解淀粉芽孢杆菌B6在番茄根部定殖及对番茄枯萎病盆栽防效初步研究.pdf

<p> 018年第 期 I I 0 18,. 8 . 解淀粉芽孢杆菌 （ Bacillus amyloliquefaciens ） 是 一类重要的植物根际益生菌 ， 能够促进植物生长或 防治土传病害 1 。 其基因组中 10 的基因参与抗菌 素的合成 ， 能够直接抑制土壤中多种病原微生物的 生长 2 ， 细胞内合成的一些挥发性次级代谢产物 ， 例 如 3-羟基丁酮 、 2-氨基苯甲酸及脂肽等 ， 还可以作为 激活因子诱导植物产生免疫反应 3 -4 ， 增强植物对病 原微生物的抗性 。 此外 ，喷施解淀粉芽孢杆菌菌剂后 几乎不会影响根际土壤中微生物群落组成 5 。 因此 ， 解淀粉芽孢杆菌是重要的绿色生防菌剂候选菌株 。 已有的研究表明 ， 一些具有生物防治作用的解淀粉 芽孢杆菌能够在小麦 1 、 白菜 、 烟草 6 及香蕉 7 等植物 解淀粉芽孢杆菌 B6 在番茄根部定殖及 对番茄枯萎病盆栽防效初步研究 王 静 ， 宁燕夏 ， 李黄维 ， 刘 娜 ， 邱佳俊 （ 北方民族大学生物科学与工程学院 ， 宁夏银川 750021 ） 摘要 ： 采用利福平选择标记解淀粉芽孢杆菌 B6 ， 于土培及水培条件下研究其在番茄根部定殖情况及对番茄枯萎病 的防治效果 。 结果表明 ，番茄种子出芽后 4 19 d ， 根表及根际均能成功检测标记菌株 B6 R 。 在根表 ， 标记菌株 B6 R 定殖 密度 4 d 时达最高 ， 后逐渐下降 ， 16 19 d 稳定在 7.40× 10 5 cfu/g 。 在根际 ， 标记菌株 B6 R 定殖密度先升高后降低 ， 菌体 数量稳定在 2.53× 10 6 cfu/g 。 水培条件下 ， 能够观察到标记菌株 B6 R 在番茄根部附着定殖 。 室内盆栽试验显示 ， 解淀粉 芽孢杆菌 B6 能够较好防治尖孢镰刀菌引起的番茄枯萎病 ， 防治效果达 64 . 35 。 关键词 ： 解淀粉芽孢杆菌 ； 定殖 ； 番茄枯萎病 ； 防效 中图分类号 ： 482.292 文献标识码 ： A 文章编号 ： 1672-6820 （ 2018 ） 03-0019-05 收稿日期 ： 2017-07-12 ； 修回日期 ： 2018-01-03 基金项目 ： 宁夏高等学校科学技术研究项目 （ GY2016138 ）； 北方民族大学人才引进启动项目 （ 4400302550 ）； 宁夏科技支撑计划项目 （ 重大 专项 ）（ 宁科技字 （ 2015 ） 26 号 ） 作者简介 ： 王静 ， 博士 ， 讲师 ， 研究方向为植物逆境生物学 。 - mail ： wangjing_imu163 .com 。 e u z Bacillus amyloliquefaciens ee Fusarium w Wang ing, ing Yanxia, Li Huangwei, Liu a, Qiu iajun （ ollege of biological science and engineering, orth Minzu University, Yinchuan ingxia 750021, hina ） : olonization of Bacillus amyloliquefaciens B6 in tomato roots in soil and hydroponic system condition were studied by marker of rifampicin resistant mutant, and its controlling efficiency against tomato Fusarium wilt were assessed. The