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东方百合‘演员’DXS基因的克隆与表达分析_张浩宇.pdf

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东方百合‘演员’DXS基因的克隆与表达分析_张浩宇.pdf

p西北 植 物学报 ,2018,38(4)0637-0643Acta Bot.Boreal.-Occident.Sin.文章编 号 1000-4025(2018)04-0637-07 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; doi10.7606/j.issn.1000-4025.2018.04.0637收稿 日 期 2018-01-14;修改稿收到日期 2018-03-21基金 项 目 山西省应用基础研究项目 (201601D011077);山西农业大学引进人才科研启动项目 (2014ZZ02);山西省研究生教育改 革研究课题 (2017JG37)作者简 介 张浩宇 (1994-),女 ,在读硕士研究生 ,主要从事百合花香研究 。E-mail1959932780@qq.com*通信作 者 杜方 ,博士 ,教授 ,主要从事花卉种质资源创新与育种研究 。E-maildf730227@yeah.net东方 百 合‘演员’DXS基因的克隆与表达分析张浩 宇 ,樊 俊苗 ,王婷 ,杜方*(山西 农 业大学 园艺学院 ,山西太谷030801)摘要 以东 方 百合 ‘演员 ’花瓣为试验材料 ,采用 RACE技术 ,克隆 得到百合 1-脱氧 木 酮糖-5-磷酸合成酶基因DXS的 cDNA全长,命名 为LeDXS(GenBank登录号 为 MF576067)。序列分 析表明 ,LeDXS基 因 cDNA序列全长 2471bp,其中开放阅读框包含2 142bp,编码713个氨基 酸,相对分子量大小约为76.3kD,等电点 为6.65,化学式为 C3370H5374N942O1016S32。系统进化分析结果显示 ,LeDXS与猕猴桃和万寿菊 DXS聚为一 类,属于Ⅰ型 DXS,是功能较保守的一类 。实 时荧光定量 PCR结 果分 析表明 ,LeDXS基因在不同品种百合花瓣中均有表达 ,且浓 香 型百合 DXS基因表达量比淡香型和无香型百合高 。该研究结果为百合 DXS生物学功能研究奠定了基础 ,同时 也 为百合花香育种提供了理论依据 。关键词 百合 ;1-脱氧木 酮糖-5-磷酸合 成酶 ;qRT-PCR;表 达特 征中图分类号 Q785;Q786 文献标 志码 ACloning and Expression Characteristics of DXS GenefromLiliumOriental Hybrid‘Entertainer’ZHANG Haoyu,FAN Junmiao,WANG Ting,DU Fang*(Colege of Horticulture,Shanxi Agricultural University,Taigu,Shanxi 030801,China)AbstractThe ful-length cDNA sequence of the 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase(DXS)genefrom the petals of Lilium Oriental hybrid‘Entertainer’was cloned usingRACE methods,named asLeDXS(GenBank accession number MF576067).The ful length of LeDXScDNA is 2 471bpand it con-tains an open readingframe of 2 142bp,encodingaputative protein of 713amino acids.The predicted pro-tein molecular weight and theoretical isoelectric point of LeDXS are 76.3kD and 6.65,respectively.Theformula of LeDXS is C3370H5374N942O1016S32.Phylogenetic analysis indicates that LeDXS,clustered with DXSof kiwi fruit and marigold proteins,belongs to the plant DXSⅠcluster and is a functionalyconserved pro-tein.LeDXSgene was expressed in