高温胁迫下茄子qRT-PCR 内参基因筛选及稳定性分析

p园艺学报， 2017， 44 3 475– 486. Acta Horticulturae Sinica nbsp; doi 10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0831； http //www. ahs. ac. cn nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;475 收稿日期 2017– 01– 09； 修回日期 2017– 03– 07 基金项目 国家自然科学基金项目 （ 31501755） ； 广东省自然科学基金项目 （ 2015A030313568） ； 广东省科技计划项目 （ 2016B070701010） ；广州市科技计划项目（ 2014J4100094， 201510010075） nbsp;* 通信作者 nbsp;Author for correspondence（ E-mail ； ） nbsp;高温胁迫下茄子 qRT-PCR 内参基因筛选及稳定性分析 nbsp;庞强强1,2,3，李植良1，罗少波1，陈日远2，金庆敏1，黎振兴1，李德明3，孙保娟1,*，孙光闻2,*（1广东省农业科学院蔬菜研究所，广州 nbsp;510640；2华南农业大学园艺学院，广州 nbsp;510642；3海南省农业科学院蔬菜研究所，海口 nbsp;570100） nbsp;摘 nbsp;要 为筛选茄子 （ Solanum melongena L.）高温胁迫下稳定表达的内参基因，以不同茄子品系（种）为研究对象， 利用实时荧光定量 PCR 技术对来自茄子高温胁迫转录组数据库 8 个候选内参基因 （ SmEF1a、SmEF2、 Sm40sRPS29、 Sm60sRPL24、 SmTRX、 SmCK I、 SmDAHPS I、 SmUCP）和 SmActin 在不同试验情况下进行表达检测，并结合 GeNorm、 NormFinder、 BestKeeper 和 ReFinder 软件综合评价 9 个内参基因的表达稳定性。结果表明，在茄子热敏品系 05-1 和耐热品系 05-4 经高温处理不同时间的样品和不同组织样品以及 10 个耐热性不同的茄子品系（种）中， 9 个内参基因的表达丰度及稳定性存在差异；茄子热敏品系 05-1 和耐热品系 05-4 高温胁迫处理不同时间样品中表达稳定性最好的是 SmEF1a 和 SmUCP；其不同组织中表达水平最稳定的是 SmEF1a 和 SmTRX；高温胁迫下不同茄子品系（种）中以 SmTRX 和 SmEF2的表达稳定性最好。综合来看， SmEF1a 和 SmTRX 在所有茄子试验样品中的表达稳定性最好，而 SmActin和 SmCK I 的表达稳定性较差。 nbsp;关键词 茄子；高温胁迫；内参基因；表达稳定性；实时荧光定量 PCR 中图分类号 S 641.1 nbsp; nbsp; nbsp; 文献标志码 A nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;文章编号 0513-353X（ 2017） 03-0475-12 Selection and Stability Analysis of Reference Gene for qRT-PCR in Eggplant Under High Temperature Stress PANG Qiangqiang1,2,3， LI Zhiliang1， LUO Shaobo1， CHEN Riyuan2， JIN Qingmin1， LI Zhenxing1，LI Deming3， SUN Baojuan1,*， and SUN Guangwen2,*（1Vegetable Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510640， China；2Horticultural College， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China；3Vegetable Research Institute， Hainan Academy of Agricultural Sciences， Haikou 570100， China） nbsp;Abstract The present study aimed at selecting the stable reference genes to ensure the reliability and accuracy in gene expression analysis of eggplant（ Solanum melongena L.） nbsp;under high temperature stress. By real-time fluorescence quantitative RT-PCR technology， we investigated the expression stability of eight candidate reference genes（ SmEF1a， SmEF2， Sm40sRPS29， Sm60sRPL24， SmTRX， SmCKⅠ ， nbsp;Pang Qiangqiang， Li Zhiliang， Luo Shaobo， Chen Riyuan， Jin Qingmin， Li Zhenxing， Li Deming， Sun Baojuan， Sun Guangwen. Selection and stability analysis of reference gene for qRT-PCR in eggplant under high temperature stress. 