北京万寿菊灰霉病病原菌分离鉴定.pdf

2018年 第 4期 C H I N A P L A N T P R O T E C T I O N 2018 , V o l 38 N o 4 灰 霉 病 是 一 种 常 见 的 真 菌 性 病 害 ， 是 葡 萄 、 番 茄 、 草 莓 、 黄 瓜 等 经 济 作 物 种 植 过 程 以 及 在 采 摘 保 鲜 过 程 中 常 见 且 为 害 巨 大 的 病 害 1 -4 ， 也 是 花 卉 栽 培 中 常 见 病 害 5 。 该 病 尤 其 是 在 设 施 条 件 下 种 植 的 蔬 菜 、 花 卉 中 常 见 发 生 ， 防 治 不 及 时 极 易 造 成 较 大 损 失 。 灰 霉 病 的 病 原 菌 属 于 真 菌 子 囊 菌 纲 核 盘 菌 科 葡 萄 孢 属 。 目 前 葡 萄 孢 属 约 有 30个 种 6 ， 其 中 大 部 分 种 可 导 致 植 物 病 害 。 万 寿 菊 是 常 见 的 草 本 花 卉 ， 由 于 其 抗 性 好 、 病 虫 害 少 、 栽 培 简 单 、 耐 粗 放 管 理 ， 已 成 为 花 境 、 花 坛 、 道 路 装 饰 的 主 要 植 物 材 料 。 除 了 观 赏 价 值 ， 万 寿 菊 花 朵 还 是 含 保 健 成 分 叶 黄 素 含 量 最 丰 富 的 植 物 组 织 ， 是 目 前 天 然 叶 黄 素 提 取 的 主 要 原 料 。 近 几 年 ， 伴 随 国 内 人 民 生 活 水 平 的 普 遍 提 高 ， 天 然 叶 黄 素 需 求 逐 年 增 加 ， 间 接 带 动 了 万 寿 菊 种 植 产 业 的 发 展 。 在 北 京 延 庆 ， 大 面 积 种 植 的 色 素 万 寿 菊 不 仅 为 叶 黄 素 提 取 提 供 了 原 料 ， 同 时 打 造 的 花 海 景 观 也 带 动 了 观 光 旅 游 、 餐 饮 等 产 业 的 进 一 步 发 展 ， 有 效 带 动 了 当 地 农 民 增 收 致 富 。 万 寿 菊 通 过 种 子 繁 殖 ， 商 业 化 的 万 寿 菊 种 子 主 北 京 万 寿 菊 灰 霉 病 病 原 菌 分 离 鉴 定 陈 东 亮 1 ， 李 明 远 1 ， 程 曦 1 ， 李 雪 梅 1 ， 王 玲 玲 1， 2 ， 黄 丛 林 1 （ 1. 北 京 市 农 林 科 学 院 北 京 农 业 生 物 技 术 研 究 中 心 /北 京 市 功 能 花 卉 工 程 技 术 研 究 中 心 /农 业 基 因 资 源 与 生 物 技 术 北 京 市 重 点 实 验 室 ， 北 京 100097； 2 . 西 藏 农 牧 学 院 ， 西 藏 林 芝 860000） 摘 要 ： 对 北 京 四 海 色 素 万 寿 菊 制 种 温 室 发 生 的 疑 似 灰 霉 病 调 查 发 现 ，万 寿 菊 植 株 发 生 叶 片 水 渍 状 枯 斑 、萎 蔫 等 ，严 重 的 甚 至 整 株 枯 萎 死 亡 ，造 成 了 重 大 损 失 。 为 明 确 其 病 原 ，对 病 原 菌 进 行 了 分 离 、培 养 和 快 速 致 病 性 测 定 ，并 对 分 离 的 菌 株 进 行 DNA 提 取 和 基 因 序 列 分 析 。 结 合 生 物 学 特 征 和 基 于 基 因 序 列 的 分 子 进 化 树 分 析 ，鉴 定 该 病 原 菌 为 灰 葡 萄 孢 （ B o t r y t i s c i n e r e a ） 。 关 键 词 ： 万 寿 菊 ； 灰 霉 病 ； 灰 葡 萄 孢 ； 鉴 定 中 图 分 类 号 ： S435. 672 ； S432 . 44 文 献 标 识 码 ： A 文 章 编 号 ： 1672 -682 0（ 2 018） 04-0011-06 收 稿 日 期 ： 2 017-10-2 4； 修 回 日 期 ： 2 018-01-15 基 金 项 目 ： 北 京 市 农 林 科 学 院 创 新 基 金 （ JNKST 2 01610、 KJCX2 0170108） ； 北 京 市 科 技 计 划 课 题 （ Z 161100001116091） ； 北 京 市 功 能 花 卉 工 程 技 术 研 究 中 心 创 新 平 台 项 目 作 者 简 介 ： 陈 东 亮 ， 博 士 ， 助 理 研 究 员 ， 研 究 方 向 为 植 物 分 子 生 物 学 。 