生长素酰胺水解酶基因在西瓜果实发育过程中的表达_高嫱.pdf

黑龙江农业科学 （）： ：生长素酰胺水解酶基因在西瓜果实发育过 程 中的表达高嫱，田守 蔚，张洁，王艳 萍，孙宏 贺，张海 英，许勇（北京 农学院 植物科学技术学院 ，北京；北京 市农林科学院 蔬菜研究中心 农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室 蔬菜种质改良北京重点实验室 ，北京）摘 要 ：生长素在植物果实发育与成熟过程中发挥重要作用 ，但生长素调控西瓜果实发育与成熟的分子机制尚不 十分清楚 。以含糖量低的野生西瓜 与含糖量高的栽培西瓜 为试 验材料 ，测定并比较了栽培与野生西瓜果实发育不同时期果实整组织游离态 的含 量 。结果表明 ：果实游离态 的含 量随西瓜果实发育而上升 ，在授粉后 达到 峰值 ，后期逐步下降 。含糖量高的栽培西瓜果实游离态 的含 量在果实发育的各个阶段 ，均显著高于含糖量低的野生西瓜 ，说明果实游离态 的积 累可能与果实成熟及含糖量积累相关 。已有研究表明生长素酰胺水解酶 （ ， ，）通过催化结合态生长素释放游离态 生长素 ，是游离态生长素积累的限速酶 。在西瓜全基因组上对基 因家族进行了系统进化树分析，通 过检测了西瓜各个组织的表达情况 ，发现西瓜果肉中只有 个 基因 表达 ，并且栽培西瓜果肉中这 个基因的表达量均显著高于野生西瓜 ，其中 ，在栽培西瓜果肉中的表达量最高 ，且 与果实游离态 的含 量变化趋势正相关 ，推测该基因对栽培西瓜游离态的积累起关键作用，进而调控了西瓜果实的发育与成熟的进化 。关 键 词 ：生长素 ；西瓜 ；游离 ；生长素酰胺水解酶收 稿 日期 ：基金 项目 ：北京学者资助项目 （）；国家 西甜瓜产业技术体系资助项目 （）；北京西甜瓜创新团 队资助项目 （）。第一 作者简介 ：高嫱 （），女 ，在读 硕士 ，从事蔬菜育种与生物技术研究 。：。通讯 作者 ：许勇 （），男 ，博士 ，研 究员 ，从事蔬菜育种研究 。：。肉质果实的 发育与成熟是复杂而高度协调的过程 ，依赖于多个植物生长激素的协调作用，其中生长素在果 实发育的过程中起到了不可替代的作用 。生长素不仅对果实坐果起重要作用，还能通 过调控细胞分裂和细胞扩增 ，决定果实最终大小。在一 些水果作物中 ，生长素含量的下降被认为是果实启动成熟的先决条件。外施 生长素可以干扰许多作物的果实成熟过程。植物 生长素的主要天然活性形式是吲哚乙酸 （ ，），通过植物自身的色氨酸 依赖途径及色氨酸非依赖途径合成。合成有 活性的游离态可以 通过酯键与糖结合 ，或通过酰胺键与氨基酸或肽结合 ，成为非活性的结合态，植物 体的生 长素以结合态形式存在。以结 合态形式存储 、运输 ，其后在生长素 酰 胺 水 解 酶 （ ， ，）作 用 下 水解产生游离态，在不 同发育过程中提供具有生物活性的生长素。拟南 芥的蛋白 家族有个成员 ，其中的主 要底物是，参与 调控了拟南芥对干旱胁迫的响应。、及基因 ，通 过调控游离态的含 量进而参与调节了光照条件下下胚轴的延伸及侧根的发生 、根毛的延伸。芜菁受到根肿菌侵 染 ，肉质 根 中 的含 量 增 加 可 能 与和的 表 达 量 变 化 相 关；和调控 了 蒺 藜 苜 蓿 根 部 受 真 菌 侵 染 时含量 的增加。桃家族 的基因在 桃果实成熟过程表达量上调了倍 ，可能通过催化生长素氨基酸结合态水解的形式参与了溶质型桃果实成熟阶段的生长素的跃变过程 ，进而调控桃果实发育过程。因此 ，蛋白 通过调控游离态的释放调控了植 物的众多发育过程 。果实发育与成熟过程与游离态的含 量息息相关 。西瓜作为非呼吸跃变型果实发育研究的理想模式作物 ，生长素对其果实发育与成熟过黑龙江农业科学 期程的 研究尚在起步阶段 ，生长素在西瓜果实发育过程的含量变化尚未有研究报道 ，关于生长素酰胺水解酶对此过程的调控作用尚不清楚 。