人参茎叶总皂苷对黄瓜白粉病菌的活性影响研究

<p>2017 年 7 月 第 19 卷 第 7 期 中国现代中药 Mod Chin Med Jul. 2017 Vol. 19 No. 7·中药农业 · 基金项目 农业部公益性行业 ( 农业 ) 科研专项 ( 20130311) ; 吉林省科技发展计划项目 ( 20150204043N Y)* 通信作者 宋述尧 ， 教授 ， 研究方向 : 设施园艺工程及蔬菜生态生理研究 ; E-mail: sysongjlau 126. com;张连学 ， 教授 ， 研究方向 : 药用植物栽培与加工 ; E-mail: zlx863 163. com人参茎叶总皂苷对黄瓜白粉病菌的活性影响研究杨鹤 ， 宋述尧*， 许永华 ， 卢宝慧 ， 张连学*( 吉林农业大学 中药材学院 ， 吉林 长春 130118) 摘要 目的 : 为人参源杀菌剂的研发提供科学依据 。方法 : 通过洋葱球茎内表皮膜法研究人参茎叶总皂苷对黄瓜白粉病菌孢子萌发的影响 ， 采用盆栽法研究其对白粉病菌的温室防效 。结果 : 人参茎叶总皂苷对白粉病菌孢子萌发的 EC50为 5. 74 mg·mL 1; 温室防效的 EC50为 23. 51 mg·mL 1。结论 : 人参茎叶总皂苷可抑制黄瓜白粉病菌孢子萌发 ， 温室防效良好 ， 可进一步研发为中药杀菌剂 。 关键词 人参茎叶总皂苷 ; 白粉病菌 ; 孢子萌发 ; 防治效果 ; 杀菌剂Inhibitory Effects of Ginsenosides on Cucumber Powdery Mildew Fungus ( Sphaerotheca fuliginea) ActivityYANG He， SONG Shuyao*， XU Yonghua， LU Baohui， ZHANG Lianxue*( College of Chinese Traditional Medicine， Jilin Agriculture University， Changchun 130118， China) Abstract Objective: This study is aimed to provide scientific basis for using ginsenosides as thefungicide. Methods: In order to evaluate the inhibitory effects of ginsenosides from ginseng stem and leaf on cucumber powderymildew fungus spore germination and its control efficiency in greenhouse， onion bulb inside skin membrane and pot cultivationmethods were employed in this study. esults: The results indicated that ginsenosides from ginseng stem and leaf EC50on pow-dery mildew fungus spore germination and preventive effects in greenhouse were 5. 74 mg·mL 1and 23. 51 mg·mL 1， respec-tively. Conclusion: Ginsenosides， with the potential for further development of a Chinese herbal fungicide， perform well onsuppression of spore germination and prophylaxis in greenhouse. Keywords ginsenosides from ginseng stem and leaf; Sphaerotheca fuliginea; spore germination; controleffect; fungicidedoi: 10 13313 /j issn 1673-4890 2017 7 019黄瓜白粉病是我国北方露地和保护地黄瓜种植中发生和危害较重的病害之一 ， 在黄瓜整个生长期均可危害 。