番茄褪绿病毒在湖南省首次发生_王雪忠.pdf

番茄褪绿病毒在湖南省首次发生王雪忠1，2张战泓3郑立敏2唐 鑫2史晓斌2刘 勇1，2 *（1湖南大学研究生院隆平分院，湖南长沙 410125；2湖南省植物保护研究所，湖南长沙 410125； 3湖南省蔬菜研究所，湖南长沙 410125）摘 要2016 年 7 月在湖南省蔬菜病害调查中发现，4 种茄科蔬菜表现出叶脉间褪绿、叶片黄化等症状，疑似被番茄褪绿病毒（ Tomato chlorosis virus，ToCV）感染，同时叶片背面聚集了大量烟粉虱。采用 ToCV 热激蛋白（heat shockprotein70，HSP70）序列的特异性引物对采集的番茄、茄子、辣椒、马铃薯样品和烟粉虱样品进行 RT-PCR 检测，均扩增出目标条带，且扩增序列与北京番茄 ToCV 分离物（KC887999.1）部分序列相似度为 99.0，确认采集样品被 ToCV 感染。4 种茄科蔬菜ToCV 的感染率达 70～100；发病叶片上烟粉虱的带毒率为 66.7～87.5；鉴定出烟粉虱的生物类型为 MED 烟粉虱。这是湖南省首次确认该病毒，需要引起关注和加强防范。关键词番茄褪绿病毒；茄科蔬菜；烟粉虱等 6 个 科 植 物（Wintermantel Wisler，2006；Landeo-Ros etal.，2015），其 中对番茄造成的产量损失最为显著。ToCV 只能通过韧皮部侵染的方式侵染植物，由媒介昆虫以半持久的方式传播，其媒介昆虫包括烟粉虱（ Bemisia tabaci）、温室白粉虱（ Trialeurodes vaporariorum）、银叶粉虱（ B. argentifolii）和纹翅粉虱（ T. abutilonea），其中以烟粉虱的传播能力最为高效（Wintermantel Wisler，2006）。目前国内外暂未获得ToCV的抗性番茄品种（Orfanidou etal.，2016） ，又因媒介昆虫反复发生，杂草清理具有难度，导致 ToCV 防治存在困难。2016 年 7 月对湖南省蔬菜研究所基地进行病害调查发现，番茄、茄子、辣椒和马铃薯的叶片出现褪绿黄化、叶脉仍然保持绿色等疑似 ToCV 感染的症状，同时在病叶上发现了大量的烟粉虱。故分别采集症状明显的番茄、茄子、辣椒和马铃薯叶片样品，利用 ToCV 特异性引物进行分子鉴定，并检测发病植株上烟粉虱携带 ToCV 的带毒率以及烟粉虱的生物类型。1 材料与方法1.1 样本采集在湖南省蔬菜研究所基地采集疑似感染 ToCV的番茄、茄子、辣椒和马铃薯植株叶片各 20 份，王雪忠，女，硕士研究生，专业方向植物病毒与昆虫互作，E-* 通讯作者（Corresponding author） 刘勇，研究员，博士生导师，专业方向蔬菜病毒病防治，E-收稿日期2018-05-09；接受日期2018-07-11基金项目 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目（31571981，31571982，31672003），湖南省科技计划项目（2016RS2019）番茄褪绿病毒（ Tomato chlorosis virus，ToCV）属于长线形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒属（ Crinivirus），于 1998 年在美国佛罗里达州首次发现（Wisler etal.，1998）。截 至目前，ToCV 已在我国台湾、北京、山东、天津、河北和河南等地发生流行，对各地番茄生产造成了严重影响（Tsai etal.，2004；Zhao etal.，2013；刘永 光 等，2014；周涛 等，2014；胡京 昂 等，2015；孙国 珍 等，2015）。ToCV 侵染的典型症状是植株下部叶片先观察到叶脉间黄化褪绿。发病初期叶片除叶脉仍保持绿色外，脉间变黄，叶片变厚；发病中期，整个叶片由边缘向内开始出现坏死斑；发病后期，整个植株死亡，果实受到严重影响（赵黎明，2015）。早期感染 ToCV 的番茄产量损失可达到 75，甚至绝产；中后期感染 ToCV 仍会对番茄造成 10～40的产量损失（刘永光 等，2 014）。该病毒的寄主主要有茄科（Solanaceae）和夹竹桃科（Apocynaceae） 27新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES2018（8）27 -31以健康番茄、茄子、辣椒和马铃薯叶片作为阴性对照；以实验室 ToCV 侵染性克隆接种的感病叶片作为阳性对照。采集基地内发病番茄、茄子、辣椒和马铃薯植株上的烟粉虱，每种植株采集约 100 头烟粉虱成虫。将样品置于液氮中速冻，-80 ℃保存备用。1.2 试验试剂TRIzol、氯 仿、无水乙醇、ddH2O、RNase-free H2O、限制性核酸内切酶（ AseI酶）、 树脂溶液（10 mgmL-1）。1.3 植物总 RNA 的提取样品总 RNA 的提取采用北京华越洋生物公司多酚多糖植物 RNA 提取试剂盒，步骤依照试剂盒说明书操作。1.4 烟粉虱总 RNA 的提取烟粉虱RNA的提取采用TRIzol 法并稍作修改。