E- m a i l ： d l c h e n 1984 12 6.c o m * 通 讯 作 者 ： 黄 丛 林 ， 博 士 ， 研 究 员 ， 研 究 方 向 为 花 卉 新 品 种 培 育 与 栽 培 技 术 研 究 。 E- m a i l ： c o n g l i n h 12 6.c o m 。 P a t h o g e n i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f g r e y m o l d o n m a r i g o l d i n B e i j i n g Ch e n Do n g l i a n g 1 ,L i Mi n g y u a n 1 ,Ch e n g Xi 1 ,L i Xu e m e i 1 ,W a n g L i n g l i n g 1, 2 ,Hu a n g Co n g l i n 1 （ 1.Be i j i n g Ag r i c u l t u r a l T e c h n o l o g y Re s e a r c h Ce n t r e ,Be i j i n g Ac a d e m y o f Ag r i c u l t u r e a n d Fo r e s t r y Sc i e n c e / Be i j i n g Fu n c t i o n Fl o w e r s En g i n e e r i n g T e c h n o l o g y Re s e a r c h Ce n t e r /Be i j i n g Ke y L a b o r a t o r y o f Ag r i c u l t u r a l G e n e Re s o u r c e a n d Bi o l o g i c a l T e c h n o l o g y ,Be i j i n g 100097,Ch i n a ;2 .T i b e t Co l l e g e o f Ag r i c u l t u r a l a n d An i m a l Hu s b a n d r y ,L i n z h i T i b e t 860000,Ch i n a ） A b s t r a c t :Su s p e c t e d g r e y m o l d d i s e a s e w a s i n v e s t i g a t e d i n Si h a i s e s u g r e e n h o u s e o f m a r i g o l d s e e d p r o d u c t i o n b a s e s i n Be i j i n g ,w h e r e s y m p t o m s o f h y g r o p h a n o u s s p o t a n d w i l t s o n m a r i g o l d a n d e v e n d e a d p l a n t w i t h h e a v y l o s s w e r e f o u n d .T h e p a t h o g e n w a s i s o l a t e d a n d c u l t u r e d ， DNA e x t r a c t i o n o f t h e i s o l a t e d s t r a i n s w e r e c o n d u c t e d ,a n d t h e s e q u e n c e s o f g 3p d h 、 h s p 6 0 a n d r b p 2 w e r e a n a l y z e d .Ba s e d o n b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d m o l e c u l a r e v o l u t i o n a r y t r e e o f p a r t i c u l a r g e n e s ,t h e p a t h o g e n w a s i d e n t