLFAs 总量比对照增加或降低百分比 Fig. 1 Percentage of increasing or decreasing of PLFAs content in tomato root zone soil under strain FJAT1458 treatment during sampling times, while compared with water control 2.3 植物疫苗接种对番茄根系土壤 PLFAs 标识特征微生物数量变化动态 菌株 FJAT1458 处理后的不同时间番茄根系土壤微生物总量均比对照组高， 增加量为 5.98% 47.36%（图 2A），其中菌株 FJAT1458 处理后 15 和 21 d 增加量分别为 47.36%和 24.89%，达极显著水平（ P0.01），其他处理时间的差异达显著水平（ P 0.05），说明接种菌株 FJAT1458 能够富集番茄根系土壤的微生物。 进一步分析发现， 菌株 FJAT1458 处理能够促进番茄根系土壤细菌的生长， 增加幅度为 2.07%58.07%，但是除了处理后 15 d（增加量为 58.07%）和 21 d（增加量为 29.92%）的差异达极显著（ P 0.01）第 3 期 郑雪芳等：青枯病植物疫苗对番茄根系土壤微生物群落结构的影响 389 外，其余处理时间的差异未达显著水平（图 2B）。菌株 FJAT1458 处理后不同时间对番茄根系土壤真菌促长与细菌相似，增加量为 5.65% 74.42%（图 2C）。与对照相比，菌株 FJAT1458 处理后番茄根系土壤放线菌含量先降低后增长，但均未达显著水平（图 2D）。 微生物总量Contentof totalmicrobes (nmol/g)细菌总量Content oftotalbacteria (nmol/g)真菌总量Contentof totalfungi (nmol/g)放线菌总量Contentoftotal actinomycete (nmol/g)注： *表示 0.05 水平差异显著， *表示 0.01 水平差异显著。 Note: * indicated significant difference at 0.05 level, and * indicated significant difference at 0.01 level 图 2 菌株 FJAT1458 接种后不同时间番茄根系土壤 PLFAs 标识的特征微生物含量的变化 Fig. 2 Alternation of PLFAs content related to the special microbe in the tomato root zone soil under strain FJAT1458 treatment at different sampling times 2.4 植物疫苗接种对番茄根系土壤微生物群落结构多样性影响 Simpson 指数反映群落中常见的物种数量， Shannonwiener 指数反映群落中物种的丰富度33。与对照相比，取样期内菌株 FJAT1458 处理的番茄根系土壤微生物群落的 Simpson 指数增加，但差异不明显，Shannonwiener 指数均比对照高，且差异显著，处理后 21 d，菌株 FJAT1458 处理的 Shannonwiener 增加量最高达 13.32%（表 2）。 表 2 菌株 FJAT1458 接种后不同时间番茄根系土壤微生物群落多样性指数 Table 2 Microbial community diversity index of tomato root zone soil under strain FJAT1458 treatment at different sampling times Simpson 指数 Simpson index Shannon-Wiener 指数 Shannon-Wiener index 项目 Items 3 d 6 d 9 d 12 d 15 d 18 d 21 d 3 d 6 d 9 d 12 d 15 d 18 d 21 d 处理 Treatment 0.94 a 0.94 a 0.93 a 0.93 a 0.94a 0.94 a 0.94 a 4.29 a 4.19 a 4.15 a 4.17 a 4.18 a 4.18 a 4.17 a对照 Control 0.93 a 0.92 a 0.92 a 0.94 a 0.93 a 0.94 a 0.92 a 4.14 b 3.97 b 3.92 b 3.82 b 3.93 b 3.93 b 3.68 b注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著（ P 0.05）。 