研磨棒充分研磨虫体后加入1 mLTRIzol振荡 15 s， 室 温 放 置 4 min； 加 入 200μL 氯 仿，漩 涡振荡 30 s，室温 放置 3 min；4  ℃下 12 000rmin-1离心 15 min；移取 上清液 500 μL 至新的 RNasefree离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20  ℃放置 30min；4  ℃下 12 000rmin-1离心10 min；弃上清液，用现配的75乙醇 洗涤沉淀，8 000rmin-1离心 3 min；重复洗 涤 1 次；弃上清液，8 000rmin-1离心 30 s，小心吸出上清液 ；室温晾干3 min，取30 μL RNase-freeH2O溶解，测定OD260/OD280值， 检测RNA的含量和纯度，-80 ℃保存备用。试验重 复3次。1.5 cDNA 的合成以提取的总 RNA为模板，反转录反应的体系步骤参照 Vazyme 生物公司 Hiscript Ⅱ 1stStrandcDNASynthesisKit 产品 说明书进行在 RNase free离心管 中分别加入 1 μL RNase-freeH2O，4 μL Radomhexamers，3 μL 总 RNA；65 ℃加热 5 min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置 2 min；向上一步混合液中加入 10 μL 2RT Mix，2 μL HiscriptⅡ EnzymeMix；混匀 后按照 25 ℃ 5min，50 ℃ 15min，85 ℃ 5min 合成 cDNA，-20 ℃保存备用。1.6 RT-PCR 和电泳检测ToCV 的 检测采用 ToCV 特异性引物 ToCV-3（表 1）进行 PCR 扩增。PCR 扩增体系为ddH2O7μL，2Taq MasterMix（Dye Plus）10 μL，ToCV-3R1μL（10 μmol L-1），ToCV-3F 1μL（10 μmolL-1），cDNA 模板 1 μL。PCR 程序 为95 ℃ 5min；95 ℃ 30s，56 ℃ 30s，72 ℃ 1min，35个循环；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR 产物经1 琼脂糖凝胶进行电泳检测，在凝胶成像系统上观察并记录结果，产物纯化回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析。表 1 引物信息引物名称 引物序列（5′-3′）ToCV-3 FAAACTGCCTGCATGAAAAGTCTCRGGTTTGGATTTTGGTACTACATTCAGTWT FCTTGGTAACTCTTCTGTAGATGTGTGTTRCCTTCCCGCAGAAGAAATTTTGTTC1.7 烟粉虱带毒率的检测从每种植株上采集的烟粉虱中随机选取 8 头，采用 ToCV 特异性引物 ToCV-3（表 1）进行 ToCV检测，每种植株 3 次重复，统计烟粉虱的带毒率。烟粉虱带毒率 携带 To CV 的烟粉虱数目 / 检测烟粉虱数目 1001.8 烟粉虱生物类型的鉴定烟粉虱总 DNA 的提取取 3 μL 蛋白酶 K 于封口膜上，将每只烟粉虱置于其中研磨成匀浆后移至 PCR 管中，加入 20 μL 10mgmL-1的树脂溶液混匀，然后置于 37 ℃孵育 1 h，96 ℃ 10min。PCR 扩 增 体 系 为 20 μL2Taq MasterMix10μL，上、下 游引物 WT（表 1）各 1 μL（10 μmolL-1），模板 1 μL，ddH2O7μL。PCR 程序95℃预变性 5 min；95 ℃ 15s，53 ℃ 45s，72 ℃ 1min，35 个循 环；72 ℃ 10min，PCR 产物 取 5 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。酶切体系加入 AseI0.5μL，3.1buffer 2μL，ddH2O7.5μL，与 10 μL 扩增 产物混匀后置于 37 ℃ 3～4 h，酶切后取 5 μL 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。从每种植株上采集的烟粉虱中随机选取 20 头进行检测，试验重复 3 次。2 结果与分析2.1 茄科蔬菜田间感染 ToCV 的症状与健康植株相比，田间番茄、茄子、辣椒、 28新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES马铃薯病株的叶片表现出底部叶片黄化，叶脉浓绿而脉间褪绿黄化，叶片变脆且易折。感病严重的植株整株褪绿黄化、果实不能正常膨大，颜色偏白；叶片脉间褪绿黄化，变厚、变脆且易折（图 1）。2.2 茄科蔬菜 ToCV 的发生率对4种茄科蔬菜上疑似感染ToCV的样品进行 RT-PCR 检测，扩增出条带大小为 449bp 的特异性条带，与目标条带一致（图 2）。