北京万寿菊灰霉病病原菌分离鉴定_陈东亮.pdf

2018 年 第 4 期CHINA PLANT PROTECTION 2018,Vol38No4灰 霉病是一种常见的真菌性病害 ， 是葡萄 、番茄 、草莓 、黄瓜等经济作物种植过程以及在采摘保鲜过程中常见且为害巨大的病害1-4，也 是花卉栽培中常见病害5。 该病尤其是在设施条件下种植的蔬菜 、花卉中常见发生 ，防治不及时极易造成较大损失 。灰霉病的病原菌属于真菌子 囊菌纲核盘菌科葡萄孢属 。 目前葡萄孢属约有 30 个 种6，其中大部分种可导 致植物病害 。万寿菊是常见的草本花卉 ，由于其抗性好 、病虫害少 、栽培简单 、耐粗放管理 ，已成为花境 、花坛 、道路装饰的主要植物材料 。除了观赏价值 ，万寿菊花朵还是含保健成分 叶黄素含量最丰富的植 物组织 ，是目前天然叶黄素提取的主要原料 。 近几年 ，伴随国内人民生活水平的普遍提高 ， 天然叶黄素需求逐年增加 ，间接带动了万寿菊种植产业的发展 。在北京延庆 ， 大面积种植的色素万寿菊不仅为叶黄素提取提供了原料 ， 同时打造的花海景观也带动了观光旅游 、餐饮等产业的进一步发展 ，有效带动了当地农民增收致富 。万寿菊通过种子繁殖 ， 商业化的万寿菊种子主北 京万寿菊灰霉病病原菌分离鉴定陈 东亮1， 李 明远1， 程 曦1， 李 雪梅1， 王 玲玲1，2， 黄 丛林1（1. 北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心 /北京市功能花卉工程技术研究中心 /农业基因资源与生物技术北京市重点实验室 ，北 京 100097； 2. 西 藏农牧学院 ，西藏 林芝 860000）摘 要 ： 对北京四海色素万寿菊制种温室发生的疑似灰霉病调查发现 ，万寿菊植株发生叶片水渍状枯斑 、萎蔫等 ，严重的甚至整株枯萎死亡 ，造成了重大损失 。 为明确其病原 ，对病原菌进行了分离 、培养和快速致病性测定 ，并对分离的菌株进行 DNA提取和基因序 列分析 。 结合生物学特征和基于基因序列的分子进化树分析 ，鉴定该病原菌为灰葡萄孢 （Botrytis cinerea）。关键词 ： 万寿菊 ； 灰霉病 ； 灰葡萄孢 ； 鉴定中图分类号 ：S435.672； S432.44 文 献标识码 ：A 文 章编号 ：1672-6820（2018）04-0011-06收 稿日期 ：2017-10-24； 修 回日期 ：2018-01-15基 金项目 ：北京市农林科学院创新基金 （JNKST201610、KJCX20170108）；北京市科技计划课题 （Z161100001116091）；北京市功能花卉工程技术研究中心创新平台项目作者简介 ：陈东亮 ，博士 ，助理研究员 ，研究方向为植物分子生物学 。 E-mail：dlchen1984126.com*通 讯作者 ：黄丛林 ，博士 ，研究员 ，研究方向为花卉新品种培育与栽培技术研究 。 E-mail：conglinh126.com。Pathogen isolation and identification of grey mold on marigold in BeijingChen Dongliang1, Li Mingyuan1, Cheng Xi1, Li Xuemei1, Wang Lingling1,2, Huang Conglin1（1. Beijing Agricultural Technology Research Centre, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science / BeijingFunction Flowers Engineering Technology Research Center/ Beijing Key Laboratory of Agricultural Gene Resource andBiological Technology, Beijing 100097, China; 2. Tibet College of Agricultural and Animal Husbandry, Linzhi Tibet860000, China）Abstract: Suspected grey mold disease was investigated in Sihaisesu greenhouse of marigold seed production bases inBeijing, where symptoms of hygrophanous spot and wilts on marigold and even dead plant with heavy loss were found. Thepathogen was isolated and cultured， DNA extraction of the isolated strains were conducted, and the sequences of g3pdh、hsp60 and rbp2 