病原菌属于子囊菌亚门的白粉病菌 Spha-erotheca fuliginea ( Schlecht) Poll. 。目前大面积种植的高产品种大多缺乏抗病性 ， 长期高剂量施用杀菌农药 ， 使病菌逐步产生了抗药性 1， 因此在生产实践中急需安全有效的防治黄瓜白粉病的新型杀菌剂 。三萜类物质是植物在长期进化过程中形成的适应生态环境的物质 ， 它们具有抵抗真菌 、病毒 、细菌侵扰的作用 2。人参皂苷作为典型的三萜类物质 ， 是人参的一种重要次生代谢产物 ， 其药理作用早已得到大众的认可 ， 并且越来越多的研究学者也关注到人参皂苷的生态学作用 。人参皂苷作为人参 、西洋参的一类主要化感物质在人参忌连作问题上被广泛研究 3， 并有报道指出人参茎叶总皂苷具有抑菌作用 4。本实验室比较了人参茎叶总皂苷对于不同植物病原菌的活性 ， 发现对黄瓜白粉病菌作用显著 。人参茎叶总皂苷作为天然活性物质 ， 如果能开发为植物源农药 ， 用于代替化学方法作为防治果蔬病害的绿色防治手段 ， 对于环境保护和生物安全将具有重要意义 。黄瓜白粉病菌为植物专性寄生菌 ， 只能寄生与之亲和的活体 ， 不能在人工培养基上生长 ， 因此以往研究中 ， 很少采用孢子萌发法评价药剂对该菌的活性 。本文采用洋葱球茎内表皮膜法评价人参茎叶·1001·2017 年 7 月 第 19 卷 第 7 期 中国现代中药 Mod Chin Med Jul. 2017 Vol. 19 No. 7总皂苷对黄瓜白粉病菌孢子萌发的影响 ， 并进行了人参茎叶总皂苷对白粉病菌的温室防治效果研究 ，以期研发一种新型植物源杀菌剂 。1 材料与方法1. 1 材料人参茎叶总皂苷购自吉林省宏久生物科技股份有限公司 ( 紫外检测总皂苷含量为 81. 7% ) 。白粉病菌孢子采自吉林农业大学园艺学院温室 。供试黄瓜品种为好运来 208， 购于山东省宁阳县蔬春种业有限公司 。1. 2 方法1. 2. 1 人参总皂苷溶液的制备 将人参茎叶总皂苷用 0. 05% 的吐温 80 水溶液分别配制成 0. 5， 5，10， 20， 50 mg·mL 1的质量浓度梯度 ， 现配现用 。1. 2. 2 白粉病菌孢子萌发试验 采用洋葱球茎内表皮膜法 5研究人参茎叶总皂苷对白粉病菌孢子萌发的影响 。取温室中黄瓜上感染的白粉病菌 ， 用去离子水将孢子洗脱 ， 过滤 ， 1000 rpm 离心 5 min， 去上清液 ， 重复 3 次 。重悬浮孢子至分生孢子含量 1 ×106个 ·mL 1。取 1. 2. 1 药剂和孢子悬浮液按 1 1 混匀并滴到洋葱表皮膜上 ， 架于盛有浅层无菌水的培养皿中 ，28 加盖保湿培养 ， 每个处理 3 次重复 ， 以 0. 05%的吐温 80 水溶液处理为空白对照 。待对照组 70%以上萌发时观察并计算孢子萌发率 ， 显微镜观察孢子萌发情况 ， 每个处理随机观察 3 个视野 ， 以每视野下能观察到的 80 100 个孢子为记录对象 ， 记录孢子总数和萌发数 ， 以孢子芽管长于孢子短半径为萌发 ， 按下式计算萌发率和相对抑制率 :萌发率 =孢子萌发数孢子总数×100%校正萌发率 =处理孢子萌发率对照孢子萌发率× 100%相对抑制率 =对照孢子萌发率 校正孢子萌发率对照孢子萌发率× 100%1. 2. 3 白粉病菌温室防治试验 采用盆栽法 6研究人参茎叶总皂苷对黄瓜白粉病菌的温室防治效果 。按照 1. 2. 2 方法配置孢子悬浮液 。取 63 株长势相同的健康供试黄瓜幼苗 ， 温室单株栽培 ， 待 5 7 片真叶期时 ， 分为 7 组 。