对目标条带纯化回收测序后在 NCBI 上进行比对，结果显示与北京番茄 ToCV 分离物（KC887999.1）部分序列相似度达到99.0％，表明所扩增到的基因片段属于ToCV的基因序列，确认此次采集的样品被ToCV感染。检出率结果显示，番茄样品的 ToCV 感染率为 100，茄子、辣椒和马铃薯样品的感染率分别为 80、85和 70（图 2）。2.3 烟粉虱体内 ToCV 的带毒率检测收集病叶上的烟粉虱，并进行ToCV的RT-PCR 检测，PCR 扩增得到条带大小为 446bp 的特异性条带，与目标片段大小一致（图 3）。从采集的烟粉虱中，每种植株随机选取 8 头进行 ToCV 带毒率检测（表 2），番茄上烟粉虱 ToCV 的平均感染率最高，为 87.5，其次为茄子和马铃薯，辣椒上烟粉虱 ToCV 的平均感染率最低。图 1 4 种茄科作物感染 ToCV 的症状A，感病番茄；B，感病辣椒；C，感病马铃薯；D，感病茄子；E，健康番茄；F，健康辣椒；G，健康马铃薯；H，健康茄子。彩色图版见中国蔬菜网站veg.org。图 2 4 种茄科蔬菜 ToCV PCR 检测结果M，DNAmarker；1～20，样品；A，番茄；B，茄子；C，马铃薯；D，辣椒；CK，阴性对照；P，阳性对照。2.4 烟粉虱生物类型鉴定对 4 种茄科蔬菜上采集的烟粉虱进行生物种群鉴定，提取单头烟粉虱总 DNA 并进行 PCR 扩增，A B C DE F G H图 3 烟粉虱体内 ToCV PCR 检测结果 M，DNAmarker；1～2，番茄上烟粉虱样品；3～4，茄子上烟粉虱样品；5～6，辣椒上烟粉虱样品；7～9，马铃薯上烟粉虱样品；CK，阴性对照；P，阳性对照。100bpM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CK P5000bp3000bp2000bp1000bp750bp500bp250bpM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 CKP500bp500bp500bp500bpABCD29新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLES产物经 AseI 消化酶切电泳（图 4），结果显示该基地烟粉虱均为 MED 烟粉虱（Q 烟粉虱）。3 结论与讨论本试验采集了湖南省蔬菜研究所基地 4 种茄科蔬菜植株叶片，利用 RT-PCR 方法检测疑似发病植株叶片感染 ToCV 的情况，经序列分析比对，确认了 ToCV 已经侵染湖南省的茄科作物，证实该病毒已经在湖南省发生。近年来，ToCV 对我国以番茄为主的蔬菜产量和品质造成了重大损失，目前针对ToCV 的研究工作主要在其分布、田间诊断和优化检测技术、致病机理、病虫互作等方面展开。2004 年 Tsai 等（2004）在我国台湾首次发现ToCV，随后 Zhao 等（2013）报道了 ToCV 在北京的发生，刘永光等（2014）发现 ToCV 在山东暴发，目前 ToCV 已在天津（高利利 等，2015） 、河北（孙国珍  等，2015）、河 南（胡京昂  等，2015）、山西、 陕西、浙江、内蒙古（郑慧新 等，2016）、吉林、 辽宁（王翠琳 等，2017）、广 东（汤亚飞 等，2017）、海南（Tang etal.，2017） 、云南（刘微 等，2018）等地相继被发现。近年来国际贸易的频繁交流，工厂化苗木调运可能使感染 ToCV 的植株进入我国，加之烟粉虱在我国扩散流行，这些原因使得ToCV 在我国自沿海向内陆迅速蔓延。湖南省周边省市中目前只有广东省已经报道了 ToCV 的发生，由于湖南省蔬菜种植种类众多，苗木调运繁杂，这些原因都使得调查 ToCV 病毒最初来源的工作巨大且复杂，因此需要进一步分离纯化和鉴定分离物的病毒株系，对比确认其株系来源，从而精准地对ToCV 进行防控，同时应通过加强对烟粉虱的检疫检验，减少人为因素造成烟粉虱的传播。在我国 ToCV 主要依靠烟粉虱进行传播。2003年首次在云南省一品红（ Euphorbia pulcherrima）上发现 MED 烟粉虱以来（Chu etal.，2006），MED烟粉虱现已遍布全国。目前的研究显示 ，与其他烟粉虱相比，MED 烟粉虱具有分布广泛、扩散能力强、繁殖率高、抗药性强且广的特点。同时，在我国的大多数农业系统中，MED 烟粉虱已经快速取代 MEAM1 烟 粉 虱（Chu etal.，2010；Xi，2010；Xinetal.，2016）。已 有研究表明，MED 烟粉虱比MEAM1 烟粉虱传播 ToCV 的能力更强（Shi etal.，2017）。因此，应正确识别烟粉虱的生物类型，从而采取正确措施对烟粉虱进行防治，以达到治虫防病的目的。本试验中烟粉虱 ToCV 的带毒率较高，但由于本试验采集的样本数量较少，后期应扩大烟粉虱采集数量，加强对烟粉虱携带 ToCV 的监测。目前 ToCV 的防治仍以预防为主，可以通过选用无病虫害的幼苗、培育 ToCV 抗性新品种、田间设置防虫网、悬挂粘虫板、合理换茬，达到早预防、早控制的效果。