大白菜枯萎病病原镰刀菌种类的初步研究_闫文雪.pdf

植物病理学报 ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 研究论文 收稿日期2018- 01-23 基金项目现代农业产业技术体系北京市叶类蔬菜创新团队建设专项资金资助 BAIC07-2017；中国农业科学院创新工程项目CAAS-ASTIP-IVFCAAS；农业部园艺作物生物学与种质创新重点实验室 通讯作者李宝聚，研究员，主要从事蔬菜病害综合防治研究；E -mailL 第一作者闫文雪，女，硕士研究生，主要从事蔬菜病害鉴定；E -。 doi10.13926,/ki.apps.000141 大白菜枯萎病病原镰刀菌种类的初步研究 闫文雪，石延霞，李盼亮，柴阿丽，谢学文，李宝聚∗中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081 摘要 2014-2016年，由于栽培管理及重茬等原因，大白菜枯萎病在我国大面积发生，造成了巨大的经济损失。为了明确引起大白菜枯萎病的病原菌，本课题组从山东、内蒙古、河北、甘肃等大白菜主产区采集了具有典型枯萎病症状的病样，并对样品中的病原菌进行了分离和鉴定。形态学鉴定结果表明分离物分别具有尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum、茄病镰刀菌 F. solani 和木贼镰刀菌 F. equiseti3个种的形态学特征。柯赫氏法则验证结果表明3种病原菌均能够使大白菜发病，且发病症状与田间症状一致。此外，基于病原菌的rDNA-ITS和mt SSU序列的测序比对，3种病原菌与尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和木贼镰刀菌的同源性分别达99100，这与形态学鉴定结果相一致。尖孢镰刀菌引起白菜枯萎病为国内首次报道，而茄病镰刀菌和木贼镰刀菌引起白菜枯萎病为国内外首次报道。 关键词 大白菜；镰刀菌枯萎病；尖孢镰刀菌；茄病镰刀菌；木贼镰刀菌 Preliminary study on Fusarium species causing Chinese cabbage wilt YAN Wen-xue, SHI Yan-xia, LI Pan-liang, CHAI A-li, XIE Xue-wen, LI Bao-ju∗Institute of Vegetables an d Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, 100081, China Abstract Due to improper cultivation management and continuous cropping, Fusarium wilt in cabbage has widely occurred in Chinese cabbage-producing regions -leading to serious economic losses in China during 2014-2016. To determine the pathogen of Chinese cabbage wilt, the plant samples exhibiting wilt symptom were collected from several provinces such as Shandong, Inner Mongolia, Hebei, and Gansu, etc. Then, the suspected pathogens were isolated and identified as Fusarium oxysporum, F. solani, and F. equiseti based on morphological characteristics. To satisfy Koch’s postulates, the pure fungal cultures were to inoculate in Chinese cabbage and the wilt symptoms were consistent with that in the field. Furthermore, the molecular evidences from the sequence aliments of rDNA-ITS and mtSSU with identity up to 99100 totally met the results of morphological characterization above. To our knowledge, this is the first report of Chinese cabbage wilt disease caused by F. oxysporum in China, and the new report of the disease by F. solani, and F. equiseti in the world. Keywords Chinese cabbage；Fusarium wilt；F. oxysporum；F. solani；F. equiseti 网络出版时间2018-05-08 160207网络出版地址http// 大白菜枯萎病病原菌鉴定 2 中图分类号S432.1 文献标识码 文章编号 中国是大白菜（Brassica rapa var. pekinensis）生产和消费大国，大白菜已成为人们日常生活中不可缺少的蔬菜。白菜类作物是中国栽培蔬菜中历史最长、分布最广、种植面积最大的蔬菜作物之一，在全国各地均有种植。由于大白菜具有较高的营养价值，含有丰富的蛋白质、纤维素等，不但有排毒润肠的作用，而且还可增加机体的抵抗力，用于癌症、坏血病等各种疾病的预防；同时价格低廉，所以广受消费者的青睐[1-2]。近几年，由于栽培管理不善、重茬、使用未腐熟蓄粪等原因，使得大白菜病害种类逐年增加，尤其是大白菜枯萎病已成为制约大白菜生产的主要因素之一。该病害在全国各地均有发生，特别是在严重地块发病率高达80以上，导致大部分植株枯萎死亡，严重影响白菜产量和质量，造成巨大的经济损失。 大白菜枯萎病是由多种镰刀菌侵染引起的土传病害。镰刀菌属的真菌种类较多，广泛分布于自然界中。目前世界上已报道的镰刀菌有500多种[3]，国内已报道可危害蔬菜的镰刀菌有60多种（https//nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/），包括尖孢镰刀菌（F. oxysporum）、茄病镰刀菌（F. solani）、同生镰刀菌（F. commune）、三线镰刀菌（F. tricinctum）、木贼镰刀菌（F. equiseti）等。同时，该类病原菌寄主范围较广泛，国内外已报道被侵染的寄主植物高达上百种，包括西瓜、大豆、大蒜、番茄等[4]。有些镰刀菌还可以产生真菌毒素，严重危害人畜健康[5]。2014-2016年，本研究对采自我国主要白菜生产区的白菜枯萎病病样进行病原菌分离，通过形态学鉴定及致病性测定，结合分子生物学方法对白菜枯萎病病原菌进行鉴定，以确定白菜枯萎病的病原菌种类。 1 材料与方法 1.1 病样采集及症状观察 2014-2016年，在我国山东潍坊沂源县、内蒙古乌兰察布商都县、河北张家口尚义县、甘肃兰州榆中县、北京昌平区等白菜种植区对白菜枯萎病的发生情况进行调查。采集具有典型发病症状的白菜病样，观察并记录病害症状，包括发病部位、病斑颜色、大小以及危害程度等。 1.2 病原菌的分离培养及形态观察 采用常规组织分离法对病原菌进行分离。待PSA（Potato sucrose agar）[6]培养基上长出分离物后，进行单孢分离和纯化培养，并置于4C冰箱保存备用。观察并记录在PSA培养基上的菌落特征，显微镜观察在CLA（Carnation leaf-piece agar）[7]培养基上的形态特征，并对分生孢子、分生孢子梗长宽等进行测量。1.3 致病性测定 对所有分离物进行致病性测定。采用伤根蘸根法，将大白菜（品种北京新三号；栽培方式盆栽；苗龄两叶一心）的根部在1108mL-1的孢子悬浮液中浸泡30 min，并不断晃动，以在无菌水中浸泡30 min的作为空白对照。每个处理3次重复，每个重复设20棵苗。接种后，每天观察植株的长闫文雪，等 大白菜枯萎病病原菌鉴定 3 势和发病情况，及时记录并采集图像。10 d后调查植株的发病情况，计算病情指数。发病率和病情指数计算公式如下 0级无病症； 1级真叶或子叶上出现轻微萎蔫，但生长正常； 2级真叶或子叶上出现明显的坏死斑，根部出现病变，生长受到一定影响； 3级根部坏死引起局部性萎蔫，或生长僵化； 4级整株萎蔫，倒伏枯死，根部严重病变； 发病率（）[发病株数/总株数]100。 病情指数[∑各级病株数相对级数值/总株数最高级数代表值] 100 1.4 分子生物学鉴定 利用CTAB法提取病原菌基因组DNA，采用通用引物ITS和特异性引物mt SSU进行PCR扩增，反应体系和反应程序参照White等[8-9]方法。扩增产物经1琼脂糖凝胶电泳检测后，将纯化的PCR产物送至北京博迈德基因技术有限公司进行测序，测得序列在GenBank中进行BLAST比对分析，利用MEGA 6.0软件构建系统发育树。 2 结果与分析 2.1 危害及症状 通过调查发现，大白菜枯萎病主要危害根茎部，最后导致整株萎蔫、死亡。发病初期地上部主要表现为整个叶缘呈现黄化（图1-A），中午时分植株整株萎蔫，早晚时分恢复正常。随着病情的发展，叶片开始脱落，不能包心，整株长势不佳、矮小（图1-B），地下部表现为茎部维管束成褐色或黑褐色，中空，根部干枯、褐变。 Fig.1 Symptoms of Chinese cabbage wilt in the field A Yellowing from the leaf margin; B Wilt and died symptoms of the diseased plants. 2.2分离物培养性状与形态特征 从具有白菜枯萎病典型症状的病样中分离得到46株分离物，对这些分离物进行初步的形态学鉴定，A B A 闫文雪，等 大白菜枯萎病病原菌鉴定 4 根据形态学特征将这些分离物分为3类。 A类在PSA培养基上27 C培养5 d后，直径为4.8 cm；气生菌丝较多，初期菌落白色，后变成红色，后期产生紫红色色素（图2-A、D）。大型分生孢子镰刀形，月牙型，稍弯或弯曲，两端逐渐变尖，28个隔膜，多数3个隔膜，大小为（19.840.3） μm （2.35.9） μm（图3-A）。小型分生孢子数量较多，卵圆形或肾形，大小为（5.611.5） μm （2.73.9） μm（图3-B）。厚垣孢子较易产生，球形，单生、对生或串生，直径6.810.7 μm（图3-C）。 B类在PSA培养基上27 C培养5 d后，直径为4.3 cm，菌落呈白色，薄绒状，不产生色素（图2-B、E）。大型分生孢子马特型，两端较顿，顶部稍尖，壁较厚，28个隔膜，多数3个隔膜，大小为（25.741.6） μm （4.46.8） μm（图3-D）。小型分生孢子数量较多，圆形、卵圆形、肾形等，壁较厚，01个隔膜，大小为（9.216.2） μm （2.75.8） μm（图3-E），假头状着生于长的单瓶梗（图3-F）上。气生菌丝上产孢结构为长筒形单瓶梗，不分枝或稀少分枝。厚垣孢子多，圆形，壁光滑，单生或对生，直径6.39.7 μm。 C类在PSA培养基上27 C培养5 d，直径为5.2 cm，菌落初为白色，棉絮状，后变为深褐色，同时产生暗褐色色素（图 2-C、F）。大型分生孢子由分生孢子座产生（图3-H），镰刀形，弯曲度大，腹背分明，顶细胞延长成锥形，基细胞有足跟，多数37个隔膜，大小为（18.573.5） m （2.66.5） m（图3-G）。小型分生孢子无。厚垣孢子球形，成链状或单生于菌丝中，直径6.38.9 m（图3-I）。 依据形态学特征，将分离物A初步鉴定为尖孢镰刀菌（F . oxysporum），B为茄病镰刀菌（F . solani），C为木贼镰刀菌（F . equiseti）。 闫文雪，等 大白菜枯萎病病原菌鉴定 5 Fig 2 Colonial morphology of Fusarium spp. on PSA A and D The upper and lower surface of F. oxysporum colony; B and E The upper and lower surface of F. solani colony; C and F The upper and lower surface of F. equiseti colony, respectively. A B C D E F 闫文雪，等 大白菜枯萎病病原菌鉴定 6 Fig 3 Morphological characteristics of Fusarium spp. A-C Marcoconidia, microconidia, and chlamydospores of F. oxysporum, respectively; D-F Marcoconidia, microconidia, and false-head of F. solani, respectively; G-I Marcoconidia, sporodochium and chlamydospores of F. equiseti, respectiveliy. Bar20 μm. 20 um 20 um 20 um 20 um 20 um 20 um 20 um 20 um 20 um B C D E F G H I A 闫文雪，等 大白菜枯萎病病原菌鉴定 7 2.3 致病性测定结果 致病性测定结果显示，3种分离物对大白菜均有不同的致病力，病情指数从4080不等。其中分离物A接种的大白菜植株发病最为严重，发病率高达95，病情指数为78。主要症状接种10 d后，大多数植株枯死，植株长势弱小，根部及茎部维管束变褐（图4-A、E、G）；分离物C接种的发病情况次之，发病率达75，病情指数为48，接种10 d后，大多数植株萎蔫，局部叶片变黄，植株矮小，部分根部及茎部维管束变黄（图4-B、E、F）；分离物C接种的发病情况与B类似，发病率为70，病情指数为40（图4-C、E）。依据柯赫氏法则，对发病的植株进行再分离，得到的分离物与所接菌株形态相同，证明所接菌株为白菜枯萎病的病原菌。 2.4分子鉴定结果 采用ITS1/ITS4和NMS1a/NMS2b引物对代表菌株BC14092810、BC1405140302和BC14110501-2进行扩增，分别得到520 bp、523 bp、503 bp和685 bp、605 bp、748 bp的扩增条带，测序后将这些序列提交至GenBank，获得登录号分别为MF667963、MF687 456、MF687457和MF667968、MF687456、MF667972。将测序结果与NCBI中的基因序列进行比对，利用MEGA 6.0软件构建系统发育树。结果A B D E F G A B C Fig 4 Symptoms of Chinese cabbage seedlings at 10 d post inoculation Upper panel Seedlings inoculated with isolate A A, B B, and C C, respectively; Lower panel Control seedlings treated with water D; Root rot of the inoculated plants E and F; No emergence of seedling after inoculation G. 闫文雪，等 大白菜枯萎病病原菌鉴定 8 发现，3种病原菌分别与尖孢镰刀菌（登录号为KU984712和DQ831906）、茄病镰刀菌（登录号为KP132236和KX981061）、木贼镰刀菌（登录号为KX197955和JQ690085）的菌株同源性达98100，并聚在同一分支上（Fig 5）。 Fig 5 Phylogenetic tree constructed using the Neighbour-joining of MEGA 6.0 program based on the ITS sequences of the tested isolates MF687456.1, MF687457.1, MF667963.1 and 24 isolates retrieved GenBank Bootstrap support values resulting from 1000 replicates and Verticillium dahlide served as the out group. 3 讨论 镰刀菌研究已有180多年的历史，是真菌中的一个重要类群。镰刀菌形态比较复杂，包括无性时期的小型分生孢子、大型分生孢子、厚垣孢子、产孢细胞及有性时期的子囊孢子等。由于有性阶段不闫文雪，等 大白菜枯萎病病原菌鉴定 9 易观察，因此，在镰刀菌的鉴定中主要根据无性阶段的形态特征作为鉴定依据。Booth等[10]根据大（小）型分生孢子、厚垣孢子等特征对不同镰刀菌进行鉴定；Leslie等[7]、Zhang等[11]通过培养物特征及形态学特征对不同镰刀菌进行鉴定。虽然传统形态学可以对镰刀菌属进行鉴定，但是由于该菌具的培养特征易受环境等其它因素而发生变化，所以仅凭传统方法对真菌进行分类鉴定常出现分歧和误差，不能准确区分不同镰刀菌属的种类。目前，利用分子生物学技术鉴定不同镰刀菌的方法被广泛使用，为镰刀菌鉴定提供了更加科学的依据。国内外相关研究表明rDNA ITS、EF1-ɑ、mt SSU、IGS等基因位点常被用于镰刀菌的鉴定中[12-13]，不仅可以定义物种在种水平上的概念，而且可以鉴定近缘物种间的亲缘关系。本研究基于ITS序列的系统发育分析表明，引起白菜枯萎病的3种病原菌分别与尖孢镰刀菌（F. oxysporum）、茄病镰刀菌（F. solani）、木贼镰刀菌（F. equiseti）聚在同一个系统进化支上，分子系统发育分析结果与前人研究一致[14-17]。 蔬菜根部镰刀菌病害可由单一病原菌侵染，也可由多种病原菌复合侵染，相关研究已在其它作物上有所报道[18-20]。目前，国内外已报道危害大白菜的病害大约有20种，根部病害有5种，分别为枯萎病、猝倒病、菌核病、立枯病和黄萎病。但是，国内外对白菜枯萎病的研究较少，由尖孢镰刀菌引起的大白菜枯萎病曾在加拿大、意大利、新西兰等地有过报道，但在中国并没有相关报道。而茄病镰刀菌、木贼镰刀菌引起的大白菜枯萎病在国内外都没有相关报道。本研究通过形态学特征、致病性测定，结合分子生物学技术，明确了引起大白菜枯萎病的病原菌种类。其中，茄病镰刀菌（F . solani）、木贼镰刀菌（F . equiseti）引起白菜枯萎病为国内外首次报道，尖孢镰刀菌（F . oxysporum）引起白菜枯萎病为国内首次报道，这一结果对我国白菜枯萎病的发生规律、抗病育种和综合防治具有重要参考价值。 参考文献 [1] Zhang D S, Jin T M, Xu J B, et al. 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