Note: Data followed by the different lowercase letters within a column indicated significantly different (P 0.05). 2.5 植物疫苗接种对番茄根系土壤微生物群落分化的影响 接种植物疫苗菌株 FJAT1458 和对照对番茄根系土壤微生物群落分化影响不同，当兰氏距离为 3.28时，可将菌株 FJAT1458 处理的番茄根系土壤微生物 PLFAs 生物标记划分为 3 个群落类型，类型包含12:0、 20:0、 a16:0 和 16:1 2OH 4 条 PLFAs 生物标记，其特征是脂肪酸生物标记在各样本中分布量小；390 中 国 生 物 防 治 学 报 第 33 卷 类型共有 17 条 PLFAs， 分别为 14:0、 10Me17:0、 16:15c、 18:0、 cy19:08c、 i17:0、 10Me18:0、 cy17:0、19:0、 a17:0、 18:17c、 18:26,9c、 i15:0 2OH、 10Me16:0 和 i14:0，其特征为分布量中等；类型含有16:0、 a15:0、 i15:0、 i16:0、 18:19c 和 18:15c 共 6 条脂肪酸生物标记，其特征是分布量大（图 3A）。 当兰氏距离为 4.62 时，可将对照处理的番茄根系土壤微生物 PLFAs 生物标记划分为 3 个群落类型，类型包含 12:0、 a16:0、 16:15c、 20:0、和 i15:0 2OH 5 条 PLFAs 生物标记，其特征为不完全分布类型即只在部分样本中分布， 且分布量小； 类型共有 18 条 PLFAs， 分别为 14:0、 10Me17:0、 i17:0、 18:17c、a17:0、 10Me18:0、 16:1 2OH、 19:0、 18:26,9c、 i15:0、 i16:0、 a15:0、 10Me16:0、 18:15c、 18:0、 18:19c、cy19:08c 和 cy17:0，其特征为分布量不均匀，在有些样本中分布量较大，而在另一些样本中分布量低或没有分布； 类型只含有 16:0 一条脂肪酸生物标记， 其特征是分布量大， 且在各样本中均有分布 （图 3B） 。 兰氏距离 Lance distance0.00 0.82 1.64 2.46 3.28 4.10 0.00 0.95 1.90 2.86 3.81 4.76兰氏距离 Lance distance12:020:0a16:016:1 2OH14:010Me 17:016:15c18:0cy19:08ci17:010Me 18:0cy17:019:0a17:018:17c18:26,9ci15:0 2OH10Me16:0i14:016:0a15:0i15:0i16:018:19c18:15c12:0a16:016:15ci14:020:0i15:0 2OH14:010Me 17:0i17:018:17ca17:010Me 18:016:1 2OH19:018:26,9ci15:0i16:0a15:010Me16:018:15c 18:018:19ccy19:08ccy17:016:0AB图 3 菌株 FJAT1458 处理 （ A） 和对照 （ B） 的番茄根系土壤微生物群落 PLFAs 聚类分析 Fig. 3 Cluster analysis of PLFAs structures in the tomato root zone soil under strain FJAT1458 treatment (A) and control (B) 2.6 植物疫苗接种后番茄根系土壤微生物群落时间动态的主成分分析 主成分 1（ PC1）和主成分 2（ PC2）将菌株 FJAT1458 处理和对照不同时间的番茄根系土壤分别划分在 2 个不同类群。菌株 FJAT1458 处理不同时间的番茄根系土壤与 PC1呈正相关，对照不同时间的番茄根系土壤与 PC1呈负相关。 菌株 FJAT1458 处理 3 d 的番茄根系土壤与对照 3 d 的番茄根系土壤在 PC1和 PC2坐标的零点附近，说明接种植物疫苗菌株 FJAT1458 初期对番茄根系土壤微生物群落结构影响不大。菌株FJAT1458 处理 6 d 的番茄根系土壤与 PC1和 PC2均表现出高度的正相关，与对照 6 d 的番茄根系土壤相距较远，说明菌株 FJAT1458 处理 6 d 后番茄根系土壤微生物群落结构发生明显的变化。