i f i e d a s B o t r y t i s c i n e r e a . K e y w o r d s :m a r i g o l d ;g r e y m o l d ;B o t r y t i s c i n e r e a ;i d e n t i f i c a t i o n 11 · · 201 8 年 第 4 期 C H I N A P L A N T P R O T E C T I O N 201 8 , V o l 3 8 N o 4 拉 丁 名 菌 株 号 Ge n Ba n k 登 陆 号 r b p 2 h s p 60 g 3 p d h B. a c l a d a P RI006 AJ745 665 AJ71605 1 AJ704993 B. a l l i i MU C L403 AJ745 666 AJ71605 5 AJ704996 B. b y s s o i d e a MU C L94 AJ745 670 AJ71605 9 AJ704998 B. c a l t h a e C BS 175 .63 AJ745 671 AJ716060 AJ704999 B. c a r o l i n i a n a C B15 JF8115 90 JF8115 87 JF8115 84 B.c o n v o l u t a 9801 AJ745 679 AJ716068 AJ705 007 B. c i n e r e a S AS 5 6 AJ745 677 AJ716067 AJ705 006 B. c r o c i MU C L436 AJ745 681 AJ716070 AJ705 009 B. d e w e y a e C BS 134649 HG7995 18 HG7995 19 HG7995 21 B. e l l i p t i c a BE 9714 AJ745 684 AJ716073 AJ705 012 B. f a b a e C BS 109.5 7 AJ745 685 AJ716074 AJ705 013 B. f a b i o p s i s Br o a d b e a n BC -2 E U 5 14473 E U 5 14482 E U 5 19211 B. f i c a r i a r u m C BS 176.63 AJ745 687 AJ716076 AJ705 015 B. g a l a n t h i n a MU C L435 AJ745 689 AJ716079 AJ705 018 B. g l a d i o l o r u m 9701 AJ745 691 AJ716080 AJ705 019 B. g l o b o s a MU C L444 AJ745 693 AJ716083 AJ705 022 B. h y a c i n t h i 0001 AJ745 695 AJ716084 AJ705 023 B. n a r c i s s i c o l a MU C L1885 7 AJ745 698 AJ716086 AJ705 025 B. p a e o n i a e MU C L16084 AJ745 700 AJ716089 AJ705 028 B. p e l a r g o n i i C BS 497.5 0 AJ745 662 AJ716046 AJ704990 B. p o l y b l a s t i s MU C L21492 AJ745 703 AJ716092 AJ705 031 B. p o r r i MU C L3234 AJ745 704 AJ716093 AJ705 032 B. p s e u d o c i n e r e a 10091 NJ692428 JN692400 JN692414 B. r a n u n c u l i C BS 178.63 AJ745 706 AJ716095 AJ705 034 B. s p h a e r o s p e r m a MU C L21481 AJ745 708 AJ716096 AJ705 035 B. s q u a m o s a P RI026 AJ745 707 AJ716100 AJ705 039 B. t u l i p a e BT 9830 AJ745 713 AJ716102 AJ705 041 B. s i n o a l l i i On i o n BC -23 E U 5 14479 E U 5 14488 E U 5 19217 B. s i n o v i t i c o l a GBC -3-3c JN692424 JN692396 JN692410 表 1 进 化 树 构 建 用 到 的 葡 萄 孢 属 （ B o t r y t i s s p ） 菌 株 及 序 列 要 通 过 杂 交 的 方 式 获 得 。 