目前 ToCV 的发生和流行情况日趋严重，本试验首次报道 ToCV 在湖南省的发生，表明 ToCV 有从沿海向内陆扩散的趋势，因此必须提高警惕防止 ToCV 的进一步蔓延，同时要加强对烟粉虱 -ToCV- 植物互作的研究，为 ToCV 的防治和治理奠定理论基础。参考文献高利利，孙国珍，王勇，高苇，张春祥，张安胜，竺晓平．2015．天津地区番茄褪绿病毒的分子检测和鉴定．华北农学报，30（3）211-215．胡京昂，万秀娟，李自娟，黄文，李武高，应芳卿．2015．河南番茄褪绿病毒的分子鉴定．中国蔬菜，（12）25-28．刘微，史晓斌，唐鑫，张宇，张德咏，周序国，刘勇．2018．云南番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒复合侵染的分子鉴定． 园艺学报，45（3）552-560．刘永 光，魏家鹏，乔宁，李美芹，刘晓明，竺晓平．2014．番茄褪绿病毒在山东暴发及其防治措施．中国蔬菜，（5）67-69．孙国珍，高利利，陆文利，王勇，张安胜，竺晓平．2015．河北省设施番茄褪绿病毒分子检测和鉴定研究．北方园艺，（9）95-98．图 4 烟粉虱生物类型鉴定结果M，DNA marker；1～20，单头烟粉虱样品。表 2 4 种茄科蔬菜上烟粉虱带毒率统计宿主植物 平均带毒烟粉虱数目 平均感染率/番茄 7.0 87.5茄子 6.7 83.3辣椒 5.3 66.7马铃薯 6.7 83.3M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 205000bp3000bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp 30新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES汤亚飞，何自福，佘小漫，蓝国兵．2017．侵染广东番茄的番茄褪绿病毒分子鉴定． 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tomato，pepper，eggplantandpotatoplants.ThesymptomsweresuspectedasTomato chlorosis virus（ToCV）and alargenumberofBemisia tabaciwerefoundonthebackofleaves.Theinfectedleavesoftomato，pepper，eggplant andpotatoandBemisia tabacisamplesweredetectedbyRT-PCRusinggenespecificprimersofToCVheatshockprotein70（HSP70）sequence，and anexpectedfragmentwereobtained.Theresultsofsequenceanalysisrevealedthatthefragmentsharedthehighestnucleotideidentityat99.0withtheisolatesfromBeijing（KC887999.1）. TheinfectionrateofToCVofthese4kindsofSolanaceaevegetableswas70-100.ViruliferousrateofBemisia tabaciwas66.7-87.5.ThewhiteflybiotypewasMED.ThisisthefirsttimethatHunanProvinceconfirmstheexistingofToCV，which needsspecialattentionandstrongerprevention.Key words Tomato chlorosis virus；Solanaceae vegetablecrops； Bemisia tabaciPanH，Chu D，Ge D，Wang S，Wu Q，Xie W，Jiao X，Liu B，Yang X，Yang N，Su Q，Xu B，Zhang Y．2011．Further spreadofanddominationbyBemisia tabaci（ Hemiptera Aleyrodidae）biotype QonfieldcropsinChina．Journal ofEconomicEntomology，104 （3）978-985．Garcacano E，Navascastillo J，Moriones E，Fernndezmu ozR．2010． ResistancetoTomato chlorosis virusinwildtomatospeciesthatimpairvirusaccumulationanddiseasesymptomexpression．PlantDisease，100（6）582-592． 31新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES