猕猴桃青霉病病原菌鉴定及中草药提取物对其抑菌效果.pdf

2 0 1 8 , 4 4 （ 3 ） ： 1 8 6 1 8 9 PlantProtection 收 稿 日 期 ：2017 07 31 修 订 日 期 ：2017 09 27 基 金 项 目 ：湖南省农业科技创新资金 湘农科科 （ 2017 ） 18 号 * 通信作者 E-mail ： bufanwen 126. com 猕 猴 桃 青 霉 病 病 原 菌 鉴 定 及 中 草 药 提 取 物 对 其 抑 菌 效 果 程 小 梅 1 ， 2 ，彭 亚 军 3 ，杨玉 1 ， 2 ，徐海 1 ， 2 ，罗 赛 男 1 ， 2 ，卜 范 文 1 ， 2* （ 1. 湖南省农业科学院园艺研究所 ，长沙410125 ； 2. 农业部华中地区果树科学观测实验站 ，长沙410125 ； 3. 湖南省农业科学院植物保护研究所 ，长沙410125 ） 摘 要为 了 解 决 猕 猴 桃 真 菌 病 害 导 致 的 贮 运 难 题 ， 作 者 从 湖 南 、 陕 西 两 个 猕 猴 桃 主 产 区 采 集 的 病 果 中 分 离 获 得 青 霉 菌 株 Q-1 ， 应 用 rDNA-ITS 分 子 标 记 、 BLASTn 比 对 ， 结 合 传 统 真 菌 形 态 学 鉴 定 ， 确 定 该 致 病 菌 为 草 酸 青 霉 Pencilli- umoxalicum 。 利 用 带 药 培 养 基 法 筛 选 出 对 侵 染 猕 猴 桃 的 青 霉 菌 有 最 佳 抑 制 作 用 的 中 草 药 提 取 物 ， 猕 猴 桃 果 实 采 后 刺 伤 接 种 Q-1 ， 研 究 中 草 药 提 取 物 对 果 实 病 斑 直 径 的 影 响 。 结 果 表 明 ： 川 芎 、 肉 桂 、 高 良 姜 的 乙 醇 提 取 物 对 青 霉 均 有 较 好 的 抑 制 效 果 ， 菌 丝 生 长 相 对 抑 制 率 分 别 达 到 92. 79% 、 77. 67% 、 78. 49% ， 其 中 以 川 芎 的 抑 菌 效 果 最 佳 。 猕 猴 桃 果 实 在 贮 藏 期 接 种 Q-1 菌 株 后 ， 中 草 药 提 取 物 处 理 可 显 著 抑 制 果 实 病 斑 扩 大 。 关 键 词猕 猴 桃 ；青 霉 ；鉴 定 ；中 草 药 提 取 物 中 图 分 类 号 ：S436. 634 文 献 标 识 码 ：A DOI ：10. 16688 j. zwbh. 2017282 Identificationofthe p atho g encausin g fruit p enicilliosisonkiwifruitandthe inhibitioneffectofChineseherbextractsonthe p atho g en CHENGXiaomei 1 ， 2 ，PENGYajun 3 ，YANGYu 1 ， 2 ，XUHai 1 ， 2 ，LUOSainan 1 ， 2 ，BUFanwen 1 ， 2 （ 1.HunanHortisulturalResearshInstitute ， HunanAsademyofAgrisulturalSsienses ， Changsha 410125 ， China ； 2.SsientifisObservationandExperimentStationofFruitTreesinCentralChina ， Ministryof Agrisulture ， Changsha 410125 ， China ； 3.InstituteofPlantProtestion ， HunanAsademyof AgrisulturalSsienses ， Changsha 410125 ， China ） Abstract Theaimofthisstudyistosolvethedifficultiesoffungaldiseasesinpostharveststorageandtransitofki- wifruit.Thepathogenofkiwipenicilliosiswasisolatedfromthediseasedkiwifruitcollectedfrommainproduction areasofHunanandShaanxiprovincesandwasnamedQ-1.BasedonrDNA-ITSsequenceanalysis ， BLASTnalign- mentandtraditionalmorphologicalidentification ， thepathogenwasidentifiedasPensilliumoxalisum.TheChi- neseherbextractswiththebestinhibitingeffectstoPensilliumoxalisum werescreenedbydrug-containingPDA plates ， andtheireffectsoncontrollingdiseaseofkiwifruitinoculatedwithP.oxalisum werealsoinvestigated. Theresultsshowedthatethanolextractsofrhizomaligusticumwallichii ， cinnamonandgalangalallhadgoodin- hibitingeffectsonP. oxalisum ， withtheinhibitionratioof92. 79 ， 77. 67 ， and78. 49onmycelialgrowth ， respectively ， amongwhichextractofrhizomaligusticiwallichiihadthebestantifungalactivity.Duringkiwifruit storage ， Chineseherbextractstreatmentsignificantlydecreasedthelesiondiameterofkiwifruitinoculatedwith P. oxalisum. Keywords kiwifruit ；Penisillium ；identification ；Chineseherbextract猕猴桃是一种深受消费者喜爱的水果 ，营养极 为丰富 。维生素 C 含量高 ，同时还含大量的糖 、蛋白 质 、 氨基酸等多种有机物和人体必需的多种矿物质 。 猕猴桃果实青霉病是我国猕猴桃贮藏期的主要病 害 ，在湖南 、陕西等猕猴桃主产区发生比较普遍 ，症 状为在果面受损伤处呈现青绿色霉层 ，易于识别 。 44 卷第 3 期 程小梅等 ：猕猴桃青霉病病原菌鉴定及中草药提取物对其抑菌效果 病原为多种青霉 ，主要由伤口侵入 ，引起腐烂 。青霉 不仅引起猕猴桃腐烂 ，还危害柑橘 、苹果 、梨 、哈密瓜 等的叶片和果实 ，引起各种贮藏病害 1 2 。常用于水 果贮藏保鲜的抗真菌作用较强的中草药成分主要有 丁香 、木香 、大黄 、荆芥 、肉桂 、茵陈蒿 、川芎 、肉豆蔻 、 黄连 、黄芩 、紫草和黄柏等 3 7 。本研究从湖南 、陕西 两大猕猴桃主产区采集了青霉危害的样本 ，对该病 菌的致病力 、形态学 、分子生物学特性进行比较分 析 ，同时筛选出对分离菌株有较强抑菌作用的中草 药提取物 ，以期为猕猴桃贮藏期真菌病害的防治提 供理论依据 。 1 材 料 与 方 法 1. 1 试 验 材 料 猕猴桃青霉病病果采自湖南永顺 、凤凰 ，陕西眉 县 、 周至 4 个猕猴桃主产区的 5 个果园 ，每个果园分 别采集样品 6 份 ，共计 30 份 。 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （ PDA ） ：马铃薯 200g 、 葡萄糖 20g 、琼脂 20g 、蒸馏水 1L 。 试剂及仪器 ： PCR 扩增仪为 TaKaRaBioInc. 生 产的 TaKaRaThermalCyclerDiceTP600 ； 核酸电泳仪 为 ADVANCE-BIOCo. ， Ltd 生产的 Mupid ； 蛋白质电 泳仪为上海天能生产的 EPS300 ；电泳成像装置采用 PharmaciaBiotechImageMaster ® VDS ； DNA 测序仪 为 Applied Biosystem 生产的 ABI PRISM TM 3730XLDNASequencer ；循环测序试剂盒采用 Big- Dye ® TerminatorV3.1CycleSequencingKit ；川 芎 、肉桂 、高良姜原料均购于安徽蜀中医药有限 公司 。 1. 2 方 法 1. 2. 1 病 原 菌 的 分 离 纯 化 、 致 病 性 测 定 及 柯 赫 氏 法 则 验 证将发病的果实表皮用清水清洗干净 ，切取 5mm ×5mm 的病组织数块 ，用 75% 的乙醇消毒 10s ，随 后放入 0. 1% 升汞消毒 5min ，取出后用无菌水冲洗 3 次 ，将病组织放入马铃薯葡萄糖琼脂 （ PDA ）平板 中 ，在 28 黑暗培养 ，分离纯化得到供试菌株 。将 分离纯化的菌株在 PDA 平板上 28 培养 3 5d 后 用打孔器打取直径 4mm 的菌丝块 。每个处理选取 健康的猕猴桃果实 10 个 ，用接种针在果实腰部将果 实刺伤后将菌饼有菌丝的一面紧贴于果实伤口处 ， 菌丝块表面覆盖湿棉球 ，放入瓷盘中密封保湿 ，逐日 观察各处理的发病情况 。以接种不含菌 PDA 为对 照 。从接种后发病的果实上再次分离 、纯化和培养 病原菌 ，并与原菌株进行比较 。 1. 2. 2 病 原 菌 的 形 态 学 观 察 将菌株接种到 PDA 平板上于培养箱中 28 避光 培养 2d ， 在显微镜下观察病原菌的分生孢子形态 。 1. 2. 3 病 原 菌 的 分 子 生 物 学 鉴 定 从 PDA 平板上用牙签挑取少量菌体于 50 L 裂解缓冲液 （ TaKaRaLysisBufferforMicroorgan- ismtoDirectPCR ， CodeNo.9164 ）中 ，在 80 下 ， 变性 15min ，变性后离心取上清作为模板 。使用 TaKaRaFungi IdentificationPCRKit （ CodeNo. RR178 ）扩增目的片段 。 PCR 反应体系为 50 L ，其 中 ， DNA 模板 （ 变性反应液 ） 1 L ， PCRPremix25 L ， ITSForwardprimer （ 20 pmol L ） 0.5 L ， ITS Reverseprimer （ 20pmol L ） 0. 5 L ， ddH2O23 L 。 扩增程序为 ： 945min ； 9430s ， 5530s ， 72 1min ， 30 个循环 ； 725min ；扩增完毕 ，取 10 L 扩增产物用 1.2% 琼脂糖凝胶进行电泳检测 8 。 PCR 产物送宝生物工程 （大连 ）有限公司测序 。将 所得的序列提交到 GenBank 核酸序列数据库中 ，获 得登录号 。同时将序列作同源相似性差异分析 ，确 定该菌株的分类地位 ，用 NJ 法 （ neighbor-joining method ）构建系统进化树 。 1. 2. 4 中 草 药 提 取 物 对 青 霉 的 抑 菌 作 用 精选川芎 、高良姜 、肉桂原料切碎后 ，取肉桂粗 粉各 10g 。分别以乙醇为溶剂 ，索氏法提取 3.2h ， 提取液过滤 ，减压回收乙醇至无醇味 ，热水分散后 放冷 ，石油醚 （ 60 90 ）脱脂 3 次 ，水液浓缩 ， 80 干燥成干浸膏 ，粉碎成细粉供试 9 。分别配制 肉桂 、高良姜 、川芎提取液母液 330mg mL 备用 。 取配制好的中草药提取液母液与 PDA 培养基混合 均匀制成浓度为 8.25mg mL 的带药培养基 ，将其 倒入 9cm 培养皿中 ，以相同量的无菌水代替中草药 母液作为对照 10 。提取物对青霉的抑菌效果采用 改良的菌丝生长速率法 11 13 ，即在含药培养基中央 用直径为 4mm 的打孔器打孔 ，注入 50 L1.0× 10 6 个 mL 的青霉孢子悬浮液 ，培养箱 28 培养 72h 后观察试验结果 。采用十字交叉法测量各菌落直 · 7 8 1 · 2018 径 ，计算各处理菌落直径的平均值和菌丝生长相对 抑菌率 。 抑菌率 = ck-c ck ×100% ； 公式中 ck 为对照组菌落的净生长量 ， c 为中草 药处理组菌落的净生长量 。 1. 2. 5 中 草 药 提 取 物 对 猕 猴 桃 果 实 损 伤 接 种 青 霉 的 抑 菌 效 果选取外观整齐 、 无病虫害和机械损伤的猕猴桃用 75% 乙醇消毒 ， 晾干备用 。用接种针在果实表面穿刺 接种 ， 对照组只接种 Q-1 病原菌 ，处理组先接种孢子 浓度为 10 6 10 7 个 mL 的青霉孢子悬浮液 50 L ，稍 晾干后接种中草药提取物处理液 ，同时设有空白对 照 。伤口晾干后将果实放在包装盒中 ，外套塑料袋保 湿 ， 于 26 贮藏 。每隔 2d 观察发病率和病斑直径 。