为 了 获 得 高 产 、 质 量 稳 定 的 种 子 ， 杂 交 亲 本 需 要 在 设 施 条 件 下 栽 培 ， 以 减 小 不 良 自 然 条 件 对 种 子 产 量 和 质 量 的 影 响 。 然 而 ， 设 施 条 件 下 的 小 气 候 环 境 也 为 病 害 的 发 生 创 造 了 条 件 。 2017 年 7月 初 ， 在 北 京 延 庆 四 海 镇 万 寿 菊 制 种 温 室 内 ， 制 种 亲 本 圃 发 生 严 重 病 害 ， 植 株 普 遍 出 现 整 枝 、 整 株 的 萎 蔫 ， 严 重 的 枯 萎 死 亡 ， 造 成 了 重 大 损 失 。 为 明 确 病 原 ， 对 其 病 原 菌 进 行 了 分 离 、 培 养 ， 并 结 合 形 态 特 征 和 分 子 检 测 手 段 对 病 原 菌 进 行 了 鉴 定 ， 为 进 一 步 制 定 科 学 合 理 的 防 治 措 施 奠 定 了 基 础 。 1 材 料 与 方 法 1 1 病 原 菌 的 分 离 与 培 养 于 北 京 延 庆 区 四 海 镇 万 寿 菊 发 病 温 室 内 ， 采 集 万 寿 菊 发 病 植 株 枝 条 ， 装 入 干 净 的 保 鲜 袋 中 带 回 实 验 室 ， 于 4 冷 藏 箱 中 保 存 备 用 。 将 其 叶 片 去 除 ， 用 自 来 水 刷 洗 枝 条 表 面 ， 并 将 其 剪 成 3 5c m 的 茎 段 。 依 次 用 70% 乙 醇 浸 泡 3 m i n ， 1% 次 氯 酸 钠 浸 泡 3 m i n 对 茎 段 表 面 消 毒 ， 最 后 无 菌 水 冲 洗 干 净 后 ， 在 超 净 台 中 剥 去 枝 条 外 皮 层 ， 内 部 组 织 切 成 0.2 0.3 c m 12 · · 201 8 年 第 4 期 C H I N A P L A N T P R O T E C T I O N 201 8 , V o l 3 8 N o 4 小 块 ， 分 别 放 置 到 6 cm PDA 培 养 基 平 板 中 心 ， 于 25 进 行 恒 温 培 养 。 待 菌 丝 生 长 至 满 培 养 皿 时 ， 转 入 L/ D=12 h /12 h 光 暗 交 替 培 养 箱 进 行 孢 子 诱 发 。 诱 发 的 孢 子 用 无 菌 水 冲 洗 下 来 ， 取 少 量 涂 布 于 新 的 PDA 培 养 基 中 ， 在 超 净 台 无 菌 环 境 于 显 微 镜 下 挑 取 单 孢 子 。 单 孢 子 于 PDA 培 养 基 继 续 培 养 出 菌 丝 及 孢 子 后 ， 在 显 微 镜 下 观 察 孢 子 梗 、 孢 子 等 形 态 特 征 ， 并 拍 照 。 1 2 万 寿 菊 培 养 与 快 速 致 病 性 检 测 将 万 寿 菊 种 子 撒 播 于 草 炭 蛭 石 （ 11）基 质 中 ，覆 盖 透 明 塑 料 布 保 湿 ， 置 于 植 物 培 养 箱 中 ， 25 下 于 L/ / D= 16h / / 8h 光 暗 交 替 培 养 ，待 种 子 发 芽 后 去 掉 塑 料 布 。 种 子 苗 长 至 3 5片 真 叶 时 ，移 栽 入 10cm 穴 盘 中 ，于 温 室 中 进 行 正 常 培 养 。 待 植 株 生 长 至 15cm 左 右 高 时 ，采 取 羽 状 复 叶 进 行 分 离 物 致 病 性 的 快 速 检 测 。 离 体 叶 片 快 速 检 测 的 步 骤 ： 9cm 培 养 皿 铺 3层 灭 菌 滤 纸 ， 喷 洒 无 菌 水 至 滤 纸 湿 透 ； 剪 取 新 鲜 万 寿 菊 叶 片 ， 除 去 顶 部 小 叶 至 刚 好 能 放 入 培 养 皿 中 ； 取 少 量 带 有 （ 病 菌 ） 菌 丝 的 培 养 基 块 ， 放 置 于 叶 片 叶 柄 基 部 ， 盖 上 培 养 皿 保 湿 ， 在 25 恒 温 培 养 箱 培 养 。 