本研究首次报道了含糖量低的野生型西瓜与含糖量高的栽培型西瓜果实发育过程中的生长素含量变化差异 ；利用生物信息学分析方法 ，鉴定并分析西瓜全基因 组家 族 成 员 的 基 本 特 征 ：通 过检测 了西瓜基因 在野生型及栽培型西瓜果实发育过程的表达差异 ，为基因 家族成员的功能解析奠定了基础 。 材 料 与方法 材料以 野 生 型 种 质 “”（）与早熟栽培西瓜 自交系（ ）为供 试材料 。野生材料由课题组从美国引进并保存 ，授粉后约种子成 熟 ，但果实可溶性糖含量极低 ，无甜味 ，瓤色白且硬 ；早熟栽培种西瓜由本课题组选育并保存 ，授粉后约成熟 ，成熟果实含糖量 高 ，中心瓤甜 ，可溶性固形物左右 ，瓤 色红 ，肉质脆酥 。早熟栽培西瓜果实发育过程有个关键期 ：未成熟 白 瓤 期 （授 粉 后，）；白 粉 瓤期 （）；红 瓤 期 （ ）；过 熟期 （）。以此 作为取样时间点 。 方法 果实整组织游离态含量 的测定游离态的含 量测定在中国农业大学生物科学院质谱 （）实验室进行 。分别采集 “”、授粉 后、及的西瓜 果实各部位样品 。采集的样品在液氮中冷冻后 ，储存在冰箱 。测 定时将样品粉碎成细粉 ，取样 品 置 于离 心 管 ，加 入提取 液 （异丙醇水盐酸，）和内标 （·）溶液 ，涡 旋振荡，在、·条件 下振荡，加入萃取 液 （氯仿溶液 ），涡旋振荡，在、·条件 下振荡，相同 温度下 ·离心，两相 形成 ，转移下层液体，室温下氮气吹干 ，用甲醇 溶液复溶 ， ·离心后 ，取上 清液装入进样小瓶 ，上机待测 。所用液相色谱仪为 （ ， ，），使用 色谱柱 （×，!；， ，）进行 色谱分离 ，采用以下溶剂梯度分离（相 ：水含乙酸 ；相 ：乙 腈含乙酸 ）：，； ，； ，；，；，；，；流速 为·，上样 量为。使用高分辨质谱仪 （ ，）进行 质谱分析 ，参数设置如下 ： ：，（）：，：， ：，：， ：， ：， ：，保留 时间和的质 谱信息取决于标准品 。每个样本重复次 。 可溶 性固形物含量的测定用手持式糖度 计 （，）测定 西瓜果实中心果肉组织的可溶性固形物含量 。 西瓜家族 基因序列检索利用拟南芥基因组数据库获得基因 的编码序列 ，通过检索 葫 芦 科 基 因 组 数 据 库 （：）对西 瓜蛋白组序列进行比对 ，选取阈值小于序列 ，根 据基因注释去除非基因后 ，以 此序列集合在西瓜蛋白组序列内再次做比对 检索 （），在匹 配序列中筛除非序列 后列为西 瓜候 选 基 因序列 。 西瓜蛋白 家族进化与结构分析从拟南芥基因组数据库中获得拟南芥蛋白 家族 序 列 （，；，；，；，；，；，；，），并从 检索获得的转录本序列翻译出西瓜蛋白 家族序列 ，用 进行 序列比对 （），使用 软件 构建系统发育树 ，做次，其它 参数为系统默认值 。 西瓜基因在 不同组织部位的表达分析提取 试剂盒购自华越洋生物公司 ；反转录试剂盒为 ，由提供 ；荧 光定量试剂 盒购自公司 ；引物由北京天一辉远 生物科技有限公司合成 。用提取 试剂盒分别提取 ，分别取根 、顶端 生长点 、叶片组织 ，和授粉后、的果 肉组织总。使用 （）对各期 高 嫱等：生长素酰胺水解酶基因在西瓜果实发育过程中的表达样品进行 纯化 。以纯化后的样品 为模板 ，利用试剂盒 （）进行 反转录 ，获得。反转 录得到的稀释倍 ，用作 反应模板 。以西瓜基因 作为内参 ，利用型荧 光定量仪 （）对基 因 （引物见表）进行定量分析 。采 用比较法计 算各基因的相对表达量 。表 荧光定量扩增的引物序列 基 因 登录号 上 游 引物 下 游 引物 （） 数据 分析采用 软件 进行数据分析 。 结 果 与分析 野生西瓜与栽培 西瓜果实整组织游离态的含 量变化检测 “”、两个品种西瓜果实不 同发育时期整组织游离态的含 量变化 ，结果显示 ，二者游离态的含 量均呈现先升后降趋势 ，达到 最高值 ，而后下降 。在果实发育后期 ，野生西瓜游离态的含量几乎降为零 ，而栽 培品种仍维持较高含量的游离态。栽培 西瓜在授粉后的果实发育的各个阶段游离态的含量显著高于野生西瓜 （图）。栽培 品种可溶 性固形物含量在白粉瓤期（）以后 迅速积累 ，一直增加 ，只在过熟期略有降低 ，而野生品种可溶性固形物含量一 直很低 （图），不难推测出 ，栽培西瓜后期较高含量的游离态可能 对其可溶性固形物的积累起重要的作用 。潘磊等在桃果实发育中也发 现同样现象 。 西瓜 生长素酰胺水解酶基因家族的全基因组鉴定与进化树分析前人的研究结果表明 ，以结 合态形式存储 、运输 ，生长素酰胺水解酶 （ ， ，）可以 将其水解产生游离态，是游 离态积累 的限速酶 ，因此西瓜果实游离态积累可 能与基因 有关 ，有必要进一步在西瓜全基因组上鉴定分析基因 家族成员 。目前在以拟南芥上已鉴定出个基因 （，；，；，；，；，；，；，），通过 其编码区在西瓜基因组数据库中进 行 比 对 ，在西瓜中共得到个基因 （表）。不 同 小写 字 母 表 示 在 水 平 差 异 显 著 性 （）。下同 。 图 不同类型西瓜果实中游离态 含量 的变化 图 不同类型西瓜果实中可溶性固形物含量的变化 黑龙江农业科学 期表 西瓜 基因组中基因 家族的特征 基 因 登录号 染色 体定位预测 的蛋白 氨 基 酸长度 分子 量 结构 域 二聚 化结构域 表示存在此结构域 。 利用 进化树分析软件对西 瓜的个和 拟 南 芥 的个蛋 白 序 列 （，；，；，；，；，；，；，）进行 进化分析 。由图可以看出 ，西瓜和拟南芥的蛋白 主要分为大类 ，西瓜中 的、基 因 编 码 的 蛋 白 和 拟 南 芥（）、（）、（）、（）和（）蛋白 聚为一类 ，、编码 的蛋白与（）和（）聚 为 一 类 。其 中 ，与（）亲缘 关系较近 ，可能具有相似功能 。图 西 瓜 和拟南芥 蛋白家族的系统进化树分析 西瓜基因 在不同组织部位的表达分析分别提取授粉 后的根 、叶 、顶 端生长点 、果柄及果肉组织 ，利用荧光定量对候选个基因 的表达情况进行分析 。以时在果柄组织的表达 量作为，从图中可以看出 ，和在根 部的表达量最高 ，排在第位的是它的 表达 量 约 为的，、和表达 量较低 。与其它器官相比 ，西瓜基因 家族在叶片中的表达量均相 对 较 低 。在 顶 端 生 长 点 中 ，主 要 表 达、基因 ，其 它基因 表达量 较 低 。果柄组织中主要表达、基 因 ，其 次 为、基因 ，与表达 量极低 。在果肉组织中 ，和表达 量极低 ，几乎为。表达 量最高 ，高出排在第二 位 的将 近 一 倍 ，和表达 量约为的。图 中 基因在西瓜不同组织的表达情况 期 高 嫱等：生长素酰胺水解酶基因在西瓜果实发育过程中的表达 基因 在野生及栽培西瓜果实发育过程中的表达差异分析分别提取授粉 后、和授粉 后、的果肉 组织总，对比 检测个基因 在野生与栽培西瓜品种果肉中表达差异情况 ，取相同时期果 皮 作 对 照 。以 授 粉 后时在果 皮组织的表达量作为。从图中可以看出 ，除基因 以外 ，其余个基因 在果肉中的表达均显著高于在果肉 及果皮 的表达 ，并且在野生果肉与果皮 的表达情况基本相同 。其中 ，、在果肉 表达量变化趋势与果实整组织游离态的浓 度变化趋势类似 ，都在授粉后达到最高 ，在授粉后降低 ，又 在有所 上调 。这个基因均表现出在含糖量高的组织表达量高 ，栽培西瓜的果瓤高于野生西瓜的果瓤 ，栽培西瓜的果皮 （含糖量也低 ）与野生西瓜的果瓤同样表现出较低的表达量 。其中表达 量最大 ，推测其在水解结合态生长素中发挥更大的作用 。图 基因在不同类型西瓜果实中的表达情况 结 论 与讨论生长 素很早就被报道参与果实发育过程 ，外施生长素会扰乱正常的果实成熟过程，此外 生长素对果实坐果及果实大小的调控也起到关键作用。除此 以外 ，在一些报道中 ，提出了果实组织中生长素合成或信号传导与糖积累之间的联系，但生 长素如何影响糖代谢进而影响果实品质的机理还不清楚 。