用孢子悬浮液均匀喷雾接种 ，20 23 ， 相对湿度 95% ， 黑暗保湿条件下培养24 h。然后取 1. 2. 1 药剂均匀喷施于生长点以下第3， 4， 5 片叶正反面至润湿 ， 以 0. 05% 的吐温 80水溶液为对照 ， 采用生产上常用的乙嘧唑胺菌酯为阳性对照 ， 每个处理 3 株 ， 3 次重复 。在 20 23 ，正常日光温室 ， 相对湿度 85% 90% 条件下培养 7 d。按表 1 的分级标准 6调查记录叶片发病情况 ， 每处理调查 10 片叶 ， 按下式计算病情指数和防治效率 。病情指数 =( 各病级叶数 × 病级 )调查总叶数 ×9×100%防治效果 =对照病情指数 处理病情指数对照病情指数×100%表 1 黄瓜白粉病病情分级标准病级 发病程度0 级 无病斑1 级 病斑占叶面积的 5% 以下3 级 病斑占叶面积的 5% 15%5 级 病斑占叶面积的 15% 25%7 级 病斑占叶面积的 25% 50%9 级 病斑占叶面积的 50% 以上1. 2. 5 数据分析 采用 SPSS 22. 0 软件对试验数据进行统计分析 ， 多重比较采用 Duncans 法 。以人参皂苷浓度对数值和孢子萌发相对抑制率的几率值 ， 人参皂苷浓度对数值和温室防效几率值作毒力回归方程 ， 根据回归方程计算两次分析的 EC50值及 95% 的置信限 。3 结果与分析3. 1 白粉病菌孢子萌发的影响人参茎叶总皂苷对黄瓜白粉病菌孢子萌发的影响见表 2。结果显示 ， 在实验条件下培养 ， 随着药剂浓度的升高 ， 孢子萌发率呈显著降低趋势 ， 孢子萌发相对抑制率呈显著升高趋势 ， 人参茎叶总皂苷对白粉病菌孢子萌发有明显的抑制作用 。当人参茎叶总皂苷浓度为 0. 5 50 mg·mL 1时 ，通过对浓度对数与白粉病菌孢子萌发相对抑制率几率值作毒力回归分析 ， 可以进一步分析人参茎叶总皂苷对孢子萌发的抑制效果 。结果显示 ， 回归方程为 Y =0. 956 2X +4. 2742， 相关系数 r =0. 937， 可知人参茎叶总皂苷对白粉病菌孢子萌发的抑制作用与其浓度在一定范围内呈正相关 。得出人参皂苷有效抑菌 浓 度 EC50为 5. 74 mg·mL 1， 95% 置 信 限 为3. 58 9. 21 mg·mL 1。·2001·2017 年 7 月 第 19 卷 第 7 期 中国现代中药 Mod Chin Med Jul. 2017 Vol. 19 No. 7表 2 人参茎叶总皂苷对黄瓜白粉病菌孢子萌发的影响(珋x ± s， n = 3)药剂浓度( mg·mL 1)萌发率 ( % ) 校正萌发率 ( % ) 相对抑制率 ( % )50 8. 00 ± 1. 73f 11. 11 ± 2. 41f 88. 89 ± 2. 41e20 23. 00 ± 0. 58e 31. 94 ± 0. 80e 68. 06 ± 0. 80d10 35. 33 ± 4. 04d 49. 07 ± 3. 24d 50. 92 ± 3. 24c5 46. 00 ± 2. 89c 63. 89 ± 4. 01c 36. 11 ± 4. 01b0. 5 56. 33 ± 2. 33b 78. 24 ± 3. 24b 21. 76 ± 3. 24aCK 72. 33 ± 2. 90a 100a 注 : 表中同列数据后不同字母表示差异显著 ， P 0. 05。3. 2 白粉病菌温室防治人参茎叶总皂苷对黄瓜白粉病菌温室防治效果见表 3。结果显示 ， 随着药剂浓度的升高 ， 黄瓜叶片发病率和病情指数均有逐渐降低的趋势 ， 并且均显著低于对照组 。防治效果随药剂浓度的升高而显著增强 ， 当药剂浓度达到 10 mg·mL 1时 ， 与阳性对照的防治效果相同 ， 高于此浓度的药剂防治效果均显著强于阳性对照 。表 3 人参茎叶总皂苷对黄瓜白粉病菌的温室防治效果(珋x ± s， n =3)药剂浓度/mg·mL 1发病率 ( % ) 病情指数 ( % ) 防治效果 ( % )50 5. 