以 湿 润 的 无 菌 棉 球 替 换 菌 块 做 阴 性 对 照 ， 每 个 处 理 设 置 3个 生 物 学 重 复 。 1 3 D N A 提 取 与 基 因 测 序 冻 融 法 快 速 提 取 单 孢 系 菌 丝 DNA： 无 菌 枪 头 挑 取 少 量 新 鲜 菌 丝 ， 置 于 预 装 有 100 L无 菌 水 的 1.5 m L离 心 管 中 ， 涡 旋 振 荡 使 菌 丝 松 散 ； 沸 水 浴 5 10 m i n ， 迅 速 置 于 液 氮 中 冷 冻 3 5 m i n ； 室 温 解 冻 ， 12 000 r /m i n 离 心 5 m i n ， 上 清 液 即 DNA 溶 液 ， 可 直 接 做 PCR 扩 增 的 模 板 ， 用 于 扩 增 g 3p d h 、 h s p 60及 r b p 2基 因 片 段 的 引 物 序 列 7 。 20 L的 PCR反 应 体 系 ： Vaz y m e 2× m i x 10 L （ 南 京 诺 唯 赞 生 物 科 技 有 限 公 司 ） ， 上 下 游 引 物 各 0.5 L（ 10 m o l /L） ， 模 板 9 L。 PCR产 物 用 1%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 ， 预 期 条 带 经 纯 化 回 收 后 连 接 于 克 隆 载 体 p G EM T- e as y （ Pr o m e g a， U SA） ， 并 转 化 大 肠 杆 菌 DH5 ， 阳 性 克 隆 送 生 工 生 物 （ 上 海 ） 股 份 有 限 公 司 测 序 。 1 4 序 列 分 析 与 进 化 树 构 建 测 序 结 果 利 用 DNA St ar 5.01软 件 进 行 拼 接 和 初 步 处 理 。 3个 基 因 序 列 按 g 3p d h 、 h s p 60、 r b p 2的 顺 序 依 次 拼 接 成 一 个 聚 合 序 列 ， 两 端 及 不 同 序 列 间 加 保 护 性 碱 基 区 分 。 Cl u s x t al 1.83软 件 进 行 序 列 的 比 对 分 析 ， 采 用 MEG A 4.0软 件 中 的 邻 接 法 （ Ne i g h bo r - Jo i n i n g ， NJ） 法 构 建 不 同 株 系 基 于 3基 因 的 系 统 进 化 树 ， 靴 带 值 （ Bo o t s t r ap v al u e ） 设 置 为 1 000。 参 与 进 化 树 构 建 的 其 他 葡 萄 孢 属 菌 株 的 G 3D P H 、 H S P 60及 R B P 2基 因 序 列 均 下 载 自 美 国 国 立 生 物 技 术 信 息 中 心 （ Nat i o n al Ce n t e r f o r Bi o t e ch n o l o g y I n f o r m at i o n ， NCBI ） 数 据 库 ， 各 序 列 G e n Ban k 收 录 号 、 菌 株 号 、 拉 丁 名 等 信 息 见 表 1。 2 结 果 与 分 析 2 1 万 寿 菊 灰 霉 病 病 害 特 征 北 京 延 庆 区 万 寿 菊 杂 交 制 种 温 室 发 生 的 万 寿 菊 灰 霉 病 在 感 染 初 期 ， 其 症 状 主 要 表 现 为 部 分 叶 片 顶 部 黄 化 并 出 现 水 渍 状 枯 斑 （ 图 1a） ， 随 着 病 情 的 发 展 ， 整 个 叶 片 萎 蔫 ， 逐 渐 在 茎 秆 上 近 叶 柄 基 础 处 可 见 黑 色 条 斑 （ 图 1b） ， 进 一 步 发 展 为 整 个 枝 条 的 萎 蔫 （ 图 1c） ， 最 终 整 个 枝 条 甚 至 整 株 枯 萎 死 亡 （ 图 1d） 。 病 害 在 多 个 制 种 温 室 普 遍 发 生 ， 初 步 统 计 ， 8月 下 旬 ， 伴 有 整 枝 或 整 株 枯 死 的 植 株 在 25%左 右 。 此 时 为 杂 交 制 种 的 关 键 期 ， 病 害 发 生 对 种 子 产 量 和 品 质 造 成 了 较 大 影 响 。 