476 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2017， 44 3 475– 486. SmDAHPSⅠ ， SmUCP） from RNA-Seq database under high temperature stress and SmActin， and the stability of expression of nine reference genes were uated by GeNorm， NormFinder， BestKeeper and ReFinder， respectively. The results showed that， at different periods， different tissues and different lines of eggplant under high temperature， the expression abundance and stability of these nine reference genes are different. When analyzing the gene expression of thermo-sensitive line 05-1 and thermo-resistant line 05-4 under high temperature stress， SmEF1a and SmUCP were the best reference genes for different periods ，and SmEF1a and SmTRX could be used as best reference genes for different tissues. Meanwhile， SmTRX and SmEF2 could be used as best reference genes in lines or varieties with different thermo-tolerance. On the whole， SmEF1a and SmTRX exhibited the most stable expression among all of the tested samples，while SmActin and SmCKⅠ exhibited the least stable expression under most of the experimental conditions. It was found to be feasible and efficient to identify stably expressed genes from transcriptome database under high temperature stress as candidate reference genes， which will be helpful for the study of expression of genes response to high temperature and the mechanisms of thermo-tolerance in eggplant. Keywords Solanum melongena； high temperature stress； reference gene； expression stability；real-time fluorescence quantitative PCR 茄子 （ Solanum melongena L.） 喜温但不耐热， 高温是限制其生长发育的重要因素之一 （赵雪 nbsp;等，2014） ，耐热资源筛选和基因挖掘是茄子育种的重要任务之一。在基于 RNA-Seq 比较基因表达差异以筛选耐热相关基因的研究过程中，较多地涉及到应用实时荧光定量 PCR（ Real-time fluorescence quantitative PCR， qRT-PCR）技术验证和分析基因表达模式和水平。 qRT-PCR 的相对定量分析中需要利用表达稳定的内参基因进行校正和标准化（ Artico et al.， 2010；万红建 nbsp;等， 2012； Fu et al.，2013） 。