持 续观察 7d 。每个处理设 3 次重复 ， 每重复 8 个果实 ， 果 实损伤接种后病斑直径测量采用十字交叉法 14 。 2 结 果 与 分 析 2. 1 猕 猴 桃 青 霉 病 病 原 菌 的 筛 选 分 离 及 致 病 性 测 定 从 30 份样品中共分离到 6 株具有较强致病性 的青霉 ，健康猕猴桃接种这 6 株青霉后 ，其发病症状 与自然发病症状一致 ，所有对照均无发病症状 。对 接种后发病的组织进行再次分离均能得到与原来接 种的菌落特征相同的分离物 15 。后续试验取菌株 Q-1 进行 。 图 1 Q-1 菌 株 对 猕 猴 桃 的 致 病 性 Fig. 1 PathogenicityaSSayofQ-1tokiwifruit 2. 2 猕 猴 桃 果 实 上 分 离 青 霉 的 形 态 学 特 征 如图 2a 所示 ，菌株 Q-1 在 PDA 培养基上的 菌落为暗青色 ，粉粒状 ，生长速度较快 ，边缘呈白 色 。从背面观察培养基 ，发现培养基由浅黄色慢 慢变为黄褐色 ，并随着培养时间的延长而逐渐加 深 。分生孢子呈念珠状串生 ，单孢无色 ，近球形 （图 2b ） 。 图 2 猕 猴 桃 果 实 上 分 离 的 青 霉 Q-1 的 形 态 特 征 Fig. 2 MorphologyofPenicilliumSp.StrainQ-1fromkiwifruit 2. 3 猕 猴 桃 果 实 上 分 离 青 霉 的 分 子 生 物 学 鉴 定 将菌株 Q-1 的 ITS 基因序列提交至 GenBank ， 获得登录号 MF669724 。病原菌的琼脂糖凝胶电 泳结果见图 3 。菌株 Q-1 和菌株 L-1 为作者从猕 猴桃感病果实中分离出的具有代表性的菌株 。将 所得序列作同源相似性分析 ，确定了该菌株的分类 地位 ，构建了系统进化树 ，结果 （图 4 ）表明 ，菌株 Q-1 与登录号 KP735935.1 和登录号 KX674635.1 的同 源性最高 ，综合比较病原菌的形态学特征结合序列 比对结果可以得出 ，菌株 Q-1 为草酸青霉 Penicilli- umoxalicum 16 。 图 3 病 原 菌 的 PCR 产 物 电 泳 结 果 Fig. 3 ElectrophoreticreSultSofPCRproductSof ITSgeneinthepathogen · 8 8 1 · 44 卷第 3 期 程小梅等 ：猕猴桃青霉病病原菌鉴定及中草药提取物对其抑菌效果 图 4 Q-1 菌 株 的 系 统 发 育 树 Fig. 4 PhylogenictreeofQ-1Strain 2. 4 几 种 中 草 药 提 取 物 对 青 霉 的 抑 菌 情 况 表 1 结果可以看出肉桂 、高良姜和川芎提取物 均对 Q-1 的抑菌效果良好 ，尤其是川芎提取物对 Q- 1 的抑菌率最高 ，达到了 92. 79% 。 表 1 几 种 中 草 药 提 取 物 对 Q-1 的 抑 菌 作 用 1 ） Table1 InhibitioneffectofSeveralChineSeherb extractSonmycelialgrowthofQ-1 中草药提取物 Chineseherbalmedicine 菌落直径 cm Colonydiameter 抑菌率 % Inhibitoryrate 肉桂提取物 Cinnamonextract （ 1. 92±0. 06 ） bB （ 77. 67±0. 73 ） bB 高良姜提取物 Galangalextract （ 1. 85±0. 04 ） bB （ 78. 49±0. 47 ） bB 川芎提取物 Rhizomaligusticiwallichiiextract （ 0. 62±0.10 ） cC （ 92. 79±1. 20 ） aA CK （ 8. 60±0 ） aA -1 ）同一列数据后标示的大写和小写字母分别表示 0. 01 和 0. 05 差 异显著水平 。下同 。 Differentcapitalandlowercaselettersinthesamecolumnindi- catedthesignificantdifferenceat1%and5%levels ， respec- tively. Thesamebelow. 2. 