2 2 病 原 菌 的 分 离 与 致 病 性 检 测 从 带 病 的 万 寿 菊 枝 条 分 离 得 到 3个 分 离 物 。 其 分 离 物 进 一 步 通 过 挑 单 孢 子 ， 得 到 6个 单 孢 系 。 获 得 的 单 孢 系 采 用 离 体 叶 片 侵 染 的 方 法 进 行 检 测 ， 在 接 种 后 的 3 4 d内 均 可 见 明 显 水 渍 状 枯 死 斑 ， 并 由 靠 近 叶 柄 的 小 叶 逐 渐 发 展 至 整 个 叶 片 。 这 种 水 渍 状 枯 死 斑 与 田 间 发 现 的 叶 尖 部 枯 死 斑 类 似 （ 图 2） ， 而 对 照 未 发 现 类 似 枯 死 斑 （ 图 2CK） ， 表 明 本 研 究 分 离 获 得 的 即 为 田 间 病 害 的 病 原 菌 。 2 3 病 原 菌 形 态 特 征 分 离 自 万 寿 菊 的 病 原 菌 接 种 于 6 cm PDA 平 板 培 养 基 ， 于 生 化 培 养 箱 中 25 恒 温 培 养 2 d， 白 色 雾 状 菌 丝 可 覆 盖 1/2平 板 ， 继 续 培 养 1 2 d可 覆 盖 整 个 培 养 皿 （ 图 3a） 。 菌 丝 移 至 光 暗 交 替 环 境 中 继 续 培 养 5 7d， 长 出 分 生 孢 子 （ 图 3b） 。 分 生 孢 子 为 近 无 色 ， 呈 倒 卵 型 ， 单 孢 ， 大 小 为 （ 11.16 19.73） m × （ 6.99 8.55） m 。 孢 子 梗 为 多 枝 簇 生 ， 直 立 或 稍 弯 曲 ， 长 为 3 4 m m （ 图 3c） 。 长 满 菌 丝 的 培 养 皿 继 续 培 养 ， 会 生 长 出 黑 色 菌 核 （ 图 3d） ， 菌 核 大 小 不 一 。 基 于 以 上 特 征 ， 推 测 为 葡 萄 孢 属 灰 葡 萄 孢 （ B .c i n e r e a ） 或 13 · · 201 8 年 第 4 期 C H I N A P L A N T P R O T E C T I O N 201 8 , V o l 3 8 N o 4 a .叶 片 水 渍 状 枯 死 b .茎 秆 黑 色 条 斑 c .枝 条 萎 蔫 d .整 株 枯 死 图 1 北 京 延 庆 地 区 万 寿 菊 灰 霉 病 发 病 特 征 a c .菌 丝 侵 染 C K .阴 性 对 照 图 2 分 离 自 北 京 万 寿 菊 上 的 灰 霉 病 分 离 物 离 体 侵 染 实 验 其 近 源 种 B . p e l a r g o n i i 。 其 据 孢 子 形 态 上 极 难 分 辨 ， 需 进 行 进 一 步 分 子 鉴 定 。 2 4 分 子 鉴 定 选 取 最 具 代 表 性 的 单 孢 系 ， 利 用 文 献 报 道 的 通 用 引 物 ， 对 其 g 3 p d h 、 h s p 6 0、 r b p 2等 3个 基 因 片 段 进 行 了 克 隆 和 测 序 。 获 得 的 序 列 在 G e n B a n k 进 行 了 登 录 ， 登 录 号 分 别 为 M F 174048、 M F 174047和 M F - 174046。 基 于 3个 基 因 片 段 聚 合 序 列 ， 构 建 了 葡 萄 孢 14 · · 201 8 年 第 4 期 C H I N A P L A N T P R O T E C T I O N 201 8 , V o l 3 8 N o 4 a . 菌 丝 b . 分 生 孢 子 c . 分 生 孢 子 梗 d . 菌 核 图 3 分 离 自 北 京 万 寿 菊 上 的 灰 霉 病 分 离 物 形 态 特 征 属 2 9 个 种 与 本 研 究 分 离 物 的 系 统 进 化 树 。 从 进 化 树 中 清 晰 看 出 ， 本 研 究 中 分 离 的 万 寿 菊 灰 霉 病 病 原 菌 与 B . c i n e r e a 关 系 最 近 ， 进 一 步 表 明 ， 本 研 究 在 延 庆 温 室 万 寿 菊 上 发 现 的 灰 霉 病 病 原 菌 为 灰 葡 萄 孢 ， 这 与 孢 子 形 态 观 察 的 结 果 一 致 。 