the petals of al cultivars based on qRT-PCR analysis.LeDXShad ahigher expression level in strong-scented lilies compared to weak-scented and non-scented lilies.The re-sults wil benefit our biologicalyfunctional understandingof LeDXS,and further research of floral fra-grance breeding of lilies.Keywordslily;1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase(DXS);qRT-PCR;expression characteristics萜类物 质广泛存在于自然界生物体内 ,大约有55 000种 ,构成了 最大的天然产物家族[1]。在高等植 物中 ,有些萜类物质参与生理代谢活动 ,如光合作用 、呼吸作用和细胞周期控制等[2],有些萜 类化合物如丹参中的丹参酮类具有药理活性[3],有些萜 类化合物为食品工业和化妆品工业的重要原料[4],同时低分子 量的萜类也是百合花香成分中的重要物质[5]。萜类物 质合成途径有位于质体的2-C-甲基-D-赤 藻 糖 醇-4-磷 酸 (2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate,MEP)和位于 胞质的甲羟戊酸 (meval-onate,MVA)两条途 径[6]。1-脱氧木 酮糖-5-磷酸合成 酶 (1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase,DXS)是MEP途径中 的关键酶[7-8],并且已 有研究表明其在拟南芥中发挥着限速酶作用[9],是萜类 次生代谢物质等下游产物的一个关键调控位点 。百合作为主要的切花和盆花材料 ,在国内外花卉市场占有重要地位[10]。百合不 仅具有艳丽的色彩 ,还有丰富的香型 ,有墨香 、浓香 、甜香 、淡香以及无香[11]。近年来 ,百合花香是学者研 究的一大热点 。从揭 示 花 香 成 分[12-13]、释 放 器 官[14]、散 发 规律[15-16]到代谢 通路的挖掘[17]以及相 关基因 、调控基因的克隆[18]和原核 生物表达验证[19],都取得 了突破性的进展 。通常亚洲百合无香味 ,而东方百合香味浓烈 ,严重影响消费者的购买欲 。因此 ,改良花香是育种家孜孜以求的育种目标 。已有研究表明 ,与有香百合相比 ,无香百合中单萜类化合物的释放量很低或根本检测不到[14]。因此 ,研究 百合单萜类花香物质的代谢通路及其关键基因对于揭示花香差异本质原因具有重要意义 。本研究采用RACE技术从东 方百合 ‘演员 ’(LiliumOriental hybrid‘Enter-tainer’)花瓣中 克隆得到DXS的cDNA全长 ,并对其 在不同香型百合品种间表达特征进行了研究 ,为今后通过基因工程改良百合花香提供了理论依据 。1 材料 和 方法1.1 材料试 验材 料 (表1)种植于山西农业大学园艺学院园艺站百合圃 。2017年5~7月陆续 取不同品种百合盛开期花瓣 ,经液氮速冻 ,-80℃保存 ,备用 。1.2 方法1.2.1 RNA提取与cDNA第一链 合成使 用TaKaRa公 司 裂 解 液 ,采 用Trizol法 提 取 百 合 总RNA。使 用生 物光度计检测RNA的 浓度 和纯度 ,用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量 ,按照Gen-Star试剂盒 说明反转录成cDNA。1.2.2 DXS基因的 克隆从NCBI核酸数 据库中查询获得1条百合cDNA序列信 息 ,GeneBank登录号为KR998332.1。分别设 计5′-RACE和3′-RACE引物 (表2),以 ‘演员 ’cDNA为模板 ,利 用TaKaRa表 2引物 序 列Table 2 Primer Sequences引 物 名 称Primer name引物序 列Primer sequence(5′→3′)5-GSPGATTACGCCAAGCTTAGATGCATGGC-CTCTTTCGGCCTC3-GSPGATTACGCCAAGCTTAGGTGGTGCAT-GACGTTGATCTCCUPMCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGT-GGTATCAACGCAGAGTActin-F nbsp;ATCTGCTGGAAGGTGCTGAGActin-F nbsp;CCAAGCAGCATGAAGATCAADXS-F