results showed that B6 R could colonize effectively on tomato roots surface and rhizosphere between 4 d to 19 d after sprouting. On root surface, the colonization density reached the highest level on 4 th day after sprouting, and then declined, and between 16 d to 19 d, quantity of B6 R maintained 7.40 × 10 5 cfu/g, and the colonization density on rhizosphere maintained 2.53 × 10 6 cfu/g. n hydroponic system, B6 R was also well colonized on tomato root. Based on pot experiment in lab, B6 strain showed good controlling efficiency of 64.35 against tomato Fusarium wilt. e w: Bacillus amyloliquefaciens ; colonization; Fusarium wilt; control efficiency 19 · · 018 年第 期 I I 0 1 8,. 8 . 根际成功定殖 。 其在植物根际定殖能力的强弱决定 着其作用效果的高低 ， 检测微生物在植物根际的定 殖行为是确定生防菌株防治潜力的重要依据 6 。 番茄枯萎病是由番茄专化型尖孢镰刀菌 （ F . oxysporum f . sp . lycopersicisnyderetet Hansen ） 侵染所 引起的土传性病害 。 其主要为害番茄的根 、 茎部 ， 大 量繁殖后 ， 阻塞维管束 ， 阻止根部向上输送水和营养 物质 ， 致使植株缺乏水分和营养而死亡 ， 是威胁番茄 产量和品质的主要病害之一 8 。 解淀粉芽孢杆菌 B6 是本课题组前期筛选获得的对尖孢镰刀菌具有良好 拮抗作用的细菌 。 笔者研究了该菌在番茄根部的定 殖能力及对番茄枯萎病的防治效果 ， 以期为其商业 化应用奠定理论基础 。 1 材料与方法 1 .1 试验材料 解淀粉芽孢杆菌 （ Bacillus amyloliquefaciens ） B6 和番茄枯萎病菌 （ F . oxysporum f . sp . lycoper - sicisnyderetet Hansen ） 均由本实验室保存 。 番茄种子 （ 毛粉 1号 ） 为宁夏地区栽培品种 。 1 . 标记菌株 的筛选及遗传稳定性鉴定 将解淀粉芽孢杆菌 B6划线接种于含 5 g/mL 利福平的 LB 上 ， 待长出菌落后 ， 转入下一个高浓度 利福平 LB 培养基 ， 渐进浓度为 10、 20、 40、 60、 80、 100 、 200 、 300 g/mL 。 直至筛选出能够在含 300 g/ mL 利福平的 LB 培养基上稳定生长 ， 且对致病菌拮 抗作用不变的标记菌株 B6 R 。 取标记菌株 B6 R 单菌落 ， 接种于不含利福平的 10 mL LB 培养基 ， 28 ， 150 r/min ， 培养 12 h ， 从中 取 10 L 培养液转接至不含利福平的 LB 培养基 ， 同 样条件 ， 培养 12 h ， 以此类推 ， 连续转接培养 8次后 ， 取 100 L 培养液 ，涂布于不含利福平的 LB 平板 ， 28 ， 倒置培养 24 h 。 随机选 100 个 B6单菌落划线接 种于含 300 g/mL 利福平的 LB 平板 ， 以抗性菌株所 占百分比计算标记菌株 B6 R 的遗传稳定性 。 1 . 标记菌株 在番茄根部的的定殖能力检测 取标记菌株 B6 R 单菌落接种于 10 mL 含 300 g/mL 利福平的 LB 培养基中 ， 28 ， 150 r/min ， 培 养 12 h 。 取其 1 mL 培养液接种于含 300 g/mL 利 福平 100 mL LB 培养基扩大培养 ， 28 ， 150 r/min ， 培养 24 h ， 血球计数板计数 ， 调整菌体浓度为 1× 10 8 cfu/mL ， 待用 。 用升汞对番茄种子 表面消毒 ， 无 菌水 冲洗 8次 ， 30 温 水 浴催 芽 2 h 后 ， 在 铺 有 5层无 菌 滤纸 的 15 cm 培养 皿 中 28 培养至出芽 。 培养基质 经 180 干热灭 菌 3 h ， 晾凉 后 装 入直 径 为 8 cm 育苗盆 中 （ 100 g/ 盆 ）。 将出芽的番茄种子平 铺 于基质 表面 ， 在 种子 周围浇灌 1 mL 标记菌株 B6 R 培养菌液 （ 1× 10 8 cfu/mL ）， 覆盖 0. 5 cm 厚 的基质 。 将 育苗盆放 入 光照 培养 箱 培养 ， 培养条件为 28 下 光照 12 h ， 22 下 黑暗 12 h 。 施加无 菌水为 阴 性对 照 。 待番茄出芽 4 d 后 采 样 ， 每 3 d 取样 1次 ， 连续 取 6次 。 分 别 取根际土 、 根 表 土测定标记菌株 B6 R 菌 数 。 取根际土 ： 从 育苗盆 培养基质中取出 幼苗 ， 抖 动 根部 ， 收集 土 壤 ， 称 重后置于含有 10 mL 无 菌水 三角瓶 中 ， 100 r/min ， 振荡 30 min ， 此 溶 液为根际土 溶 液 。 取根 表 土 ： 将 已采集过 根际土的植株 ， 剪 其 表面带 土的根 系 ， 准 确 称 重 ， 后 放 入含有 10 mL 无 菌水的 三角瓶 中 ， 100 r/min ， 振荡 30 min ， 取出根 系 ， 吸干 ， 再 次 称 重 ， 两 次质量 差值 为根 表 土重量 ， 溶 液 为根 表 土 溶 液 。 将 三角瓶 中的 溶 液 摇匀 后 ， 取 1 mL 溶 液 ， 逐级稀释 5次 。 取 各级稀释溶 液 10 L 点到 含有 300 g/mL 利福平的 LB 培养基上 ， 重 复 6次 ， 28 培养 24 h ， 统 计菌落数 ， 计算定殖 密 度 （ D ）。 D = （ N j × 稀释倍 数 ） /Z 式 中 ： D 为 1 g 土中含有标记菌株 B6 R 菌数 （ cfu/g ）； N j 为同一 稀释 浓度 6次重 复 的平均菌落 数 ； Z 为根际 （ 根 表 ） 土质量 （ g ）。 1 .4 标记菌株 在水培番茄根部的的定殖检测 采 用 Hoagland 营养液培养番茄 幼苗 。 将 露白 番 茄种子 播 种于 72孔 1. 5 mL 冻 存 盒表面 ， 盒内装已 灭 菌 Hoagland 营养液 ， 盖盖 保 湿 ， 置于培养 箱 培养 7 d ， 待 幼苗 长出 真叶 后 ， 开盖 培养 7 d 。 取 B6 R 单菌落 接种于 10 mL 含 300 g/mL 利福平的 LB 培养基 中 ， 28 ， 150 r/min ， 培养 12 h ， 取 1 mL 培养液接种 于 100 mL 含 300 g/mL 利福平 LB 培养基扩大培 养 ， 28 ， 150 r/min ， 培养 24 h 后 ， 收集 菌体 ， 无 菌水 漂洗 菌体 3次 ， 调 节 菌体浓度为 1× 10 8 cfu/mL ， 待用 。 