在烟草细胞中 ，生长素抑制了淀粉粒的发育 ，淀粉生物合成主要酶的积累受生 长 素 的 影 响。下调生长素响应因子的表 达的转基因番茄 ，在果实发育早期积累更多的淀粉 ，后期积累更多的糖。西瓜 起 源 于 非 洲 ，西 瓜 祖 先 品 种 （或 ，或其 它 ）有着白而坚硬的果肉 、厚厚的果皮 、极低的含糖量 ，味苦 ，以上性状均有利于在雨季到来之前保护种子 ，防止种子过早被传播。经过 人为驯化过程 ，现代栽培西瓜和野生西瓜祖先品种在外观和成分上有着明显的不同 ，这些变化的结果就是由不成熟并苦涩的野生西瓜变成了完全成熟并甜的栽培西瓜 。目前西瓜驯化过程的关键影响因素的研究还很少 ，西瓜由不甜的野生品种驯化为可以积累糖分的栽培品种 ，涉及的关键因子有待于进一步研究 。本研究测量了野生品种 “”、早熟栽 培西瓜品种果实 不同发育时期整组织的游离态浓度 的变化情况 ，发现不同类型西瓜果实游离态的浓 度变化有差异 。二者游离态的含 量均呈现先升后降趋势 ，达到黑龙江农业科学 期最高 值 ，而后下降 。这可能与种子发育有关 ，种子早期形成与发育会合成大量游离态，成熟后 ，游 离态的含 量迅速降低，导致 果实整组织游离态的降 低 。在果实发育中后期 ，果实整组织的游离态主要 来源于果肉 ，野生西瓜游离态的含 量几乎降为零 ，而栽培品种仍维持较高含量的游离态。此时是栽培西瓜果肉 中可溶性固形物迅速积累期 （决定西瓜含糖量 ），游离态可能 是栽培西瓜果肉糖分积累的关键因素 。总体上看 ，栽培西瓜在果实发育的各个阶段游离态的含 量显著高于野生西瓜 ，这与栽培西瓜同化物积累的能力显著高于野生型相吻合 。作为 重要的植物激素 ，其含量的变化对植物生长发育有重要的影响 。除了从头合成途径 ，从结合态水解 释放出有活性的也是其 重要来源 ，生长素酰胺水解酶基因 在此过程发挥了重要的作用。最早在拟南芥发现并 鉴定了生长素酰胺水解酶基因，后在许 多植物中陆续发现蛋白 通过调控游离态的释 放调控了植物的众多发育过程 。其中 ，桃家族 的基因在 桃果实成熟过程表达量上调了倍 ，可能通过催化生长素氨基酸结合态水解的形式参与了溶质型桃果实成熟阶段生长素 的 跃 变 过 程 ，进而调控桃果实发育过程。目前基因 家族的 功 能 研 究 还 十 分有限 。本研究从西瓜基因组数据库中鉴定出个家 族 成 员 ，编 码 的 氨 基 酸 长 度 在。结果 显示 ，西瓜家族 基因中、及在栽 培西瓜果肉中的表达量 ，明显高于野生西瓜果肉 ，且在整个果实发育时期保持相对较高水平 ，这与栽培西瓜果实整组织游离态的含量较高相一致 。其 中 ，分析发现基因 的表达量变化趋势与果实整组织游离态的浓 度变化趋势一致 ，推测该基因是调控西瓜果实生长素含量的关键基因 。进化树结果显示 ，编码 的蛋白与拟南芥亲缘 关系较近 。主要 水解和，推测主要以和为底 物 ，调节西瓜果实游离态的含 量 ，进而参与栽培西瓜可溶性固形物的积累 。进一步对果实差异表达的家族 基因的功能开展解析 ，将会探明生长素调控西瓜果实成熟及糖分积累的分子机制 ，本项研究为此奠定了良好工作基础 。参考文献 ： ， ， ，（）： ， ， ，（）： ， ， ， （ ） ，（）： ， ， ， ，（）： ，（）： ， ， ，（）： ， ， ，（）： ，（）： ， ：， ，（）： ， ， ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ü ： ，（）： ， ， ， 期 高 嫱等：生长素酰胺水解酶基因在西瓜果实发育过程中的表达 ，（）： ， ， ， ，（）：潘磊 ，曾 文芳 ，牛良 ，等 桃生长素酰胺水解酶基因家族序列特征及其表达分析 园 艺 学 报 ，（）： ， ， ， ： ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ， ，： ， ： ，（）： ， ， ， ，