nbsp;GCAGCTCAGATTGACGACAGDXS-R nbsp;ATCAGAAGCCTCCCCTTTCC表 1试验用材料基本信息Table 1 Plant materials编号 Number 品种名 Name 杂种系 Hybrid香型 AromatypeLO1 特 里昂 菲特 Triumphator 麝东百 合 Longiflorum Oriental Hybrids 甜香 Sweet-scentedT1 完美 Pink Perfection 喇叭百 合 Trumpet and Aurelian Hybrids 墨香 Ink-scentedO1 演员 Entertainer 东方百 合 Oriental Hybrids 浓香 Strong-scentedO2 八 点后 After eight 东方百 合 Oriental Hybrids 浓香 Strong-scentedO3 白梦 White Dream 东方百 合 Oriental Hybrids 浓香 Strong-scentedOT1 罗宾娜 Robina 东喇百 合 Oriental Trumpet Hybrids 浓香 Strong-scentedOT2 黄 色风 暴 Yeloween 东喇百 合 Oriental Trumpet Hybrids 浓香 Strong-scentedLA1 金石 Golden Stone 麝亚百 合 Longiflorum Asiatic Hybrids 淡香 Weak-scentedLA2 布林迪 西 Brindisi 麝亚百 合 Longiflorum Asiatic Hybrids 淡香 Weak-scentedLA3 佩 维亚 Pavia 麝亚百 合 Longiflorum Asiatic Hybrids 淡香 Weak-scentedN1 朱丽叶 Julius 新铁炮 百合 L.formolongi 淡香 Weak-scentedA1 罗马广 场 Navona 亚洲百 合 Asiatic Hybrids 无香 Non-scentedA2 小 珍珠 Tiny pearl 亚洲百 合 Asiatic Hybrids 无香 Non-scented836西北植物学报38卷公司RACE试剂盒 进行PCR扩 增 。PCR反应总 体系为50μL,其中cDNA 2.5μL,10UPM引物5μL,5′(3′)GSP引物1μL,ddH2O 15.5μL,2Se-qAmpTMBuffer 25μL,SeqAmpDNA Polymerase1μL。PCR扩增条 件为 94℃30s,72℃3min,5个循环 ;94℃30s,70℃30s,72℃3min,5个循环 ,94℃30s,65℃30s,72℃3min,25个循环 。1%琼脂糖凝胶电泳检测 ,切胶回收目的片段 ,加A反应按照天根加A试剂的方法标准操作 。加A后 ,连接 载 体pMD-19T(TaKaRa),转 化Escherichiacoli DH5α感 受态 细胞 (全式金 ),菌液PCR验 证后送 生工生物工程 (上海 )股份有限公司测序 。利用DNAMAN软件拼 接测序结果 ,得到编码序列 。1.2.3 生物信 息学分析利用ProtParam(ht-tp//web.expasy.org/protparam/)预 测LeDXS分子 量 和 理 论 等 电 点[20]。用SMART在 线 软 件(http//smart.embl-heidelberg.de/)预测LeDXS蛋白结 构域[21]。通过SignalP4.1(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线软 件进行信号肽预测[22]。用在线 软件ExPASy(http//web.ex-pasy.org/protparam/)分 析 蛋 白 质 亲 水 性 /疏 水性 ;用TMHMM Server V2.0(http//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在线软 件对LeDXS进 行 跨 膜 性 分 析[23]。用PRABI(https//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred sopma.pl)预测蛋 白质二级结构[24]。用DNAMAN Version 9软件进 行序列比对及翻译 ,用MEGA6.0软件构 建系统进化树[25]。1.2.4 实时荧 光定量PCR分 析根据 已克隆的百合LeDXS的cDNA序列分 析结果 ,设计荧光定量引物 ,Blast比对确 定引物特异性 。分别以不同品种盛开期花瓣的cDNA为模板 ,以Actin基因作 为内参基因 ,反应引物DXS-F、DXS-R、Actin-F、Actin-R见表2。参照 杜方等[26]的步骤 进行荧光定量PCR,研 究不 同品种百合LeDXS基因表 达差异 ,每个试验进行3次重复 。