一个理想的内参基因应该是组成型表达的基因，其表达不受生长发育阶段和试验条件的影响（胡瑞波 nbsp;等， 2009） 。然而，大量的研究表明，任何一种看家基因所谓的恒定表达都只是在一定类型组织或试验下有范围的恒定，没有表达绝对稳定的基因（ Huggett et al.， 2005； Zhang et al.， 2007） 。筛选茄子高温胁迫条件下可用于基因表达分析的稳定内参基因对 qRT-PCR 结果可靠性具有关键作用。 nbsp;目前，在茄科作物上常用的有肌动蛋白（ Actin） 、转录延伸因子 1（ EF1） 、 18S 核糖体 RNA（ 18S rRNA） 、 3–磷酸甘油醛脱氢酶 （ GAPDH） 、 亲环蛋白基因 （ CYP） 、 1,5–二磷酸核酮糖羧化酶 （ RuBP） 、腺嘌呤磷酸核糖转移酶（ APRT）和 α 微管蛋白基因（ TUA）等内参基因（ Exposito-Rodriguez et al.，2008； Wan et al.， 2011； Wang et al.， 2012； Gantasala et al.， 2013； Lopez-Pardo et al.， 2013） 。在茄子上， Gantasala 等（ 2013）通过对茄子 6 个常用内参基因（ 18sRNA、 APRT、 GAPDH、 CYP、 ACTIN、RuBP）的检测发现， 18sRNA、 CYP 和 APRT 在茄子不同组织中的表达稳定性最好。周晓慧等（ 2014）在茄子近缘野生种喀西茄（ Solanum aculeatissimum）的研究中发现， TUA 和 18sRNA 在不同组织中表达稳定性最好， 18sRNA 和 ACTIN 在不同植物生长调节剂处理条件下表达水平最稳定， EF1 和GAPDH 在干旱和盐条件下表达稳定性最好， TUA 和 EF1 在所有测试样品中表达稳定性最高。前期作者在采用 qRT-PCR 验证茄子热敏品系和耐热品系高温胁迫前后基因表达水平时发现， Actin 作为内参基因易受高温胁迫的影响，导致试验结果误差较大。因此，本研究基于热敏和耐热茄子样本的RNA-Seq 数据，从中挖掘稳定表达的基因作为候选内参，并利用 GeNorm、 NormFinder、 BestKeeper和 ReFinder 等 4 种软件分析候选内参基因在不同材料中的表达稳定性，以期筛选出高温胁迫下茄子中稳定表达的内参基因，为后续的耐热性相关基因表达研究奠定基础。 nbsp;庞强强，李植良，罗少波，陈日远，金庆敏，黎振兴，李德明，孙保娟，孙光闻 . 高温胁迫下茄子 qRT-PCR 内参基因筛选及稳定性分析 . 园艺学报， 2017， 44 3 475– 486. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;477 1 nbsp;材料与方法 nbsp;1.1 nbsp;材料与处理 nbsp;试验在广东省农业科学院蔬菜新技术研究重点实验室进行。试验材料为广东省农业科学科院蔬菜研究所经过多年多代自交纯化或创制的稳定遗传的材料（孙保娟 nbsp;等， 2012） 。采用穴盘育苗，当幼苗具有 4 片真叶时移至 27 ℃， 16 h/8 h（昼 /夜）光照培养箱预培养 3 d，之后开始处理。 nbsp;试验共分 3 组，第 1 组为热敏品系 05-1 和耐热品系 05-4 用 42 ℃处理 0、 0.5、 1、 2、 4、 6、 12和 24 h，分别取其第 2 片真叶；第 2 组为热敏品系 05-1 和耐热品系 05-4 用 42 ℃分别处理 0 和 6 h，分别取其根、茎、叶；第 3 组为热敏感品系 05-1、 T10、 T18、 T20 和 T22 与耐热品系 05-4、 T5、T24、 T38 和农夫长茄，用 42 ℃处理 0、 6 和 12 h，取第 2 片真叶。每个处理设 3 次生物学重复。以未进行任何高温处理的材料作为对照。样品用液氮速冻，以备 RNA 提取。 nbsp;1.2 nbsp;RNA-Seq 数据库建立 nbsp;根据前期试验结果，将热敏品系 05-1 和耐热品系 05-4 未经高温胁迫处理的对照样品和 42 ℃高温胁迫处理 6 h 的样品委托广州基迪奥生物科技有限公司进行测序分析。 每个样品测序量约为 2 Gb。通过 oligo（ dT）磁珠法提取 mRNA 序列，建立测序文库。构建好的文库使用 Illumina Hiseq 2000TM进行测序。测序的结果（ reads）使用 Trinity 软件组装得到 Unigenes，并将组装结果在数据库中进行了注释。以转录组序列作为参考，对各样本进行表达谱分析。将各样品的测序结果比对到参考序列上，得到了不同样品中各 Unigene 的表达量信息。 nbsp;1.3 nbsp;总 RNA 提取和 cDNA 合成 nbsp;采用 TransZol Plant 试剂盒 （北京全式金生物技术有限公司） 提取样品总 RNA， 以各样品的 1 g总 RNA 为模板，利用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（ Perfect Real Time）试剂盒（宝生物工程有限公司， TaKaRa）去除基因组 DNA 并反转录合成 cDNA 第一链，于– 20 ℃储藏备用。 