辣椒菌核病菌毒素的产生及其生物活性测定_于舒怡.pdf

第 14 期第 57 卷第 3 期2018 年 1月湖北农业科学Hubei Agricultural SciencesVol． 55 No.10May.，201655 26Vol． 55 No.1Jan.14期757 4Jul. 18于舒怡，刘志恒，邵 丹，等.辣椒菌核病菌毒素的产生及其生物活性测定［J］.湖北农业科学，2018，57（14）53-55，63.收稿日期2018－03－30作者简介于舒怡（1982－），男，山东烟台人，副研究员，博士，主要从事园艺作物病害病理学和流行学研究，（电话）13998882718（电子信箱）crea0115＠163．com；通信作者，刘志恒，教授，主要从事植物病理学研究，（电子信箱）lzzh1954＠163．com。辣椒菌核病（Sclerotinia rot of pepper）是由子囊菌门核盘菌属核盘菌 ［Sclerotinia sclerotiorum（Lib．） de Bary］侵染引起的一种真菌病害［1］。 随着设施辣椒种植面积逐年扩大和连茬种植， 辣椒菌核病发生和危害日趋严重， 已成为辽宁辣椒生产的主要病害之一［2，3］。 辣椒菌核病菌分泌的草酸产物是其产生致病性的基本决定因子［4，5］。 草酸可破坏植物细胞壁的完整性，促进细胞溶解酶的活性，通过酸化寄主组织诱导植株萎蔫，使寄主组织液外渗，利于病菌的侵入和扩展［6］。 前人在油菜、大豆、向日葵等作物上对草酸毒素产生的培养条件［6，7］、致病性［8］、致病机制［9］、寄主的抗病机制［10］等方面均有深入的研究。 然而， 目前尚未见有关辣椒菌核病菌毒素产毒条件及生物测定方法的报道。因此，本研究采用马铃薯葡萄糖培养液培养和室内接种试验， 开展辣椒菌核病菌毒素的时间序列分析及其生物活性测定， 为选育抗病品种、 有效控制辣椒菌核病提供理论基础和科学依据。辣椒菌核病菌毒素的产生及其生物活性测定于舒怡1，刘志恒2，邵 丹3，刘长远1（1．辽宁省农业科学院植物保护研究所，沈阳 110161；2．沈阳农业大学植物保护学院，沈阳 110866；3．安华农业保险股份有限公司沈阳中心支公司，沈阳 110141）摘要采用马铃薯葡萄糖培养液培养和室内接种试验，开展辣椒菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）毒素的时间序列分析及其生物活性测定。 结果表明，辣椒菌核病菌分泌的毒素产物为草酸，随着菌丝的不断生长，病菌分泌的草酸浓度逐渐上升，当病菌生长速度最快时，草酸含量也达到最大值，pH则相应降低到最小值。 草酸毒素可以调节培养基质的pH。 草酸毒素和菌丝的共同作用才能有效侵染寄主组织，且草酸毒素对辣椒种子的萌发活力、幼苗的生长和植株的发育均有较强的抑制作用。关键词辣椒菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）；草酸毒素；生物活性中图分类号S432．4；S436．418 文献标识码A文章编号0439－8114（2018）14－0053-03DOI10.14088/ki.issn0439-8114.2018.14.012 开放科学（资源服务）标识码（OSID）Determination of Production and Biological Activity ofToxin of Sclerotinia sclerotiorumYU Shu－yi，LIU Zhi－heng，SHAO Dan，LIU Chang－yuan（1．Institute of Plant Protection， Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Shenyang 110161，China；2．College of Plant Protection，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China；3．Shenyang Central Sub－branch Company，An Hua Agricultural Insurance Co．，Ltd．，Shenyang 110141，China）Abstract The time series analysis and biological activity of toxin of Sclerotinia sclerotiorum were carried out by artificialculture and inoculation test． The results showed that the main toxin product produced by S． sclerotiorum was oxalic acid，andthe concentration of oxalic acid increased gradually with the mycelium growth． When the growth rate of pathogen was thefastest，the content of oxalate reached the maximum value，and the pH correspondingly decreased to a minimum． Oxalate couldregulate the pH of the culture matrix． The combined action of oxalic acid and mycelium could effectively infect host tissues，andoxalate toxin had a strong inhibitory effect on seed germination vigor，seedling growth and plant development of pepper．Key words Sclerotinia sclerotiorum； toxalic acid toxin； biological activity湖 北 农 业 科 学 2018年1材料与方法1．1 供试菌株供试菌株采自辽宁省朝阳北票市蒙古营乡跃进示范园试验田， 经组织分离法分离纯化获得纯净的核盘菌菌丝，由沈阳农业大学真菌实验室提供。1．2 产毒培养液选择马铃薯葡萄糖（PD）培养液进行毒素培养。马铃薯 200 g， 葡萄糖 20 g， 去离子水 1 000 mL，121 ℃高温湿热灭菌30 min后备用。1．3 病菌产生的时间序列分析将菌核在PDA平板上培养3d，待长出新鲜菌丝时，取一片直径 6．5 mm 菌饼移入装有 60 mL PD 培养液的 150 mL 三角瓶中， 置于摇床中，110 r／min、25 ℃恒温振荡培养，以不接菌的PD培养液为对照，试验设置3次重复。 培养2 d后逐日测定菌丝干重、pH和草酸含量，连续测定14 d。1．4 菌丝干重的测量先将备好的滤纸在80 ℃的恒温箱中烘至恒重，用电子天平称得所用每张滤纸的重量， 再用双层滤纸过滤病原菌的培养液， 将过滤后的滤纸及其上面的菌丝体在80 ℃的恒温箱中烘干至恒重，然后用电子天平称取其重量， 这两次称量数据的差值即为菌丝干重。1．5 毒素pH的测定采用 METTLER TOLEDO （Five Easy）pH 计进行毒素pH的测量。1．6 草酸毒素含量的测定将毒素用去离子水定容到60 mL， 取30 mL 于三角瓶中，加入 25％ CaCl22 mL，并加热 5 min，然后放置过夜，充分沉淀，离心（3 000 r／min，10 min），弃去上清液，用去离子水洗涤沉淀 3 次，将沉淀溶于 5 mL H2SO4中（水∶硫酸＝9∶1），充分溶解后，移入滴定瓶中，并用 20 mL 去离子水洗涤溶液，在溶液中加入1 mL 10％ MnSO4溶液，加热到60～70 ℃，用1．58 g／L KMnO4滴定至显玫瑰色， 且30 s 不退色，计算草酸含量。1 mL 1．58 g／L KMnO4相当于0．145mg草酸（H2C2O4）。 3次重复的平均值为培养液草酸浓度。1．7 病菌毒素生物活性测定产毒培养条件同“1．3”，培养7 d后，分别采用双层纱布和细菌过滤器过滤， 将辣椒菌核病菌培养滤液平均分为两份， 一份于 121 ℃高温蒸汽灭菌 30min，离心取上清液为毒素粗提液；另一份为菌核病菌培养液。用辣椒叶片、幼苗、种子进行毒素的生物活性测定。 ①用毒素粗提液200μL分别直接接种、针刺接种和脱脂棉包叶柄处理成株期辣椒叶片， 并保湿处理，每个处理 20 片离体叶片，以无菌的产毒培养液为对照，3 d后观察处理的症状表现。 ②用病菌培养液和毒素粗提液分别处理辣椒幼苗， 各使用20 mL和10 mL 两个梯度，每个处理 20 株，以无菌的产毒培养液为对照，7 d后观察其症状表现。 ③用病菌培养液和毒素粗提液各20 mL浸泡辣椒种子， 每个处理100粒种子，以无菌的产毒培养液为对照，进行发芽试验，计算各处理种子的萌发率及胚根平均长度。1．8 数据统计分析使用SPSS 13．0统计软件进行测量数据的统计分析。2结果与分析2．1 病菌产生的时间序列分析辣椒菌核病菌在毒素培养液中培养 1～12 d，每天测定菌丝生长量、草酸含量及pH的变化。 结果表明，辣椒菌核病菌在生长过程中菌丝干重增长迅速，与时间呈正比，并呈“S”型曲线增加，培养 1 d 后，病菌即开始生长，6～10 d 生长速度最快， 第十天其菌丝生长量达到最大值，随之，增殖速度逐渐降低（图1a）。 培养1 d后毒素的pH开始下降，9 d后呈现上升的趋势（图1b）。图1c显示，培养1 d后，草酸毒素开始积累，6～9 d 草酸含量变化速度最快，第九天草酸含量达到最高峰，随后其含量略有下降，其中的原因未明。 综合分析表明，随着病菌的不断生长，病菌分泌的毒素浓度逐渐上升，当病菌生长速度最快时，草酸含量也达到最大值，pH 则相应降低到最小值；随着营养成分的不断利用，病菌生长速度减慢，草酸的积累逐步减少，pH也相应略有回升。2．2 病菌毒素的生物活性测定2．2．1 毒素对辣椒成株期叶片生物活性测定 毒素粗提液接种辣椒叶片， 处理方法不同， 症状差异明显。 直接接种处理的叶片无明显症状； 经针刺处理的叶片，在侵染点周围出现水渍状斑点，病斑中间进一步变为黄褐色，7 d后叶片腐烂； 使用脱脂棉包裹叶柄的处理，症状最为明显，叶片逐渐退绿，3 d即可腐烂（图2）。由试验结果分析， 辣椒菌核病毒素只有与菌丝共同作用才能侵染成功，在无病原菌菌丝的情况下，不能侵染寄主组织；在组织受伤的情况下，毒素可以使叶片组织退绿、萎蔫、腐烂；同时，毒素经叶脉扩散较快，通过导管传输。54第 14期（下转第63页）图 1 辣椒菌核病菌菌丝生长过程中菌丝干重（a）、pH（b）、草酸含量（c）的变化12345678910112时间//d0.60.40.20.0菌丝干重//ga1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12时间//d86420pHb1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12时间//d876543210产生草酸含量//mLc2．2．2 毒素对辣椒幼苗的生物活性测定 用辣椒菌核病菌培养液和毒素粗提液处理幼苗，叶片退绿，幼苗出现萎蔫、生长缓慢、落叶等病状，植株生活力减弱（图3）。其中，20 mL病菌培养液处理的植株，根系组织坏死，茎部有水渍状病斑，并不断扩展，7 d后死亡；毒素粗提液对植株的致萎作用较病菌培养液弱，植株叶片略黄，有落叶现象。2．2．3 毒素对辣椒种子生物活性的测定 用辣椒菌核病菌培养液和毒素粗提液处理辣椒种子， 辣椒种子萌发率极低，分别为 18．00％和 22．50％，与对照相比，差异极显著（表1）。 第九天胚根平均长度分别为35．60 和 31．30 mm，且根尖变黄；对照培养处理的种子，其萌发率为 92．33％，胚根生长正常，生命力旺盛（图4）。3小结与讨论人工培养条件下， 随着辣椒菌核病菌的不断生长，病菌分泌的毒素浓度逐渐上升，当病菌生长速度最快时， 草酸含量也达到最大值，pH 则相应降低到最小值；随着营养成分的不断利用，病菌生长速度减慢，草酸的积累逐步减少，pH也相应略有回升，表明作为酸性物质的草酸成分， 对培养基质的 pH 有调节作用。有学者认为草酸毒素可使向日葵叶片的细胞膜透性逐渐增大，造成电解质外渗，即草酸毒素对向日葵叶片细胞具有一定的破坏作用［11］。然而，本研究结果表明， 辣椒菌核病毒素必须在有自然伤口或菌核病菌菌丝侵染形成病斑的条件下才能侵染寄主组织，而在健康寄主上直接接种草酸毒素则无法侵染，说明核盘菌在侵染不同寄主作物上的致病力存在一定差异， 草酸毒素可以加速受病组织迅速分解、破坏，甚至造成组织腐烂；同时，毒素经叶脉扩散较快，通过导管传输，因此病菌在田间危害时，常会在短时间内导致寄主组织的破坏和腐解。辣椒菌核病菌培养液和毒素粗提液对辣椒叶片、 幼苗以及种子均有一定的抑制作用。 草酸毒素图 2 辣椒菌核病菌毒素对辣椒离体叶片生物活性的影响CK 直接处理 针刺处理 包柄处理图 4 辣椒菌核病菌毒素对辣椒种子生物活性的影响CK 病菌培养液 毒素粗提液图 3 辣椒菌核病菌毒素对辣椒幼苗生物活性的影响毒素粗提液20 mL毒素粗提液10 mL病菌培养液20 mLCK病菌培养液10 mL表 1 辣椒菌核病菌毒素对辣椒种子生物活性的影响处理对照培养液病菌培养液毒素粗提液萌发率92.3318.0022.50P＜0.05acbP＜0.01ACB第九天胚根平均长度mm64.0035.6031.30P＜0.05abcP＜0.01ABC差异显著性 差异显著性于舒怡等辣椒菌核病菌毒素的产生及其生物活性测定 55第 14期（上接第55页）可使叶片退绿，幼苗出现萎蔫、生长缓慢、落叶、植株生活力减弱，辣椒种子萌发率极低、胚根长度较短、且根尖变黄、生命力差。说明草酸对辣椒种子的萌发活力、幼苗的生长和植株的发育均有较大影响。通过对辣椒菌核病菌草酸毒素进行生物活性测定， 为今后用草酸接种鉴定辣椒品种对菌核病的抗性研究提供理论依据。参考文献［1］ 戴芳澜．中国真菌总汇［M］．北京科学出版社，1979．［2］ 刘志恒，邵 丹，杨 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从生产环境中亦分离到大量的芽孢菌， 魔芋膳食纤维生产工艺中需用乙醇对魔芋精粉进行纯化，乙醇可使细菌蛋白凝固从而对大多数细菌具有较强的杀灭作用， 同时生产工艺中涉及高温真空干燥过程，可杀灭大多数细菌，但部分芽孢可耐受高温不被杀死。因此，本试验得出的宜昌地区魔芋膳食纤维固体饮料产品菌相构成主要为芽孢菌属，与产品生产工艺及环境有一定的关联性。由于魔芋膳食纤维固体饮料生产过程中经过洗粉、高温真空干燥等工艺，菌落总数会大大降低。 但芽孢菌属对恶劣环境具有较强的抗性， 芽孢可在环境中长期存活［9］，较难清除，部分条件致病芽孢菌数量达到一定限值后会对人体造成一定损害， 本试验排除所用材料中存在蜡样芽孢的可能， 但空气及管道中芽孢菌的长期积累依然可能造成产品卫生指标不合格，企业应加强对芽孢菌的控制，由于粉尘及空气可能为污染的主要来源， 建议企业各工序之间采取全封闭管道生产，可有效降低产品污染。本试验从产品中所分离菌株未能鉴定到种，需进一步进行鉴定，确认其危害性，同时需采取其他技术手段［10，11］分析加工过程中各环节的微生物种群多样性，比较各环节菌群的差异，对比各环节分离菌株的一致性，进一步确认产品芽孢菌污染主要来源，以便更好地指导企业对环境及工艺进行改造。参考文献［1］ 钟 燕，索化夷．魔芋葡甘聚糖的功能及在食品领域的应用［J］．中国酿造，2014，33（8）6－9．［2］ 廖 鑫．巴氏鲜奶中优势腐败微生物的菌相分析与生长预测模型的研究［D］．武汉武汉工业学院，2011．［3］ GB／T 16293－2010，医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法［S］．［4］ GB／T 16294－2010，医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法［S］．［5］ GB 15982－2012，医院消毒卫生标准＋WS367－2012医疗机构消毒技术规范［S］．［6］ 孙承锋，南庆贤，牛天贵．酱牛肉中腐败细菌的分离与鉴定［J］．中国食品学报，2001，1（1）56－60．［7］ 刘勤华，黄 明，潘润淑，等．真空包装酱牛肉中腐败细菌的分离、初步鉴定与菌相变化分析［J］．食品科学，2009，30（23）297－300．［8］ 傅 鹏，李平兰．冷却猪肉初始菌相分析与冷藏过程中的菌相变化规律研究［J］．食品科学，2006，27（11）119－124．［9］ 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