将番茄 幼苗 根部 浸泡 于枯萎病病菌菌液中 ， 室 温静 置 15 min ， 滤纸吸干表面 液体 ， 重 新 将 幼苗 置 20 · · 018 年第 期 I I 0 18 ,. 8 . B6 B6 R B6 R 无菌水 图 1 解淀粉芽孢杆菌 （ B. amyloliquefaciens ） 与 皿内拮抗致病菌效果 类别 4 d 7 d 10 d 13 d 16 d 19 d 根表 9.56 5.85 2.56 1.26 0.67 0.74 根际 3.52 5.63 4.42 1.25 1.37 2.53 表 1 解淀粉芽孢杆菌 （ B. amyloliquefaciens ） 标记菌株 在番茄根表土及根际土的定殖密度 × 10 6 cfu/g a b a. 未接种标记菌株 b. 接种标记菌株 图 解淀粉芽孢杆菌 （ B. amyloliquefaciens ） 标记菌株 在番茄根部的定殖 于 Hoagland 营养液中液体培养 。 接种 5 d 后 ， 剪取 根系 ， 无菌水漂洗 3次 ， 滤纸吸干 ， 将其按压于含 300 g / mL 利福平 LB 培养基进行组织印记 ， 随机 选取 3个菌落进行拮抗验证试验 ， 显微镜下观察标 记菌株 B6 R 在番茄根部定殖情况 。 1 .5 盆栽试验 解淀粉芽孢杆菌 B6经活化及扩大培养后 ， 调 节菌体浓度至 1× 10 8 cfu/mL ， 待用 。 选取番茄种子消 毒并催芽后 ， 每盆播种 2 粒种子于装有灭菌基质的 育苗盆 （ d =8 cm ） 中 ， 灭菌土与致病菌按照 30 :1（ W/ V ） 比例混合 。 向播种后在种子周围施加 1 mL B6 培 养液 （ 1× 10 8 cfu/mL ）， 以施加无菌水作为阴性对照 。 温室中培养 40 d 后观察番茄幼苗发病情况 。 番茄枯 萎病病情分级标准 9 ： 0 级 ， 无症状 ； 1级 ， 1片或 2 片 叶子明显变黄 ； 2 级 ， 3片或 4片真叶变黄 ， 叶片萎蔫 下垂 ； 3级 ， 5片或 6片真叶变黄或真叶萎蔫下垂 ； 4 级 ， 全株严重萎蔫 ， 以致枯死 。 计算病情指数和相对 防治效果 。 试验重复 3次 。 病情指数 = （ 病级株数 × 代表级数 ） /（ 植株总 数 × 最高代表级数 4） × 100 相对防治效果 （ ） = （ 对照病情指数 -B6处理 病情指数 ） /对照病情指数 × 100 结果与分析 .1 标记菌株 的筛选及遗传稳定性 逐步提高利福平浓度 ， 获得能够在 300 g/mL LB 培养基生长的标记菌株 B6 R ， 在 A 平板上与原 始菌 B6具有相同的拮抗致病菌的效果 （ 图 1）。 经不 含利福平的 LB 液体培养基连续转接 8 次的标记菌 株 B6 R ， 涂布于 LB 培养基上 ， 随机挑取 100 个菌落 ， 均可以在含有 300 g/mL LB 培养基中正常生长 ， 可 见标记菌株 B6 R 的利福平标记稳定性强 。 . 标记菌株 在番茄根部的的定殖能力 经 B6 R 菌液浇灌番茄种子 ， 出芽后检测其在番 茄幼苗根表土及根际土中的含量 。 出芽 4 d 后 ， 番茄 幼苗根表土 B6 R 含量最高 ， 达 9.56 × 10 6 cfu/g ， 随后菌 体数量逐渐下降 ， 出芽后 16 d ， 菌体数量稳定存在 ， 维持在 10 5 cfu/g 。 根际土中 B6 R 含量呈先增加后减 少趋势 ， 最终稳定在 10 6 cfu/g 。 . 标记菌株 在水培番茄根部的的定殖检测 水培番茄幼苗 ， 标记菌株 B6 R 浸根后 ， 继 续培 养 。 如 图 2a 所示 ， 未接种标记菌株 B6 R 的番茄幼苗 根表 光滑 ， 轮廓清晰 。 接种标记菌株 B6 R 的番茄幼苗 根表有明显的 细 菌 斑块附着 ， 如 图 2b 所示 。 经根部 组织印记 实 验 ， 根部 附着 菌可在 300 g/mL 利 福平 LB 培养基生长 ， 且 与 B6具有相同拮抗致病菌作用 ， 如 图 3所示 ， 根部 附着 菌为标记菌株 B6 R 。 .4 对盆栽番茄枯萎病的防治效果 浇灌无菌水对照幼苗 （ K ） 的病情指数为 21 · · 018 年第 期 I I 0 1 8,. 8 . 图 解淀粉芽孢杆菌 （ B. amyloliquefaciens ） 与 水培番茄根部附着菌拮抗致病菌效果 （ 44.51± 2.1）， 浇灌 B6菌液幼苗的病情指数为 （ 15.85± 1.3）， 防治效果为 64.35 。 可见 ， 解淀粉芽孢 杆菌 B6能够较好的防治番茄枯萎病 （ 图 3）。 讨论 植物根系能够分泌多种氨基酸 、 糖以及有机酸 等营养物质 ， 为微生物生长提供了优良的环境 10 。 生 防菌利用营养物质在植物根部大量定殖是发挥其生 防作用的先决条件 ， 对土传病害的有效防治至关重 要 。 目前 ， 研究微生物在植物根际的定殖行为以及能 力 ， 可以通过抗生素选择标记 、 GF 荧光标记 11 以及 转座子标签 12 等方法 。 本研究采用抗生素利福平标 记 ， 研究前期实验中获得的解淀粉芽孢杆菌 B6在 番茄根部的定殖行为 。 利福平抗生素标记菌 B6 R 经 多代繁殖后 ， 抗生素标记仍稳定存在 。 通过 300 g/ mL 利福平筛选 ， 极易对土样中 B6 R 计数 ， 施加 B6 R 26 d 后 ， 番茄根表及根际土中 B6 R 定殖密度分别为 7.40× 10 5 及 2.53× 10 6 cfu/g ， B6 R 成功定殖 。 水培试验 中 ， 同样能够看到番茄根部附着菌斑 。 若采用 GF 标记目的菌株 ， 荧光显微镜下更易观察 ， 这是较抗生 素标记法的方便之处 。 有学者在研究一些植物益生杆菌在根部定殖行 为时发现 ， 施加菌 3个月后 ，菌体密度会迅速降低 13 。 本试验结果显示 ， 标记菌株 B6 R 在番茄根部和根际 土中其含量随时间呈先增加后减少趋势 ， 最终稳定 在 10 6 cfu / g 。 解淀粉芽孢杆菌 B6能够抑制尖孢镰刀菌生 长 ， 盆栽试验中对番茄枯萎病防效达 64.35 ， 具有 较好的防治作用 。 有研究表明 ， 商品化的解淀粉芽孢 杆菌 FZB42T 的基因组中有 10个基因簇参与合成 抗菌类物质 ， 例如环脂肽 、 聚酮化合物以及高度修饰 的细菌素等 5 ， 合成的多种抗菌物质是解淀粉芽孢 杆菌具有广谱抑菌效果的 原 因之一 。 化学 农药滥 用 威胁人 类生 活 ， 对病 、 虫 害的 绿色 防 控越来越受 到重 视 。 目前 ， 全球已开 发 出 多种以根 际植物益生菌为 主 要成分的生防菌 剂 。 B 研究表 明 ， 全球市场 2013年 采 购 生防菌 剂耗资 54.8 千万 美元 ， 2019 年预 计 将 增长至 83.7千万美元 ， 生防菌 剂 对可 持续农业 的发 展起 重要的 促进 作用 14 。 解淀 粉芽孢杆菌 不仅 能够抑制多种病 原 微生物 ， 还 可以 通过发 酵 大量生 产 ， 易 于 商品化 ， 是 开 发生防菌 剂 的 宝贵资源 。 参考文献 1 杨洪凤 ， 余向阳 ， 薛雅蓉 等 . 内 生解淀粉芽孢杆菌 09 在 小麦 根部定殖的 电 镜观察及防病效果 . 中 国 生物防治学 报 ， 2014 ， 30（ 6）： 839-844. 2 hen X H ， Koumoutsi A ， cholz R et al . 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