were analyzed. Based on biological characteristics and molecular evolutionary tree of particular genes, thepathogen was identified as Botrytis cinerea.Key words: marigold; grey mold; Botrytis cinerea; identification11· ·2018 年 第 4 期CHINA PLANT PROTECTION 2018,Vol38No4拉 丁名 菌株号GenBank 登 陆号rbp2 hsp60 g3pdhB. aclada PRI006 AJ745665 AJ716051 AJ704993B. allii MUCL403 AJ745666 AJ716055 AJ704996B. byssoidea MUCL94 AJ745670 AJ716059 AJ704998B. calthae CBS175.63 AJ745671 AJ716060 AJ704999B. caroliniana CB15 JF811590 JF811587 JF811584B. convoluta 9801 AJ745679 AJ716068 AJ705007B. cinerea SAS56 AJ745677 AJ716067 AJ705006B. croci MUCL436 AJ745681 AJ716070 AJ705009B. deweyae CBS134649 HG799518 HG799519 HG799521B. elliptica BE9714 AJ745684 AJ716073 AJ705012B. fabae CBS109.57 AJ745685 AJ716074 AJ705013B. fabiopsis BroadbeanBC-2 EU514473 EU514482 EU519211B. ficariarum CBS176.63 AJ745687 AJ716076 AJ705015B. galanthina MUCL435 AJ745689 AJ716079 AJ705018B. gladiolorum 9701 AJ745691 AJ716080 AJ705019B. globosa MUCL444 AJ745693 AJ716083 AJ705022B. hyacinthi 0001 AJ745695 AJ716084 AJ705023B. narcissicola MUCL18857 AJ745698 AJ716086 AJ705025B. paeoniae MUCL16084 AJ745700 AJ716089 AJ705028B. pelargonii CBS497.50 AJ745662 AJ716046 AJ704990B. polyblastis MUCL21492 AJ745703 AJ716092 AJ705031B. porri MUCL3234 AJ745704 AJ716093 AJ705032B. pseudocinerea 10091 NJ692428 JN692400 JN692414B. ranunculi CBS178.63 AJ745706 AJ716095 AJ705034B. sphaerosperma MUCL21481 AJ745708 AJ716096 AJ705035B. squamosa PRI026 AJ745707 AJ716100 AJ705039B. tulipae BT9830 AJ745713 AJ716102 AJ705041B. sinoallii OnionBC-23 EU514479 EU514488 EU519217B. sinoviticola GBC-3-3c JN692424 JN692396 JN692410表 1 进化树构建用到的葡萄孢属 （Botrytis sp.）菌 株及序列要通过杂交的方式获得 。为 了获得高产 、质量稳定的种子 ，杂交亲本需要在设施条件下栽培 ，以减小不良自然条件对种子产量和质量的影响 。然而 ，设施条件下的小气候环境也为病害的发生创造了条件 。 2017年 7 月 初 ，在北京延庆四海镇万寿菊制种温室内 ，制种亲本圃发生严重病害 ，植株普遍出现整枝 、整株的萎蔫 ，严重的枯萎死亡 ，造成了重大损失 。 为明确病原 ，对其病原菌进行了分离 、培养 ，并结合形态特征和分子检测手段对病原菌进行了鉴定 ， 为进一步制定科学合理的防治措施奠定了基础 。1 材 料与方法1.1 病原菌的分离与培养于北京延庆区四海镇万寿菊发病温室内 ， 采 集万寿菊发病植株枝条 ， 装入干净的保鲜袋中带回实验室 ，于 4 冷藏箱中保存备用 。 将 其叶片去除 ，用自来水刷洗枝条表面 ，并将其剪成 35 cm 的 茎段 。依次用 70%乙 醇浸泡 3 min，1%次 氯酸钠浸泡 3min 对茎段表面消毒 ，最 后无菌水冲洗干净后 ，在超净台中剥去枝条外皮层 ， 内部组织切成 0.20.3 cm12· ·2018 年 第 4 期CHINA PLANT PROTECTION 2018,Vol38No4小 块 ，分别放置到 6 cm PDA 培养基平板中心 ，于 25进 行恒温培养 。 待菌丝生长至满培养皿时 ，转入 L/D=12 h/12 h 光暗交替培养箱进行孢子诱发 。 诱 发的孢子用无菌水冲洗下来 ， 取少量涂布于新的 PDA 培养 基中 ，在超净台无菌环境于显微镜下挑取单孢子 。单孢子于 PDA 培 养基继续培养出菌丝及孢子后 ，在显微镜下观察孢子梗 、孢子等形态特征 ，并拍照 。1.2 万寿菊培养与快速致病性检测将 万寿菊种子撒播于草炭 蛭 石 （11）基 质中 ，覆盖透明塑料布保湿 ，置于植物培养箱中 ，25 下 于 L/D=16 h/8 h 光 暗交替培养 ，待种子发芽后去掉塑料布 。 种子苗长至 35 片 真叶时 ，移栽入 10 cm 穴 盘中 ，于温室中进行正常培养 。待植株生长至 15 cm 左 右高时 ，采取羽状复叶进行分离物致病性的快速检测 。离体叶片快速检测的步骤 ：9 cm 培 养皿铺 3 层 灭菌滤纸 ，喷洒无菌水至滤纸湿透 ；剪取新鲜万寿菊叶片 ，除去顶部小叶至刚好能放入培养皿中 ；取少量带有 （病菌 ）菌丝的培养基块 ，放置于叶片叶柄基部 ，盖上培养皿保湿 ，在25 恒温培养箱培养。 以湿润的无菌棉球 替换菌块做阴性对照 ，每个处理设置 3 个 生物学重复 。1.3 DNA 提取与基因测序冻融法快速提取 单孢系菌丝 DNA：无 菌枪头挑取少量新鲜菌丝 ，置于预装有 100 L 无 菌水的 1.5mL 离 心管中 ， 涡旋振荡使菌丝松散 ； 沸水浴 510min， 迅 速置于液氮中冷冻 35 min； 室 温解冻 ，12 000 r/min 离 心 5 min，上 清液即 DNA 溶 液 ，可直接做 PCR 扩 增的模板 ， 用于扩增 g3pdh、hsp60 及rbp2 基因片段的引物序列7。 20 L 的 PCR 反 应体系 ：Vazyme2×mix 10 L （南 京诺唯赞生物科技有限公司 ），上下游引物各 0.5 L（10 mol/L），模板 9L。PCR 产 物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 ，预 期条带经纯化回收后连接于克隆载体 pGEM T-easy（Promega，USA），并转化大肠杆菌 DH5，阳 性克隆送生工生物 （上海 ）股份有限公司测序 。1.4 序列分析与进化树构建测 序结果利用 DNA Star 5.01 软件进行拼接和初 步处理 。 3 个 基因序列按 g3pdh、hsp60、rbp2 的 顺序依次拼接成一个聚合序列 ， 两端及不同序列间加保护性碱基区分 。 Clusxtal 1.83 软件进行序列的比对 分析 ，采用 MEGA 4.0 软件中的邻接法 （Neighbor-Joining，NJ）法 构建不同株系基于 3 基因的系统进化树 ，靴 带值 （Bootstrap value）设 置为 1 000。 参 与进化树构建的其他葡萄孢属菌株的 G3DPH、HSP60 及RBP2 基因序列均下载自美 国国立生物技术信息中心 （National Center for Biotechnology Information，NCBI）数 据库 ，各序列 GenBank 收 录号 、菌株号 、拉丁名等信息见表 1。2 结 果与分析2.1 万寿菊灰霉病病害特征北京延庆区万寿菊杂交制种温室发生的万寿菊灰霉病在感染初期 ， 其症状主要表现为部分叶 片顶部黄化并出现水渍状枯斑 （图 1a）， 随着病情的发展 ，整个叶片萎蔫 ，逐渐在茎秆上近叶柄基础处可见黑色条斑 （图 1b）， 进一步发展为整个枝条的萎蔫（图 1c），最终整个枝条甚至整株枯萎死亡 （图 1d）。病害在多个制种温室普遍发生， 初步统计 ，8 月 下旬 ，伴有整枝或整株枯死的植株在 25%左 右 。 此时为杂交制种的关键期 ， 病害发生对种子产量和品质造成了较大影响 。2.2 病原菌的分离与致病性检测从带病的万寿菊枝条分离得到 3 个 分离物 。 其分离物进一步通过挑单孢子 ，得到 6 个 单孢系 。获得的单孢系采用离体叶片侵染的方法进行检测 ， 在接种后的 34 d 内 均可见明显水渍状枯死斑 ， 并由靠近叶柄的小叶逐渐发展至整个叶片 。 这种水渍状枯死斑与田间发现的叶尖部枯死斑类似（ 图 2），而对照未发现类似枯死斑 （图 2CK），表明本研究分离获得的即为田间病害的病原菌 。2.3 病原菌形态特征分 离自万寿菊的病原菌接种于 6 cm PDA 平 板培养基 ，于生化培养箱中 25 恒 温培养 2 d，白 色雾状菌丝可覆盖 1/2 平 板 ， 继续培养 12 d 可 覆盖整个培养皿 （图 3a）。 菌丝移至光暗交替环境中继续培养 57 d，长 出分生孢子 （图 3b）。分生孢子为近无色 ， 呈倒卵型 ， 单孢 ， 大小为 （11.1619.73）m×（6.998.55） m。 孢 子梗为多枝簇生 ， 直立或稍弯曲 ，长为 34 mm（图 3c）。 