nbsp;1.4 nbsp;内参基因目的片段的 PCR 扩增检测 nbsp;扩增体系 20 μL ddH2O 12.8 μL， 10 PCR buffer（含 Mg2） 2 μL， dNTP Mixture（各 2.5 mmol L-1）2 μL，正向引物与反向引物（ 10 μmol L-1）各 1 μL， nbsp;cDNA 模板 1 μL， TaKaRa Taq（ 5 U） 0.2 μL。PCR 反应程序为 94 ℃预变性 3 min； 94 ℃变性 30 s， 57 ℃退火 10 s， 72 ℃延伸 1 min，循环 35次； 72 ℃再延伸 7 min。反应结束后，分别取 20 L 产物在 1.2琼脂糖上电泳， Goldview 染色后用凝胶成像系统观察拍照。 nbsp;1.5 nbsp;内参基因荧光定量 PCR 扩增 nbsp;反应程序按照宝生物公司的 SYBRPremix Ex TaqTM（ Tli RNaseH Plus） 试剂盒说明书要求进行，反应在 CFX96TMReal-Time PCR Detection System（ Bio-Rad）扩增仪上完成，反应条件为 95 ℃预变性 30 s； 95 ℃变性 5 s， 60 ℃退火 15 s， 72 ℃延伸 15 s， 39 个循环。熔解曲线程序 65 ℃加热至90 ℃， 5 s。通过熔解曲线分析确定扩增产物的特异性。 nbsp;1.6 nbsp;引物设计 nbsp;从茄子 RNA-Seq 表达谱数据库中挑选 8 个表达相对稳定的基因， 包括转录延伸因子 1（ elongation factor 1a， EF1a） 、转录延伸因子 2（ elongation factor 2， EF2） 、蛋白激酶 Ⅰ （ casein kinaseⅠ ， CKⅠ ） 、Pang Qiangqiang， Li Zhiliang， Luo Shaobo， Chen Riyuan， Jin Qingmin， Li Zhenxing， Li Deming， Sun Baojuan， Sun Guangwen. Selection and stability analysis of reference gene for qRT-PCR in eggplant under high temperature stress. 478 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2017， 44 3 475– 486. 硫氧还蛋白（ thioredoxin， TRX） 、 40s 核糖体蛋白（ 40s ribosomal protein S29， 40sRPS29） 、 60s 核糖体蛋白（ 60s ribosomal protein L24， 60sRPL24） 、磷酸二羟丙酮合酶 Ⅰ （ phospho-2-dehydro-3- deoxyheptonate aldolaseⅠ ， DAHPSⅠ ）和一个未知功能的（ uncharacterized protein， UCP）基因作为候选内参基因，以肌动蛋白（ Actin）作为对照内参。根据候选内参基因的核苷酸序列和 qRT-PCR设计原则，运用 Primer5.0 软件设计 9 对特异性引物（表 1） ，由上海生工生物公司合成。 nbsp;表 1 nbsp;选取的内参基因引物及扩增长度 nbsp;Table 1 nbsp;List of primers and amplified lengths of reference genes under investigation nbsp;引物 nbsp; Primer Unigene/bp 引物序列（ 5′– 3′-） nbsp;Primers sequence 长度 /bp nbsp;Length SmActin JX524155（ 333） nbsp;F TTACTCATTCACCACCACAGC； R ACCATCGGGAAGCTCATAGC 145 SmEF1a Unigene 0033899（ 876） nbsp;F CCACACTTCTCATATTGCTGTCA； R ACCAGCATCACCATTCTTCAAAA 145 SmEF2 Unigene 0032941（ 3 457） nbsp;F TCATGGGTGGTGCTGAGATTATA； R CTAGCTTCCATGTACAAACGGTT 130 SmCKⅠ nbsp;Unigene 0033027（ 1 758） nbsp;F CAGGAAGTAGATGGGCAATTGTT； R CCTCCTATGGATCCCTTCACTAG 101 SmTRX Unigene 0035968（ 857） nbsp;F TATCTTTCAAGTTTTCTCGGCGG； R GCTTGGAGGAGTTGAAATGAAGT 133 Sm40sRPS29 Unigene 0052057（ 840） nbsp;F CTCTTCTGCCTTGTGAAAGATGG； R