00 ± 0e 33. 33 ± 0d 66. 67 ± 0d20 16. 67 ± 3. 33d 48. 15 ± 7. 41c 51. 85 ± 7. 41c10 40. 00 ± 5. 77c 77. 78 ± 0b 22. 22 ± 0b5 46. 67 ± 1. 67c 85. 19 ± 7. 41b 14. 81 ± 7. 41b0. 5 58. 33 ± 1. 67b 100 ± 0a 0aCK 73. 33 ± 1. 67a 100 ± 0a 阳性对照 40. 24 ± 4. 91c 77. 78 ± 0b 22. 22 ± 0b注 : 表中同列数据后不同字母表示差异显著 ， P 0. 05。通过对浓度对数与防效几率值作毒力回归分析 ，回归方程为 Y = 1. 798 5X + 2. 533 7， 相关系数 r =0. 993 3， 可知人参茎叶总皂苷对白粉病菌温室防治效果与其浓度在一定范围内呈正相关 。得出人参皂苷有效 温 室 防 治 浓 度 EC50值 为 23. 51 mg·mL 1，95% 置信限为 12. 98 42. 58 mg·mL 1。4 讨论人参茎叶总皂苷对黄瓜白粉病菌孢子萌发具有明显的抑制作用 ， 分生孢子的萌发是白粉病田间流行和再侵染的关键环节 ， 抑制分生孢子萌发可以有效控制病害流行 ， 减轻其危害程度 。与室内对白粉病菌孢子萌发的抑制作用相比 ， 受植物自身和温室环境的综合影响 ， 人参茎叶总皂苷抑菌效果明显降低 ， 但其仍具有明显的防治效果 ， 且其防治效果与药剂浓度在一定范围内成正相关 。植物次生代谢物质是植物在长期进化过程中与环境相互作用 ， 通过次级代谢途径产生的物质 ， 它们在植物进化中起到不可或缺的作用 ， 具有广泛的生态学意义 7。将人参次生代谢产物人参皂苷开发为植物源农药 ， 无脊柱动物毒性或植物毒性 ， 同时还有一定的保健作用 ， 并有环境降解迅速且资源丰富 ， 可再生等优点 。人参栽培过程中具有季节脱落现象 ， 人参茎叶往往被弃之地里 ， 但有研究显示人参叶中总皂苷含量比人参根部含量更高 8。因此本研究选择人参茎叶皂苷作为试验原料 ， 将废弃物有效利用 ， 极大降低成本 。前人在人参皂苷抑菌及其有效成分方面也有过研究 4， 本研究得出人参茎叶总皂苷可以抑制白粉病菌孢子萌发 ， 同时具有良好的温室防治效果 。因此 ， 可以此研究为基础 ， 进一步研究人参皂苷对果蔬类病原真菌生长的抑制作用 ，研发新型植物源农药潜力巨大 。参考文献 1 杨小军 ， 杨立军 ， 王少南 ， 等 药剂对黄瓜白粉病菌的生物活性测定 方 法 比 较 J 湖 北 农 业 科 学 ， 2004 ( 3) :71-74 2 谭世强 ， 马琳 ， 许永华 ， 等 植物三萜类物质的生态学功能研究进展 J 人参研究 ， 2015， 27( 3) : 36-38 3 雷锋杰 ， 张爱华 ， 张秋菊 ， 等 人参 、西洋参化感作用研究进展 J 中国中药杂志 ， 2010， 35( 17) : 2221-2226 4 赵雪淞 ， 王姣 ， 高娟 植物病原真菌对人参皂苷的敏感性 中国第七届植物化感作用学术研讨会会议指南及论文摘要集 C 昆明 : 出版者不详 ， 2014 5 Xu J ， Staiger C J， Hamer J E Inactivation of the mitogen-activated protein kinase Mpsl from the rice blast fungus pre-vents penetration of host cells but allows activation of plantdefense responses J PNAS USA， 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