所得数据采用Excel进行平 均数统计 ,2-ΔΔCT法[27]计算相 对表达量 ,以SPSS V20软件进行 方差分析 ,LSD多 重比 较 ,利用Excel 2010绘图 。2 结 果 与 分析2.1 LeDXS基因全 长cDNA的克隆通 过RACE法 ,以东方 百合 ‘演员 ’花瓣cDNA为模板 ,分 别进行5′和3′-RACE扩增 、TA克隆和测 序分析 ,获得5′末端序列长度2 254bp,获得3′末端序列 长度1 004bp(图1),与预期 结果一致 。命名该基因为LeDXS,GenBank登录号 为MF576067。该基因 全长2 471bp,其中包 含5′-UTR 50bp,3′-UTR 279bp和开放 阅读框2 142bp,编码713个氨基酸 。通 过DNAMAN软件翻 译获得LeDXS基因编码的氨基酸序列 (图2)。2.2 DXS蛋白结 构分析SMART预测氨 基酸序列中含有3个功能结构域 ,分别是N端DXP合 成结 构域 、TPP结 合结 构域和转酮醇酶结构域 (图2)。ProtParam分析该 蛋白相对分子量为76.3kD,理论等 电点为6.65,化学式为C3370H5374N942O1016S32,原子量10734。信号肽 结果分 析 表 明 ,LeDXS不 属 于 分 泌 蛋 白 。LeDXSGRAVY(Grand average of hydropathicity)值为负值 ,表 明蛋白属于亲水性蛋白 。蛋白跨膜性分析显示无跨膜区域 ,不属于膜蛋白 。二级结构预测显示 ,其氨基酸组成α-螺旋 (Hh)为267个 (37.45%),延伸链 (Ee)为139个 (19.50%),β-转角 (Tt)为81个(11.36%),无规则 卷曲为226个 (31.70%)。2.3 多序列比对与聚类分 析百合 ‘演员 ’中克隆的DXS基因分 别与已分离获得的LhDXS基因[13]、Unique8314[28]序列一 致性都高达99%(图3),与无油 樟 (Amborella trichopo-da)、蔓花生 (Arachis duranensis)、黄芪 (Astraga-lus membranaceus)的 一 致 性 分 别 达74%、74%、73%。用MEGA7软件对10种可以产生萜类化合物的植物进行DXS聚 类分 析 ,结果表明所获得的百合DXS基因属于第一类基因 ,是 较为保守的管家基因 (图4)。2.4 百 合DXS基因在品种间的表达 模式采用qRT-PCR方 法检 测LeDXS在13个百合品 种的表达情况 。由图5可知 ,LeDXS在不同 品种中均有表达 ,在浓香型东方百合 ‘白梦 ’中表达量最高 ,在无香的亚洲百合 ‘小珍珠 ’中最低 ;浓香型百合图 1DXS基因 片 段 RACE电泳图Fig.1 Electrophoresis pattern of RACE fragments of DXS9364期张浩宇 ,等 东 方百合 ‘演员 ’DXS基因的克隆与表达分析ATG为 起始 密码子;TAG为 终止 密码子;粉色 、蓝色和绿色箭头分别表示 N端 DXP合 成结 构域 (DXP_synthase_N)、TPP结合结构 域 (Transket_pyr)和转酮醇酶结构域 (Transketolase_C)在氨基酸序列中的起止位置图 2百 合 LeDXS基因的核酸序列及推导的氨基酸序列The ATG in the red box is the start codon;the TAG in the box isthe stop codon;the pink,blue and green arrows indicate thestarting and ending positions of the N-terminal DXPsynthesis domain,the TPP binding domain and thetransketolase domain in the amino acid sequence,respectivelyFig.2 The nucleotide(above)and deduced aminoacid sequences(below)of LeDXS表达量 与淡香型和无香型之间差异显著 ,但淡香型和无香型百合基因表达差异不显著 ;同一香型百合之间基因表达差异也不尽相同 ,浓香型百合之间存在显著差异 。LeDXS在百合不同品种间的 表达量表明 ,不同品种百合花香的差异与LeDXS基因表达 有关 。3 讨论萜类物 质在植物生长调节 、信号转导和自身防御等方面发挥重要作用[29]。张辉秀 等[13]研究表 明浓香型百合萜烯类释放量最高 ,在淡香类中没有检测到 ,并且认为其中两种单萜成分是百合花致香的关键成分 。DXS基因是 萜类物质合成MEP途 径的第 一个关键酶基因 ,萜类含量与DXS的表达 水平密切相关[30],目前已 在178种植物中分离和克隆[31]。DXS基因过 表达或干扰表达均能够改变次生代 谢 物 质 合 成 ,在 拟 南 芥 (Arabidopsis thali-ana)[32]、胡 萝 卜 (Daucus carota)[33]、宽 叶 薰 衣 草(Lavandula latifolia)[34]和 猕 猴 桃 (Actinidiachinensis)[35]等植物 中都已进行了初步功能验证 。不同物种DXS基因家 族成员数不同 ,以前的研究认为DXS酶 由1~3个基 因编码 ,基于RNA-seq测序的研 究表明 ,胡萝卜[33]和烟草 (Nicotiana taba-cum)[36]有中分 别有5个和6个 ,对于百合DXS基因研究 甚少 ,目前 ,已知的百合DXS家族成 员至少有2个 ,前人只在 ‘Beladonna’中获得 部分cDNA序列[14],张腾旬 在东方百合 ‘西伯利亚 ’品种中也克隆得 到1个DXS基 因cDNA全 长 ,属 于Ⅱ型DXS[37],但序列 信息尚未公布 。本研究通过RACE技术 ,克隆 了百合DXS基因cDNA全长 ,并利 用生物信息学手段分析研究其编码的蛋白特性 ,该蛋白具有亲水性特点 ,不属于分泌蛋白 ,由此推测它只在质体中发挥功能 。通过对基因的表达规律研究 ,发现其表达量与器官 、花 、果实发育程度 、昼夜节律 、品种等有关 。研究表明CnDXS2在夜香 树 (Cestrum nocturnumL.)叶片中 的表达量总体高于花器官[38]。随着花 朵开放级数和果实成熟 ,玫瑰花瓣[39]和猕猴 桃果实[35]中DXS基因表达量逐级增加 。茉莉花 瓣中DXS基因的 表达具有昼夜节律性[40]。课题组 之前的研究表明 ,LhDXS在百合 ‘索 邦 ’花和鳞片中显著高表达 ,但只在 ‘朱丽叶 ’花中显著高表达[26]。本研究发 现 ,LeDXS基因的表达水平与花香的 释放呈现一定的规律 ,浓香型百合基因表达量显著高于淡香型046西北植物学报38卷红 色 部 分为 3个序列不完全一致位点 ;黑色方框中 ATG为 起始 密码子 ,方框中 TAG为 终止 密码子图 3百合 DXS基因多序列比对The red parts indicate some differences exist in the 3sequences;the ATG in the blackbox is the start codon,the TAG in the black box is the stop codonFig.3 Multiple sequence alignment of DXSfrom lilies图 4LeDXS与其他 植物 DXS蛋白的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree analysis of LeDXS andDXS of other plants和无香 型百合 。Johnson的研究 结果表明 ,浓香型百合 ‘Conca'd Or’比淡香 型 ‘Santander’DXS基因表达 量高[14],与本研 究结果一致 。本试验主要从百合中分离获得一个DXS基因品种 名 称同表 1;不同小写字母代表不同品种的差异显著性 (P<0.05)图 5DXS在不同品种百合的相对表达量The names of cultivars are the same as Table 1;Different normalletters show significant differences among different cultivars(P<0.05)Fig.5 Expression analysis of DXSin different cultivars1464期张浩宇 ,等 东 方百合 ‘演员 ’DXS基因的克隆与表达分析cDNA全长 ,对其 进行了初步研究 ,发现LeDXS属于DXSⅠ,是 功能 较为保守的一类 ,分析了该基因在不同品种中的表达模式 ,推测LeDXS在百合 花香萜类化合物合成途径中起重要作用 ,后期需进一步对百合DXS基因家 族成员数目 、分类和功能以及在百合花香代谢调控中的作用机制进行研究 ,对于明确花香差异的本质原因 ,以及利用现代生物育种技术改良百合花香具有一定的意义 。参考文献 [1]AJIKUMAR P K,TYO K,CARLSEN S,et al.Terpenoidsopportunities for biosynthesis of natural product drugs usingengineered microorganisms[J].Molecular Pharmaceutics,2008,5(2)167-190.[2]赵恒伟 ,葛锋 ,孙颖 ,等 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