CTGCAGCACATGAGTCCATAC 138 Sm60sRPL24 Unigene 0027788（ 781） nbsp;F GAACTTTGTCGTTTTAGTGGTGC； R TGTTGTGGAAGTAGTGTTTGCAT 118 SmDAHPSⅠ nbsp;Unigene 0008432（ 2 031） nbsp;F CAGGGCAAAATGTAACTGAATGC； R TCGGCTACAATGAAGGAAAGTTC 136 SmUCP Unigene 0048390（ 748） nbsp;F CAACATCAGAAAATTCCAGCAGC； R TGTTCTTTTGGGTTGGTCAGAAG 108 1.7 nbsp;数据分析 nbsp;实时荧光定量 PCR 后，仪器自动得出各样品 Ct 值，用 GeNorm、 NormFinder 和 BestKeeper 软件进行各内参基因稳定性分析，结合分析结果运用 ReFinder 计算出候选内参基因稳定性综合排名。 nbsp;2 nbsp;结果与分析 nbsp;2.1 nbsp;候选内参基因在 RNA-Seq 结果中的相对表达量 nbsp;从 4 个样本的转录组测序结果来看， 8 个（ SmActin 未检测到）候选内参基因在高温胁迫前后的表达量相当且具有一定表达丰度，可用于进一步分析（表 2） 。 nbsp;表 2 nbsp;候选内参基因对应的 Unigene 及其在 RNA-Seq 表达谱中相对表达量（ RPKM 值） nbsp;Table 2 nbsp;Corresponding Unigenes of candidate reference genes and their RPKM values in samples by RNA-Seq 05-1（热敏 nbsp;thermo-sensitive） nbsp;05-4（耐热 nbsp;thermo-resistant） nbsp;候选内参基因 nbsp;Candidate reference gene Unigene 序列号 nbsp;Unigene accession 对照 nbsp;Control 42 ℃ nbsp;6 h 对照 nbsp;Control 42 ℃ nbsp;6 h SmEF1a Unigene 0033899 243.84 246.75 254.33 243.27 SmEF2 Unigene 0032941 262.76 291.02 268.28 274.45 SmCKⅠ nbsp;Unigene 0033027 32.12 32.18 34.34 32.66 SmTRX Unigene 0035968 65.64 64.73 64.93 62.42 Sm40sRPS29 Unigene 0052057 333.27 333.92 335.37 336.15 Sm60sRPL24 Unigene 0027788 74.52 72.66 78.45 76.78 SmDAHPSⅠ nbsp;Unigene 0008432 314.64 312.43 311.21 301.99 SmUCP Unigene 0048390 233.83 240.15 226.74 224.44 SmActin None – nbsp;– nbsp;– nbsp;– nbsp;2.2 nbsp;茄子内参基因的 PCR 检测 nbsp;由图 1 可以看出， 9 个候选内参基因的 PCR 结果均可见与预期大小相同的产物，且条带单一，说明不存在引物二聚体和非特异性扩增，可用于后续 qRT-PCR 分析。 nbsp;庞强强，李植良，罗少波，陈日远，金庆敏，黎振兴，李德明，孙保娟，孙光闻 . 高温胁迫下茄子 qRT-PCR 内参基因筛选及稳定性分析 . 园艺学报， 2017， 44 3 475– 486. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;479 图 1 nbsp;茄子 9 个候选内参基因的 RT-PCR 扩增结果 nbsp;Fig. 1 nbsp;Specificity of 9 candidate reference genes for RT-PCR amplification 2.3 nbsp;茄子内参基因的荧光定量 PCR 分析 nbsp;以茄子 cDNA 为模板，进行荧光定量 PCR 分析，结果表明， 9 个候选内参基因在不同试验条件下的熔解曲线都只有单一主峰，没有其他杂峰出现，重复样品之间扩增曲线重复性高（图 2） 。 nbsp;图 2 nbsp;9 个候选内参基因 qRT-PCR 熔解曲线 nbsp;Fig. 2 nbsp;Melting curves of 9 candidate reference genes for qRT-PCR amplification 内参基因 Ct 值在不同样品中表达稳定性是选择内参的重要标准。通过分析发现，每个内参基因在不同处理样品中的表达丰度均存在差异。基因的 Ct 值越小，其表达丰度越高，反之越低。在试验所涉及到的所有茄子样品中，候选内参基因的平均 Ct 值在 19.15 28.35。 