菌株 FJAT1458处理 12、 15、 18 和 21 d 番茄根系土壤聚集在较近的距离，说明菌株 FJAT1458 处理后期，番茄根系土壤微生物群落结构趋于稳定的状态（图 4）。 3 讨论 植物根系土壤是一个特殊的环境，栖居着大量微生物34。这些微生物的种类和数量对根系土壤有机物转化、植株养分吸收、生长发育及其抗病能力都具有明显的影响35。番茄青枯病是一种典型系统性侵染的土传病害，土传病害的发生与植株根系土壤微生物群落结构密切相关，土壤微生物的健康状态，即土壤病原菌少，益生菌多，能阻止或延缓病害的侵染。接入大量人工筛选的生防菌可以改变土壤微生态系统中微生物的组成，增加有益菌数量，抑制病菌的繁殖36。本研究发现青枯病植物疫苗菌株 FJAT1458 接种番茄植株，能改变其根系土壤 PLFAs 标识的微生物组成及含量，可分为减少型、无变化型和增加型，表明 第 3 期 郑雪芳等：青枯病植物疫苗对番茄根系土壤微生物群落结构的影响 391 43210-1-2-3-4-5-6-4 -3 -2 -1 01234CK9 dCK3 dCK6 dCK12 dCK15 dCK18 d CK21 dTR3 dTR6 dTR9 dTR12 dTR15 dTR18 dTR21 dPC1(61.67%)PC2(21.79%)图 4 菌株 FJAT1458 处理 （ TR） 和对照 （ CK） 的番茄根系土壤微生物群落时间动态的主成分分析 Fig. 4 PCA analysis of microbial community in the tomato root zone soil under strain FJAT1458 treatment (TR) and control (CK) PLFAs 所标识的不同种类微生物对菌株 FJAT1458 接种后番茄根系土壤的响应不同。有研究发现苗床拌土接种生防菌可显著改变辣椒根域微生物组成和数量，从而减少病害37，本文的研究结果与其吻合。 微生物是土壤生态系统的重要因子，在自然界同一环境中许多微生物群体组成一个群落，在有限的自然环境中通过生物间的相互作用，经过自然选择最终达到平衡，一种外源菌的加入会影响到这种平衡，最终由环境决定其存亡38。本研究发现，菌株 FJAT1458 处理后的不同时期番茄根系土壤 PLFAs 标识的微生物总量均比对照组高，说明接种植物疫苗菌株 FJAT1458 能改变根系土壤微生物种群结构，能够促进番茄根系土壤细菌和真菌的生长，对放线菌先促进后抑制其生长（其中土壤细菌数量的增长，也不排除由于菌株 FJAT1458 接种的缘故），研究结果与朱伟杰等39报道相反，生防菌荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens 2P24 处理甜瓜根围土壤会抑制土壤中细菌和真菌的生长， 促进放线菌生长。 与 Rogers 和 Burns40研究得出结论一致，研究发现土壤中接入固氮灰色念珠藻能促进细菌和真菌的生长。郁雪平等41研究发现生防木霉菌 Th2 和 T4 对甜瓜根围土壤细菌有明显的促生作用，而对真菌和放线菌有明显的抑制作用。前人不同的研究结果表明不同生防菌对不同作物根系土壤微生物种群结构的影响不同，因此，探索生防菌对土壤微生物群落结构的影响，对生防菌的安全应用具有重要参考价值。 Steenwertha 等42指出土壤微生物群落及其多样性反映土壤环境质量的变化， 其特征可作为生物指标指示土壤质量。当土壤微生物群落结构越丰富，物种越均匀，多样性越高时，土壤质量越好，对病原菌的防控能力越强43。 Yoshitaka 等44研究发现抗青枯病番茄根系土壤微生物群落的多样性显著高于感病土壤中微生物的群落多样性。朱伟杰等39研究发现，生防菌 2P24 在甜瓜根围土壤的释放对微生物多样性造成一定的影响， ShannonWiener 指数有所提高。本研究发现，接种植物疫苗菌株 FJAT1458 后番茄根际土壤的 ShannonWiener 指数在不同时期均有所提高，与对照相比，差异达显著水平，表明接种菌株 FJAT1458能提高番茄根系土壤中微生物群落结构多样性，从而提高土壤微生态系统的稳定性、提升土壤质量、增强土壤抑制病害能力。 参 考 文 献 1 Hayward A C. Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearumJ. Annual Review</p>
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