3 结 论 与 讨 论 灰 霉 病 为 植 物 常 见 病 害 ， 在 万 寿 菊 大 田 栽 培 中 也 时 有 发 生 ， 一 般 发 病 于 夏 末 秋 初 天 气 冷 凉 ， 多 雨 高 湿 时 期 。 田 间 万 寿 菊 灰 霉 病 主 要 表 现 为 枝 叶 萎 蔫 ， 严 重 时 整 枝 、 整 株 都 会 枯 萎 死 亡 。 在 湿 度 较 大 时 ， 枯 死 枝 条 和 花 朵 上 可 见 灰 色 的 孢 子 层 ， 而 孢 子 层 也 往 往 作 为 鉴 别 灰 霉 病 重 要 表 观 特 征 。 本 次 发 现 的 病 害 发 生 于 延 庆 四 海 万 寿 菊 制 种 温 室 内 ， 病 害 特 征 与 田 间 类 似 ， 但 较 田 间 发 病 期 稍 早 ， 且 未 见 明 显 灰 霉 层 特 征 ， 这 可 能 与 发 病 时 期 以 及 温 室 内 的 特 殊 小 气 候 环 境 有 关 。 在 延 庆 四 海 镇 万 寿 菊 种 植 区 ， 灰 霉 病 暴 发 时 多 伴 有 万 寿 菊 黑 斑 病 的 发 生 ， 由 于 病 晚 期 枝 条 黑 褐 色 枯 死 等 症 状 与 黑 斑 病 后 期 症 状 类 似 ， 容 易 忽 视 而 误 诊 为 黑 斑 病 ， 导 致 防 治 方 法 不 对 ， 防 治 效 果 不 明 显 。 研 究 表 明 ， 在 其 他 农 作 物 中 ， 灰 霉 病 病 原 菌 主 要 通 过 伤 口 或 枯 死 组 织 8 或 残 留 花 瓣 和 柱 头 等 9 侵 入 植 物 ， 逐 渐 发 展 至 全 株 。 而 万 寿 菊 黑 斑 病 造 成 的 枯 死 斑 也 为 灰 霉 病 侵 入 和 发 展 创 造 了 便 利 条 件 。 准 确 鉴 定 病 原 菌 是 制 定 有 效 防 治 策 略 的 前 提 条 件 。 引 起 植 物 灰 霉 病 的 病 原 菌 种 类 较 多 ， 均 属 核 盘 菌 葡 萄 孢 属 。 菌 丝 、 孢 子 等 形 态 特 征 是 鉴 别 真 菌 类 型 最 主 要 的 依 据 ， 但 有 些 相 近 菌 种 形 态 特 征 较 为 相 似 ， 难 以 仅 依 靠 形 态 特 征 区 分 。 使 用 分 子 检 测 技 术 可 以 从 基 因 层 面 检 测 菌 种 甚 至 菌 系 间 的 微 小 差 异 ， 相 对 形 态 鉴 定 更 为 准 确 、 快 速 。 为 鉴 定 四 海 万 寿 菊 制 种 圃 灰 霉 病 病 原 ， 本 团 队 对 病 原 菌 进 行 了 分 离 ， 并 通 过 离 体 叶 片 进 行 了 侵 染 性 检 测 等 ， 最 终 确 定 了 病 原 并 基 本 确 定 其 为 核 盘 菌 科 葡 萄 孢 属 。 进 一 步 通 过 分 子 检 测 方 法 ， 确 诊 病 原 为 葡 萄 孢 属 的 灰 葡 萄 孢 菌 （ B . c i n e a e a ） 。 灰 葡 萄 孢 是 一 种 常 见 的 植 物 致 病 病 原 菌 ， 也 是 葡 萄 孢 属 中 已 知 的 寄 主 范 围 最 广 的 种 ， 可 以 侵 染 2 0 0 种 以 上 植 物 1 0 ， 造 成 病 原 菌 清 除 困 难 ， 防 治 效 果 不 理 想 。 在 2 0 1 2 年 评 选 的 1 0 大 病 害 真 菌 中 ， 灰 葡 萄 孢 排 于 第 2 位 1 1 ， 可 见 其 危 害 之 大 。 本 研 究 基 于 其 形 态 和 分 子 特 征 ， 对 普 遍 发 生 于 万 寿 菊 制 种 温 室 内 的 灰 霉 病 病 原 菌 进 行 了 鉴 定 ， 为 针 对 性 制 定 科 学 合 1 5 · · 201 8 年 第 4 期 C H I N A P L A N T P R O T E C T I O N 201 8 , V o l 3 8 N o 4 B . b y s s o i d e a B . n a r c i s s i c o l a B . d r a y t o n i i B . p o l y b l a s t i s B . g l o b o s a B . s p h a e r o s p e r m a 62 99 67 99 99 99 97 99 99 99 99 8 1 B . t u l i p a e B . c r o c i B . h