nbsp;在热敏品系 05-1 和耐热品系 05-4 中， 候选内参基因在热处理不同时间段的 Ct 值在 19.33 28.04之间 （图 3） ， 其中 SmCKⅠ 的 Ct 值最大， 表达丰度最低， 这与 RNA-seq 表达谱中相对表达量 （ RPKM值）结果（表 2）相符。 nbsp;Pang Qiangqiang， Li Zhiliang， Luo Shaobo， Chen Riyuan， Jin Qingmin， Li Zhenxing， Li Deming， Sun Baojuan， Sun Guangwen. Selection and stability analysis of reference gene for qRT-PCR in eggplant under high temperature stress. 480 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2017， 44 3 475– 486. 图 3 nbsp;候选内参基因在茄子热敏品系 05-1 和耐热品系 05-4 高温处理不同时间中的 Ct 平均值 nbsp;Fig. 3 nbsp;The average Ct values of thermo-sensitive line 05-1 and thermo-resistant line 05-4 at nbsp;different period of high temperature treatment 如图 4 所示， 内参基因在高温处理 0 和 6 h 在热敏品系 05-1 和耐热品系 05-4 不同组织 （根、 茎、叶）中的 Ct 介于 19.15 28.35 之间，其中以 Sm40sRPS29 的 Ct 值最小，表达丰度最大。 nbsp;图 4 nbsp;候选内参基因在茄子热敏品系 05-1 和耐热品系 05-4 高温处理 0 和 6 h 不同组织中的 Ct 平均值 nbsp;Fig. 4 nbsp;The average Ct values of different tissues of thermo-sensitive line 05-1 and thermo-resistant line 05-4 nbsp;treated with high temperature for 0 and 6 h 如图 5 所示， 10 个茄子品系 （种） 中候选内参基因在高温处理不同时间的 Ct 值介于 19.56 27.26之间，其中 SmCKⅠ 最大，表达丰度最小。此外还发现，这些内参基因在这 3 组处理样品中的表达变化并没有一定的规律性。 nbsp;图 5 nbsp;候选内参基因在 10 个茄子品系（种）高温处理 0、 6 和 12 h 的 Ct 平均值 nbsp;Fig. 5 nbsp;The average Ct values of ten eggplant lines（ varieties） treated with high temperature for 0， 6 and 12 h 庞强强，李植良，罗少波，陈日远，金庆敏，黎振兴，李德明，孙保娟，孙光闻 . 高温胁迫下茄子 qRT-PCR 内参基因筛选及稳定性分析 . 园艺学报， 2017， 44 3 475– 486. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;481 2.4 nbsp;内参基因的表达稳定性评价 nbsp;2.4.1 nbsp;GenNorm 软件分析 nbsp;GenNorm 是常用的内参分析软件， 根据计算出的候选内参基因在不同样品中的表达稳定性 （ M）来确定最稳定的内参基因， M 值越大，表明稳定性越低； M 值越小，稳定性越高，其中 M 1.5 是上限（ Vandesompele et al.， 2002） 。 nbsp;如表 3 所示， 9 个内参在不同的茄子样品中稳定性存在差异。热敏品系 05-1 和耐热品系 05-4在 42 ℃高温处理不同时间段，表达最为稳定的内参基因是 SmEF1a 和 SmUCP；在其高温处理 0 和6 h 的根、茎和叶中，表达最稳定的是 SmCKⅠ 和 SmEF1a；在 10 个不同品系（种）高温处理 0、 6和 12 h 中表达稳定性最好的是 SmEF2 和 SmTRX。在所有试验条件下，内参基因 SmActin 的表达稳定性较差。 