北京地区南瓜病毒病病原种类鉴定.pdf

<p>Molecular Identification of Tomato mottle mosaic virus CHENLing-zhi1，ZHANGRu1，WEIBing-qiang1，WANGLan-lan1，GAOYan-ping2，ZHANGWu21InstituteofVegetables， GansuAcademyofAgriculturalSciences， Lanzhou730070， Gansu， China；2GansuPotatoSeed（ Seedling） VirusDetectionandEvaluationofEngineeringTechnologyResearchCenter， Lanzhou730070， Gansu， ChinaAbstract： UsingDAS-ELISAandRT-PCRmethods，this studyidentifiedpepperpathogeneticvirusinexperimentalfieldsofVegetableInsititute，Gansu AcademyofAgriculturalSciences.Theresultsshowedthatin72diseaseinfectedsamples，the totalTMVdetectionratewas66.7%，whereas CMVhadnotbeendetectedaspositive.Threepairsofprimersweredesignedtoamplifypositivesamples.AstripwithsimilarsegmentswasamplifiedonlyfromprimerTMV1，which had97%sequencesimilaritywithToMMVbyBLASTNcomparison.AimingatToMMV，3 pairsofprimersToMMV1，ToMMVcp andToMMVspeweredesignedtoamplifyToMMV.Asingletargetbandwithsamesizeasexpectedwasamplified.Itssequencewas98%accordedwithToMMVbysequencing，provingthevirusfoundintheexperimentalfieldsofVegetableInsititutewastrulyToMMV.Key words：Pepper；Virusdisease；DAS-ELISA；ToMMV；RT-PCR北京地区南瓜病毒病病原种类鉴定陈利达 曹金强 石延霞 柴阿丽 谢学文*李宝聚*（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）摘 要 ：为明确北京地区南瓜病毒病种类及其主要侵染病原，20162017 年在北京周边采集疑似感染病毒的南瓜病样 84 份，并根据南瓜上的 6 种病毒特异性引物对其进行反转录 PCR（RT-PCR）检测。结果表明：共有 79 份南瓜病样检测显示阳性，其中黄瓜花叶病毒（ Cucumber mosaic virus，CMV）的检出率最高，为 52.38%；其次是小西葫芦黄花叶病毒（ Zucchini yellowmosaic virus，ZYMV）和西瓜花叶病毒（ Watermelon mosaic virus，WMV），检出率分别为 44.01%、14.29%，其他病毒暂未检出。此外，16.67% 的样品受 2 种病毒复合侵染，CMV 和 ZYMV 复合侵染占 7.14%，ZYMV 和 WMV 复合侵染占 9.52%。北京地区南瓜上优势病毒种类为 CMV，且存在病毒复合侵染现象。关键词 ：南瓜；病毒病；种类鉴定ficifoliaBouché）并列为世界上南瓜属作物的5个栽培种（李昕升 等，2017）。南瓜因产量高、效益好，且具有一定的保健作用，成为我国北方地区菜粮兼用作物之一。据联合国粮农组织（FAO）统计，2014年全世界南瓜产量约为2 519万t，我国占世界当年总产量的28.74 %，居世界第1位（王璐，2017）。随着南瓜种植规模的扩大，病毒病也愈发严重，成为制约南瓜产业发展的主要因素之一，尤其在高温干旱的年份，严重影响南瓜的品质与产量。据报道，能够侵染南瓜的病毒种类有 80 多种，其中小西葫芦黄花叶病毒（ Zucchini yellow mosaic 陈利达，男，硕士，科研助理，专业方向：蔬菜病害检测，E-mail：1271840305qq.com* 通讯作者（Corresponding authors）：谢学文，男，博士，专业方向：蔬菜病害综合防治，E-mail：xiexuewencaas.cn；李宝聚，男，研究员，专业方向：蔬菜病害综合防治，E-mail：Libaojucaas.cn收稿日期：2017-12-04；接受日期：2018-03-06基金项目 ：国家重点研发计划项目（2016YFD0201010），公益性行业（农业）科研专项经费课题项目（201303112）南瓜（ Cucurbita moschata Duch.