5 中 草 药 提 取 物 对 猕 猴 桃 果 实 采 后 刺 伤 接 种 Q-1 的 病 斑 直 径 的 影 响猕猴桃果实接种 Q-1 菌株 4d 后 ，病斑直径不 断增加 ，但中草药提取物处理显著抑制了果实病斑 的扩大 （图 5 ） 。综合比较川芎 、高良姜 、肉桂三种提 取物的处理结果 ，川芎提取物的抑制效果最突出 ，高 良姜提取物其次 ，最后为肉桂提取物 。 图 5 中 草 药 提 取 物 对 果 实 采 后 接 种 Q-1 的 病 斑 直 径 的 影 响 Fig. 5 EffectSofChineSeherbalmedicineextractSonleSion diameteronkiwifruitSinoculatedbyQ-1 3 结 论 与 讨 论 中草药提取物具有良好的杀菌作用 ，对人体和 环境无危害 ，增加了水果食用的安全性 ，用于水果保 鲜有很好的效果 。将中草药提取物应用到食品防腐 的最大优点就是腐烂率低 ，很少甚至不影响食品的 原有风味 。同化学合成的防腐剂相比 ，中草药提取 物不仅无毒 ，对人体健康也有裨益 。再者 ，中草药简 单易得 、取材容易 、经济实惠 ，中草药提取物替代化 学合成保鲜剂用于水果贮藏保鲜有着广阔的发展前 景 。本研究对猕猴桃青霉病病原菌进行了筛选 、鉴 定 ，应用 rDNA-ITS 分子标记分析 、 BLASTn 比对 ， 结合传统真菌形态学鉴定 ，确定致病菌 Q-1 为草酸 青霉 Pencilliumoxalicum 。作者从众多中草药提 取物中筛选出川芎 、高良姜 、肉桂三种中草药提取物 对猕猴桃青霉病病原菌抑菌效果较好 ，将三种抑菌 效果较好的中草药提取物用于猕猴桃果实采后刺伤 接种青霉的防腐 ，发现对病斑直径的扩大仍有较好 的抑制作用 。在后续的试验中作者会进一步验证在 本试验中发挥抑菌作用的几种中草药提取物的主要 抑菌成分 ，力争将本试验结果可以直接应用于生产 实践 、解决猕猴桃贮运难题 。 参 考 文 献 1 闵晓芳 ，邓伯勋 ，陈丽锋 ，等 . 柑橘采后致病青霉的鉴定 J . 果 树学报 ， 2007 ， 24 （ 5 ） ： 653 656. 2 YUTing ， LIHongye ， ZHENGXiaodong.Synergisticeffectof chitosanandCryptococcuslaurentii oninhibitionofPenicilli- umexpansuminfections J .InternationalJournalofFoodMi- crobiology2007 ， 114 （ 3 ） ： 261 266. 3 曾荣 ， 陈金印 ， 张阿珊 ，等 . 植物提取液对柑桔采后青霉 、绿霉抑 菌活性的研究 J . 江西农业大学学报 ， 2010 ， 32 （ 6 ） ： 1142 1145. 4 曾荣 ，张阿珊 ，陈金印 ，等 . 植物源防腐剂在果蔬保鲜中应用研 究进展 J . 中国食品学报 ， 2011 ， 7 （ 4 ） ： 161 165. 5 陈玉环 ， 彭旋 ， 陈楚英 ， 等 . 三颗针提取液复合涂膜对 “ 纽荷尔 ” 脐橙 贮藏保鲜的影响 J . 江西农业大学学报 ， 2016 ， 38 （ 3 ） ： 469 475. 6 张阿珊 ，曾荣 ，陈金印 ，等 . 丁香提取液对脐橙采后生理相关酶 活性的影响 J . 江西农业大学学报 ， 2011 ， 33 （ 6 ） ： 1067 1071. 7 陈楚英 ， 陈明 ， 陈金印 ， 等 . 壳聚糖涂膜对新余蜜橘常温贮藏保鲜 效果的影响 J . 江西农业大学学报 ， 2012 ， 34 （ 6 ） ： 1112 1117. 8 段爱莉 ，雷玉山 ，孙翔宇 ，等 . 猕猴桃果实贮藏期主要真菌病害 的 rDNA-ITS 鉴定及序列分析 J . 中国农业科学 ， 2013 ， 46 （ 4 ） ： 810 818. （下转 202 页 ） · 9 8 1 · 2018 综合以上试验研究结果 ，从防治效果 、增产效果 及投入成本等多因素考虑 ，建议从发病初期开始施 药 ，使用 300g L 苯甲 ·丙环唑 EC3000 倍液配施 0. 136% 赤 ·吲乙 ·芸苔 8000 倍液 1 次 ，随后连续 喷施 300g L 苯甲 ·丙环唑 EC3000 倍 2 次 ，间隔 约 10d ，可在减少农药使用量的同时 ，有效防治花生 网斑病并能提高花生荚果产量 。