nbsp;表 3 nbsp;GeNorm 软件分析 9 个候选内参基因在茄子不同试验条件下的表达稳定性 nbsp;Fig. 3 nbsp;GeNorm ranking of the 9 candidate reference genes with respect to their expression stability nbsp;under different experimental conditions 不同时间 Different periods nbsp;不同组织 Different tissues nbsp;不同品系（种） Different lines（ varieties）内参基因 nbsp;Reference gene M 排序 nbsp;Rank nbsp;M 排序 nbsp;Rank nbsp;M 排序 nbsp;Rank SmActin 1.345 9 1.339 4 0.959 9 SmEF1a 0.664 1 1.140 2 0.719 6 SmEF2 0.760 6 1.774 7 0.650 1 SmCKⅠ nbsp;0.789 8 1.127 1 0.871 8 SmTRX 0.768 7 1.961 8 0.651 2 Sm40sRPS29 0.733 4 1.370 6 0.698 4 Sm60sRPL24 0.725 3 1.266 3 0.716 5 SmDAHPSⅠ nbsp;0.733 4 1.360 5 0.742 7 SmUCP 0.697 2 2.814 8 0.655 3 2.4.2 nbsp;NormFinder 软件分析 nbsp;NormFinder 软件是结合组内方差与组间方差计算候选内参基因的稳定值来对其进行评价，稳定值越小，内参基因表达就越稳定；反之则越不稳定（ Andersen et al.， 2004） 。 nbsp;如表 4 所示，在热胁迫处理不同时间段，表达最为稳定的内参基因是 SmEF1a，其 次 是 SmUCP；不同组织中， SmEF1a 的稳定性最好，其次是 Sm60sRPL24；不同品系（种）中表达稳定性最好的是SmTRX 和 SmUCP。 nbsp;表 4 nbsp;NormFinder 软件分析 9 个候选内参基因在茄子不同试验条件下的表达稳定性 nbsp;Fig. 4 nbsp;NormFinder ranking of the 9 candidate reference genes with respect to their expression stability nbsp;under different experimental conditions 不同时间 Different periods 不同组织 Different tissues 不同品系 （种） Different lines（ varieties）内参基因 nbsp;Reference gene M 排序 nbsp;Rank M 排序 nbsp;Rank M 排序 nbsp;Rank SmActin 0.880 9 1.872 9 0.036 9 SmEF1a 0.197 1 0.123 1 0.025 7 SmEF2 0.379 8 0.965 7 0.016 2 SmCKⅠ nbsp;0.363 7 0.542 6 0.029 8 SmTRX 0.360 5 1.195 8 0.015 1 Sm40sRPS29 0.360 5 0.489 4 0.021 4 Sm60sRPL24 0.331 4 0.123 2 0.022 5 SmDAHPSⅠ nbsp;0.308 3 0.275 3 0.024 6 SmUCP 0.263 2 0.541 5 0.016 2 Pang Qiangqiang， Li Zhiliang， Luo Shaobo， Chen Riyuan， Jin Qingmin， Li Zhenxing， Li Deming， Sun Baojuan， Sun Guangwen. Selection and stability analysis of reference gene for qRT-PCR in eggplant under high temperature stress. 482 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2017， 44 3 475– 486. 2.4.3 nbsp;BestKeeper 软件分析 nbsp;BestKeeper 可通过计算标准偏差（ SD）和变异系数（ CV）来筛选最稳定的内参基因，其中标准差和变异系数越小，稳定性越好；反之，稳定性越差（ Pfaffl et al.， 2004） 。 nbsp;如表 5 所示，不同时间条件下候选内参基因 SmActin、不同组织条件下的 SmActin、 SmEF2 和SmTRX 的标准差都大于 1，根据 BestKeeper 的选择标准，这些基因的表达都不稳定。在不同时间段表达最为稳定的候选内参基因是 SmTRX， 其次是 SmEF2； 在不同组织中 SmEF1a 的表达稳定性最好，其次是 Sm60sRPL24；不同品系（种）中表达稳定性最好的是 SmTRX 和 SmEF2。 nbsp;表 5 nbsp;BestKeeper 软件分析 9 个候选内参基因在茄子不同试验条件下的表达稳定性 nbsp;Fig. 5 BestKeeper ranking of the 9 candidate reference genes with respect to their expression stability nbsp;under different experimental conditions 不同时间段 nbsp;Different nbsp;/p