y a c i n t h i B . g a l a n t h i n a B . c a r o l i n i a n a B . f a b i o p s i s b o t r y t i s f r o m t a g e t i c a 54 20 75 92 99 99 55 99 99 79 97 8 3 93 99 B o t r y t i s s i n o a l l i i B . r a n u n c u l i B . f i c a r i a r u m B . d e w e y a e B . e l l i p t i c a B . s q u a m o s a B . c o n v o l u t a B . a c l a d a B . a l l i i B . p o r r i B . p a e o n i a e B . s i n o v i t i c o l a B . c a l t h a e B . p s e u d o c i n e r e a B . f a b a e B . p e l a r g o n i i B . c i n e r e a 0.005 图 4 基 于 三 基 因 整 合 序 列 的 B o t r y t i s 属 真 菌 系 统 发 育 树 理 预 防 措 施 奠 定 了 基 础 。 参 考 文 献 1 蒲 丽 ， 康 占 海 ， 蒋 家 珍 ， 等 . Si O 2 作 为 杀 菌 剂 防 治 黄 瓜 灰 霉 病 的 研 究 J . 植 物 病 理 学 报 ， 2005（ s 1） ： 18 6-18 8 . 2 Va g e l a s I， Pa p a c h a t z i s A， Ka l o r i z o u H， e t a l . Bi o l o g i c a l c o n t r o l o f B o t r y t i s f r u i t r o t （ g r a y m o l d ） o n s t r a w b e r r y a n d r e d p e p p e r f r u i t s b y o l i v e o i l m Mi l l w a s t e w a t e r J . Bi o t e c h n o l o g y a n d Bi o t e c h n o l o g i c a l Eq u i p m e n t ， 2009， 23 （ 4） ： 148 9-1491. 3 张 玮 ，乔 广 行 ，黄 金 宝 ，等 . 中 国 葡 萄 灰 霉 病 菌 对 嘧 霉 胺 的 抗 药 性 检 测 J . 中 国 农 业 科 学 ， 2013， 46（ 6） ： 1208-1212. 4 毛 胜 凤 ， 周 湘 ， 范 闻 春 ， 等 . 喜 树 碱 对 番 茄 灰 霉 病 菌 的 毒 理 效 应 J . 浙 江 农 林 大 学 学 报 ， 2015， 32（ 4） ： 58 5-58 9. 5 张 建 国 ， 姬 延 伟 . 花 卉 灰 霉 病 的 症 状 表 现 与 综 合 防 治 J . 中 国 植 保 导 刊 ， 2004， 24（ 4） ： 28 -29. 6 范 璇 . 主 要 果 蔬 作 物 灰 霉 病 菌 分 子 检 测 及 鉴 定 研 究 D . 武 汉 ： 华 中 农 业 大 学 ， 2015. 7 St a a t s M， Va n Ba a r l e n P， Va n Ka n J A L. Mo l e c u l a r p h y l o g e n y o f t h e p l a n t p a t h o g e n i c g e n u s B o t r y t i s a n d t h e e v o l u t i o n o f h o s t s p e c i f i c i t y J . Mo l e c u l a r Bi o l o g y a n d Ev o l u t i o n ， 2005， 22（ 2） ： 333-346. 8 赵 杨 ， 苗 则 彦 ， 李 颖 ， 等 . 番 茄 灰 霉 病 防 治 研 究 进 展 J . 中 国 植 保 导 刊 ，