此外 ，在不同时期 进行杀菌剂交替使用 ，以延缓抗药性的产生 ，降低防 治成本 ，达到有效控制病害的目的 。 参 考 文 献 1 徐秀娟 ，崔凤高 . 中国花生网斑病研究 J . 植物保护学报 ， 1995 ， 22 （ 1 ） ： 70 74. 2 KOKALIS-BURELLEN ， PORTERDM ， RODRIGUEZ-KA- BANAR ， etal.Compendiumofpeanutdisease M .USA AmericanPhytopathologicalSociety ， 1997 ： 39 40. 3 SUBRAHMANYAMP ， SMITHDH.Effectofhostgenotype onincubationperiod ， receptivity ， lesiondiameter ， andleafare- adamageofDidymellaarachidicola onpeanut J .Peanut Science ， 1987 ， 14 （ 2 ） ： 90 94. 4 全鑫 ，宋玉立 ，何文兰 ，等 . 花生网斑病国内外研究进展 J . 河 南农业科学 ， 2008 （ 7 ） ： 13 16. 5 傅俊范 ，王大洲 ，周如军 ，等 . 辽宁花生网斑病发生危害及流行 动态研究 J . 中国油料作物学报 ， 2013 ， 35 （ 1 ） ： 80 83. 6 傅俊范 ，崔建潮 ，周如军 ，等 . 辽宁花生主栽品种 （系 ）对褐斑病 和网斑病抗性鉴定 J . 植物保护 ， 2015 ， 41 （ 1 ） ： 171 173. 7 陈华 ，李志敏 ，杨海棠 ，等 . 花生叶斑病 、网斑病的综合防治技术 J . 河南农业科学 ， 2004 （ 9 ） ： 91. 8 刘美昌 ，丰燕 ，冯志花 ，等 . 新型杀菌剂防治花生网斑病的效果 J . 山东农业科学 ， 2004 （ 3 ） ： 58 59. 9 王建伟 . 推广节约农药生产技术减少面源污染促进循环农业 发展 J . 河北农业科学 ， 2012 ， 16 （ 11 ） ： 50 52. 10 吴定邦 ，王东明 ，马勇 . 浅谈农药减量使用的技术措施 J . 安徽 农学通报 ， 2010 ， 16 （ 6 ） ： 106 107. 11 周长勇 ，刘伟中 ，郭小山 . 爱苗在花生上应用试验初报 J . 安徽 农学通报 ， 2011 ， 17 （ 24 ） ： 61 62. 12 陈发宏 ，荣维国 . 爱苗的防病效果及增产效果分析 J . 安徽农 学通报 ， 2007 ， 13 （ 22 ） ： 89. 13 王伟 . “爱苗 ”防治草莓白粉病的试验 J . 安徽农业科学 ， 2007 ， 35 （ 22 ） ： 6844. 14 REUVENIM ， SHEGLOVD.Effectsofazoxystrobin ， difeno- conazole ， polyoxinB （ polar ） andtrifloxystrobinongermina- tionandgrowthofAlternariaalternataanddecayinreddelicious applefruit J .CropProtection ， 2002 ， 21 （ 10 ） ： 951 955. 15 刘燕菁 ，范玉 ，张旭光 ，等 . 丙环唑在香蕉和土壤中的消解动态 及残留安全性评价 J . 植物保护 ， 2010 ， 36 （ 2 ） ： 109 111. 16 何晶晶 ，周如军 ，崔健潮 ，等 . 不同杀菌剂对花生网斑病菌室内 毒力测定及田间防效研究 J . 中国油料作物学报 ， 2015 ， 37 （ 4 ） ： 525 531. 17 袁虹霞 ，孙炳剑 ，李洪连 ，等 . 花生品种 （系 ）对叶斑病的抗性鉴 定 J . 河南农业科学 ， 2004 ， 33 （ 12 ） ： 35 38. 18 WOODWARDJE ， BRENNEMANTB ， KEMERAITRC ， et al.Managementofpeanutdiseaseswithreducedinputfungi- cideprogramsinfieldswithvaryinglevelsofdiseaserisk J . 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