长满菌丝的培养皿继续培养 ，会生长出黑色菌核 （图 3d），菌核大小不一 。 基于以上特征 ，推测为葡萄孢属灰葡萄孢 （B.cinerea）或13· ·2018 年 第 4 期CHINA PLANT PROTECTION 2018,Vol38No4a. 叶片水渍状枯死 b. 茎 秆黑色条斑 c. 枝 条萎蔫 d. 整 株枯死图 1 北京延庆地区万寿菊灰霉病发病特征ac. 菌 丝侵染 CK. 阴 性对照图 2 分离自北京万寿菊上的灰霉病分离物离体侵染实验其 近源种 B.pelargonii。 其据孢子形态上极难分辨 ，需进行进一步分子鉴定 。2.4 分 子鉴定选取最具代表性的单孢系 ， 利用文献报道的通用引物 ，对其 g3pdh、hsp60、rbp2 等 3 个 基因片段进行了克隆和测序 。 获得的序列在 GenBank 进 行了登录 ， 登 录 号 分 别 为 MF174048、MF174047 和 MF-174046。基 于 3 个基因片段聚合序列 ，构 建了葡萄孢14· ·2018 年 第 4 期CHINA PLANT PROTECTION 2018,Vol38No4a. 菌 丝 b. 分 生孢子 c. 分 生孢子梗 d. 菌 核图 3 分离自北京万寿菊上的灰霉病分离物形态特征属 29 个种与本研究分离物的系统进化树 。从 进化树中清晰看出 ， 本研究中分离的万寿菊灰霉病病原菌与 B. cinerea 关 系最近 ，进一步表明 ，本研究在延庆温室万寿菊上发现的灰霉病病原菌为灰葡萄孢 ，这与孢子形态观察的结果一致 。3 结 论与讨论灰霉病为植物常见病害 ，在万寿菊大田栽培中也时 有发生 ，一般发病于夏末秋初天气冷凉 ，多雨高湿时期 。 田间万寿菊灰霉病主要表现为枝叶萎蔫 ，严重时整枝 、整株都会枯萎死亡 。在湿度较大时 ，枯死枝条和花朵上可见灰色的孢子层 ，而孢子层也往往作为鉴别灰霉病重要表观特征 。 本次发现的病害发生于延庆四海万寿菊制种温室内 ，病害特征与田间类似 ，但较田间发病期稍早 ，且未见明显灰霉层特征 ，这可能与发病时期以及温室内的特殊小气候环境有关 。在延庆四海镇万寿菊种植区 ， 灰霉病暴发时多伴有万寿菊黑斑病的发生 ， 由于病晚期枝条黑褐色枯死等症状与黑斑病后期症状类似 ， 容易忽视而误诊为黑斑病 ，导致防治方法不对 ，防治效果不明显 。研究表明 ，在其他农作物中 ，灰霉病病原菌主要通过伤口或枯死组织8或残留花瓣和柱头等9侵 入植物 ，逐渐发展至全株 。 而万寿菊黑斑病造成的枯死斑也为灰霉病侵入和发展创造了便利条件 。准确鉴定病原菌是制定有效防治策略的前提条件 。引起植物灰霉病的病原菌种类较多 ，均属核盘菌葡萄孢属 。菌丝 、孢子等形态特征是鉴别真菌类型最主要的依据 ，但有些相近菌种形态特征较为相似 ，难以仅依靠形态特征区分 。 使用分子检测技术可以从基因层面检测菌种甚至菌系间的微小差异 ， 相对形态鉴定更为准确 、快速 。为鉴定四海万寿菊制种圃灰霉病病原 ，本团队对病原菌进行了分离 ，并通过离体叶片进行了侵染性检测等 ， 最终确定了病原并基本确定其为核盘菌科葡萄孢属 。 进一步通过分子检测方 法 ， 确诊病原为葡萄孢属的灰葡萄孢菌 （B.cineaea）。 灰葡萄孢是一种常见的植物致病病原菌 ，也是葡萄孢属中已知的寄主范围最广的种 ， 可以侵染 200 种 以上植物10，造成病原菌清除困难 ，防 治效果不理想 。在 2012 年 评选的 10 大 病害真菌中 ，灰葡萄孢排于第 2 位11，可见其危害之大 。本 研究基于其形态和分子特征 ， 对普遍发生于万寿菊制种温室内的灰霉病病原菌进行了鉴定 ， 为针对性制定科学合15· ·2018 年 第 4 期CHINA PLANT PROTECTION 2018,Vol38No4B. byssoideaB. narcissicolaB. draytoniiB. polyblastisB. globosaB. sphaerosperma629967999999979999999981B. tulipaeB. crociB. hyacinthiB. galanthinaB. carolinianaB. fabiopsisbotrytis from tagetica5420759299995599997997839399Botrytis sinoalliiB. ranunculiB. ficariarumB. deweyaeB. ellipticaB. squamosaB. convolutaB. acladaB. alliiB. porriB. paeoniaeB. sinoviticolaB. calthaeB. pseudocinereaB. fabaeB. pelargoniiB. cinerea0.005图 4 基于三基因整合序列的 Botrytis 属真菌系统发育树理预防措施奠定了基础 。参 考文献1 蒲 丽 ，康占海 ，蒋家珍 ，等 . 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