，中国南瓜）、笋瓜（ Cucurbita maxima Duch.exLam.，印度南瓜）、西葫芦（ Cucurbita pepoL.，美洲南瓜）、墨西哥南瓜（ Cucurbita mixtaPangalo）和黑籽南瓜（ Cucurbita 43新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜 &nbsp; &nbsp; CHINA VEGETABLES2018（6）：43-47virus，ZYMV）、黄瓜花叶病毒（ Cucumber mosaic virus，CMV）、西瓜花叶病毒（ Watermelon mosaic virus，WMV）、南瓜花叶病毒（ Squash mosaic virus，SqMV）、番木瓜环斑病毒（ Papaya ringspot virus，PRSV）和马铃薯 Y 病毒（ Potato viurs Y，PVY）（Lecoq etal.，1997；Fletcher etal.，2000；周贤，2013；刘嘉峪等，2017）发生相对普遍。近年来北京地区南瓜的种植面积逐年增加，南瓜病毒病危害日趋严重，本文针对北京周边地区采集的疑似感染病毒病的南瓜叶片，采用反转录 PCR（RT-PCR）技术进行检测，以期了解北京地区南瓜上主要病毒种类及其分布，为当地南瓜病毒病的防控和抗病品种的选育提供参考。1 材料与方法1.1 样品采集20162017年，在北京周边地区采集疑似感染病毒病的南瓜样本（叶片）共 84 份：顺义区 32份、昌平区15份、大兴区12份、海淀区25份。所采样品均保存在 -80冰箱备用。1.2 试剂与仪器试剂： TRIzolReagent 购自英潍捷基（上海）贸易有限公司；反转录试剂盒 FastQuant RTKit购自天根生物科技（北京）有限公司；2× Taq Mix（MT201）购自博迈德科技（北京）有限公司。仪器设备：3K15 型高速离心机，德国 Sigma公司生产；DYY-6C 型电泳仪，北京市六一仪器厂生产；移液枪，德国 Eppendorf 公司生产；Jel Doc2001 型凝胶成像系统、Bio-Rad S1000PCR 仪，美国伯乐公司生产。1.3 植物总 RNA 提取采用 TRIzol 法提取南瓜叶片总 RNA。取 100mg南瓜叶片于液氮中研磨，将0.2 g粉末转入1.5 mL 离心管，迅速加入 1mLTRIzol 试剂，振荡混匀，室温下静置 5 min；4 下 12 000r·min-1离心 10min；将上清液转入 1.5 mL 离心管，加入 0.2 mL 氯仿混匀，室温放置 5 min；4 下 12 000r·min-1离心 10 min；取水相（约 400 L）加入等体积的异丙醇，室温下静置 10 min；4 下 12 000r·min-1离心 10 min；弃上清液，加入 1 mL75% 乙醇洗涤沉淀 2 次，4 下 12 000r·min-1离心 5 min；自然干燥，加入 50 L RNase-FreeddH2O溶解；以健康南瓜叶片总 RNA 为阴性对照，-80保存备用。1.4 南瓜病毒病样本 RT-PCR 检测以提取总 RNA 为模板，用 FastQuant RTKit 试剂盒反转录合成病毒的 cDNA 第一条链。使用已报道的 CMV-F/CMV-R、 SqMV-1/SqMV-2、 PRSV-F/PRSV-R 和 PVY-1/PVY-2 特异性引物（表 1）对不同样本进行RT-PCR扩增，其中 ZYMV-1/2 和WMV-1/2 是根据GenBank已有的病毒外壳蛋白基因（ Coat Protein， CP）序列所设计。所用引物均由博迈德科技（北京）有限公司合成。表 1 用于南瓜病毒病分子检测的引物信息引物编号 引物序列（5-3） PCR 产物/bp 参考文献CMV-F CGTTTAGTGACTTCAGACAG 735 宋婷婷CMV-R ATGGACAAATCTGAATCAAC 等，2007ZYMV-1 AAAGAAGAAGACAAAGGGAA 582 自行设计ZYMV-2 AGCGTATCGTGCTAAACTWMV-1 ACACCAGTGGCAAAGGG 697 自行设计WMV-2 CCATCAAGTCCAAATAACCSqMV-1 CATGGTACAGCAGCTTGGAAC 597 廖富荣SqMV-2 GAAGCCACAACAAAACCCAGA 等，2013PRSV-F ATGAGGCTGTGGATGCTGGTTTA 325 任春梅PRSV-R GATTGAGTGGCACGAGTATTAGA 等，2015PVY-1 GCCAACTGTGATGAATGGGC 400 冯光惠PVY-2 TGTACTGATGCCACCGTCCA 等，2014PCR 扩增体系： 2× TaqPCRMasterMix10 L，上下游引物各 0.5 L， cDNA 模板 1 L，ddH2O 补足至 20 L。 PCR 扩增条件： 94预变性 4 min； 94变性 30 s， 53退火 30 s， 72延伸 45 s，共 34 个循环； 72补充延伸 10 min。扩增结束后，取 5L PCR 产物于 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测，使用全自动凝胶成像系统记录结果。PCR 产物送至博迈德科技（北京）有限公司进行测序，并利用 NCBI 序列比对工具 BLAST（http：/blast.ncbi.nlm.nih.gov/）程序，根据核酸序列同源性确定病毒种类。2 结果与分析2.1 &nbsp;RT-PCR 扩增结果对采集的 84 份南瓜病毒病样本（叶片）提取总 RNA，利用不同特异性引物进行 RT-PCR 检测，部分检测结果见图1。待测样品中引物CMV-F/CMV-R 可扩增出大小 735 bp 的条带（图 1-a），44新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜 &nbsp; &nbsp; CHINA VEGETABLES引物 ZYMV-1/ZYMV-2 可扩增出大小 582 bp 的条带（图 1-b），引物 WMV-1/WMV-2 可扩增出大小697bp 的条带（图 1-c），阴性对照均未扩增出目的条带。表明在待检样品中能分别测出 CMV、ZYMV和 WMV，但未检测到 SqMV、PRSV、PVY。2.3 南瓜植株上病毒的复合侵染情况北京地区 84 份南瓜病毒病样品中，发现 14 份病样为2种病毒复合侵染，复合侵染率为16.67% （表3）。其中，北京顺义区南瓜病毒病复合侵染种类为 CMV 和 ZYMV，侵染率为 18.75%；海淀区南瓜病毒病复合侵染种类为 ZYMV 和 WMV，侵染率为 32.00%，未检出 3 种病毒复合侵染。表 3 北京地区南瓜病毒复合侵染类型及分布采样地样品数量CMV+ZYMV ZYMV+WMV CMV+WMV检出数检出率/%检出数检出率/%检出数检出率/%顺义区 32 6 18.75 0 0 0 0昌平区 15 0 0 0 0 0 0大兴区 12 0 0 0 0 0 0海淀区 25 0 0 8 32.00 0 0总计 84 6 7.14 8 9.52 0 02.4 北京地区南瓜病毒病田间症状南瓜病毒病的发生可贯穿植株整个生长发育期，为系统性侵染。北京地区南瓜病毒病主要包括花叶、褪绿和皱缩等症状，经室内分子检测后得知田间病毒种类为 CMV、ZYMV 和 WMV 3 种。CMV田间症状（图2-a）：叶片叶绿素分布不均，易出现黄色或淡黄色病斑。严重时叶片变小变脆，出现浅黄色部分斑驳，呈现黄绿分布不均的镶嵌状花叶症状。ZYMV 田间症状（图 2-b）：叶面出现花叶及斑驳症状，部分叶肉逐渐褪绿黄化，易出现明脉。严重时植株矮化，节间变短，叶缘卷曲形成鸡爪状，图 1 南瓜部分样品 RT-PCR 检测结果a 为 CMV 引物扩增结果，b为 ZYMV 引物扩增结果，c为 WMV引物扩增结果；M，BM5000 DNAMarker；N，健康植株；111，部分感病植株。M N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 112000bp1000bp750bp500bp250bp100bpa2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpbM N 1 2 3 4 5 6 7 8 92000bp1000bp750bp500bp250bp100bpcM N 1 2 3 4 5 6 7 8 92.2 南瓜主要病毒种类检测结果对采集的84份南瓜病毒病样本进行PCR检测，其中79份病样检测显示阳性，检出3种病毒 分 别 为 CMV、ZYMV 和 WMV， 病 毒 检 出 率94.05%。其中 CMV 检出率最高，可达 52.38%；其次为 ZYMV，检出率 44.01%；WMV 检出率 14.29%（表2）。因此，CMV在北京地区南瓜上侵染最普遍，为优势病毒种类。北京不同地区南瓜病毒种类及发生程度有所差异（表2）。在南瓜植株上检出的病毒种类最多的是顺义区和海淀区，检测到 3 种病毒，这 2 个地区南瓜病毒病发生最为严重；其次是昌平区和大兴区，分别检测出 2 种病毒，该地区病毒病危害较轻。表 2 北京地区南瓜病毒种类及分布采样地样品数量CMV ZYMV WMV检出数检出率/%检出数检出率/%检出数检出率/%顺义区 32 21 65.63 11 34.38 4 12.50昌平区 15 10 66.67 2 13.33 0 0大兴区 12 8 66.67 4 33.33 0 0海淀区 25 5 20.00 20 80.00 8 32.00总计 84 44 52.38 37 44.01 12 14.29图 2 南瓜病毒病田间发病症状a，CMV 侵染南瓜叶片症状；b，ZYMV 侵染南瓜叶片症状；c，WMV 侵染南瓜叶片症状；d，CMV+ZYMV 复合侵染南瓜叶片症状；e，ZYMV+WMV 复合侵染南瓜叶片症状。彩色图版见中国蔬菜网站：www.cnveg.org。a b c d e45新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜 &nbsp; &nbsp; CHINA VEGETABLES并常伴有蕨叶及叶面凹凸起伏症状。WMV 田间症状（图2-c）：叶片变小变硬，叶缘部分失绿并伴有斑驳等症状。发病中后期植株表现皱缩矮化、叶片卷曲，发病严重时茎蔓变短，发病组织呈瘤状突起。混合侵染的植株发病症状表现较为复杂，发病较重。CMV和ZYMV复合侵染后植株矮化，叶缘卷曲，叶片颜色变浅，出现蕨叶及叶面不平现象（图2-d）。ZYMV 和 WMV 复合侵染现象广泛存在，其症状在叶片上表现明显，叶片出现褪绿黄化，易形成深浅绿色相间花叶，伴有皱褶卷曲现象。有时叶缘处有斑驳突起，病株生长迟缓，开花结果后病情趋于加重（图 2-e）。3 结论与讨论病毒病是制约南瓜生产的重要因素之一，随着我国南瓜种植面积逐年增加，病毒病的危害日益加重，给南瓜生产造成严重的经济损失。南瓜病毒病在我国长江地区、内蒙古、新疆、黑龙江等地普遍发生（马英，2017）。不同地区引起南瓜病毒病的毒源种类不尽相同，新疆石河子地区南瓜病毒病毒源种类主要为 CMV、ZYMV、WMV、PRSV-W（任琛荣 等，2016）；黑龙江地区南瓜病毒病的毒源种类为 CMV 和 WMV（杨国慧，2003）。本试验结果表明，侵染北京地区南瓜的主要毒源有CMV、ZYMV 和 WMV 3 种， 未 检 测 到 SqMV、PRSV、PVY等其他病毒，由于病毒分布具有区域性，目前 SqMV 只在黑龙江南瓜上有相关报道（李凤梅，2002）。其他病毒种类也未检出，可能是由于采样数量少或部分南瓜植株病毒症状表现不明显，导致漏采。在所有检测样品中 CMV 的检出率较高，可能是由于 CMV 寄主范围广，可侵染 1000 多种单、双子叶植物（王海河 等，2001），且 CMV 可由 60多种蚜虫进行非持久性传播，因此成为北京地区南瓜病毒病优势毒源。此外，本次采集样本共84份，其中有79份病样显示阳性，5份疑似感染南瓜病毒病，但在该样本内未检测到病毒，可能是生理性病害或药害所致。瓜类病毒复合侵染现象在不同地区均有报道，部分学者对我国瓜类主产区进行病毒种类调查，发现存在多种病毒复合侵染现象，其中以 PRSV 和WMV组合最为常见，占复合侵染组合的31.25%（尤毅 等，2016）；重庆地区南瓜检测样品中有93.22% 的样品受 2 种以上病毒复合侵染（青玲等，2010）。本试验中 2 种病毒复合侵染率为 16.67%，可能与连作、传毒媒介、种子与土壤带毒有关。尤其是昆虫传毒，CMV、ZYMV 、WMV 均可通过蚜虫进行传播，部分蚜虫可携带多种病毒进行再侵染，导致一种植株上出现 2 种或 2 种以上病毒复合侵染现象。也可能与病毒越冬习性有关，如国内学者在重庆地区对南瓜病毒病进行鉴定，发现农田周围葎草上存在 7 种病毒，且复合侵染的比例 高 达 80%（ 青玲 等，2009）。CMV、ZYMV 和WMV均为种传病毒（杨国慧，2003），再加上田间管理不当、单一品种种植模式等，成为南瓜病毒病发生严重且存在复合侵染的主要原因。本试验已检测出北京地区南瓜病毒病的毒源种类主要有 CMV、ZYMV 和 WMV，但受采集数量和地域性的限制，无法涵盖北京地区南瓜病毒所有种类，因此，是否存在其他病毒种类还有待进一步研究。参考文献冯光惠，杜虎平，李夏隆，亢福仁2014陕北地区马铃薯Y病毒的RT-PCR检测及其序列分析山西农业科学，42（9）：941-944李凤梅2002黑龙江省南瓜病毒病毒原鉴定和品种资源抗性筛选的研究硕士论文哈尔滨：东北农业大学李昕升，吴昊，刘宜生2017南瓜属作物与南瓜品种资源中国野生植物资源，36（5）：1-6廖富荣，叶志红，陈青，吴媛，陈红运，林石明2013应用 RT-PCR 和 IC-RT-PCR 方法检测南瓜花叶病毒植物检疫，27 （2）：60-64刘嘉裕，戴良英，刘勇，张德咏，谭新球，李迅，唐前君2017 长沙地区南瓜的小西葫芦黄花叶病毒检测及其分子进化分 析湖南农业大学学报：自然科学版，43（3）：274-281马英2017籽用西葫芦病毒病发病流行原因分析及防治中国蔬菜，（7）：86-88青玲，杨水英，孙现超，王进军，周常勇2009从葎草中检出复合侵染的多种病毒植物保护，35（4）：138-139青玲，包凌云，周常勇，杨水英，孙现超2010重庆南瓜病毒病病原ELISA检测及 CMV 变异分析园艺学报，37（3）：405-412任春梅，程兆榜，杨柳，缪倩，周益军2015江苏省葫芦科作物6 种病毒的多重RT-PCR方法及应用江苏农业学报，31（4）：756-763任琛荣，郝小军，都业娟，向本春2016新疆石河子及新湖籽用西葫芦病毒病分子检测北方园艺，（1）：102-106宋婷婷，陈荣溢，杨雷亮2007应用多重 RT-PCR 检测烟草上的46新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜 &nbsp; &nbsp; CHINA VEGETABLESTMV 和 CMV辽宁农业科学，（1）：53-54王海河，林奇英，谢联辉，吴祖建2001黄瓜花叶病毒三个毒株对烟草细胞内防御酶系统及细胞膜通透性的影响植物病理学报，31（1）：43-49王璐2017南瓜籽不同干燥方式及工艺对南瓜籽油功能性品质的影响硕士论文北京：中国农业大学杨国慧2003滇黑两省南瓜病毒病病原鉴定及其外壳蛋白基因克隆博士论文哈尔滨：东北农业大学尤毅，李华平，谢大森2016侵染冬瓜的病毒病原种类鉴定植物保护，42（2）：182-186周贤2013苏丹首次报道南瓜感染番木瓜环斑病毒植物检疫，（3）：100FletcherJD，W allaceAR，Rogers BT2000 PotyvirusesinNewZealandbuttercupsquash（ Cucurbits maximaDuch ）：yield andqualityeffectsofZYMVandWMV2virusinfectionsNew ZealandJournalofCropandHorticulturalScience，28（1）：17-26LecoqH，Dafalla G，Desbiez C，Wipfscheibel C，Delecolle B1997 BiologicalandmolecularcharacterizationofMoroccanWatermelon mosaic virus andapotyvirusisolatefromEasternSudanP lantDisease，85（5）：547-552Identification of Pathogen Species of Virus Diseases Infecting Squash in Beijing AreaCHENLi-da， CAOJin-qiang， SHIYan-xia， CHAIA-li， XIEXue-wen*， LIBao-ju*（ InsitituteofVegetablesandFlowers， ChineseAcademyofAgriculturalSciences， Beijing100081， China）Abstract：InordertoclearanddefinitespeciesofsquashvirusdiseasesinBeijingareaandtheirmaininfectionpathogens，this papercollected84squashsampleswithsuspectedvirus-likesymptomsduring2016-2017fromBeijingarea，and carriedoutdetectionbyRT-PCRused6pairsofspecificvirusprimersThe resultsshowedthat79sampleswerepositive，among which Cucumber mosaic virus （CMV） hadthehighestdetectionrate-52.38%，followed by Zucchini yellow mosaic virus （ZYMV） andWatermelon mosaic virus （WMV）Their detectionratewere44.01%and14.29%，respectivelyOther viruseswerenotyetdetectedIn addition，16.67% samplesweremix-infectedby2kindsofvirusesMix infectionofCMVandZYMVtook7.14%Mix infectionofZYMVandWMVtook9.52%CMV wastheprevalentpathogenicvirusinBeijingarea，where themixinfectionofvirusesonsquashwasexistedKey words：Squash；Virus diseases；Species identification 47新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜 &nbsp; &nbsp; CHINA VEGETABLES</p>