甘薯褪绿矮化病毒RNaSe3蛋白的原核表达及抗血清制备.pdf
<p> 2 0 1 8 , 4 4 （ 3 ） ： 1 3 8 1 4 1 PlantProtection 研 究 简 报 ReSearchNoteS 收 稿 日 期 ：2017 08 08 修 订 日 期 ：2017 10 09 基 金 项 目 ：国家现代农业甘薯产业技术体系 （ CARS-10-B13 ） ； 河南省农业科学院农业科技创新项目 （豫财贸 2015 131-06 ） ；河南省农业科学 院优秀青年基金 （ 2016YQ14 ） ； 河南省自然科学基金 （ 162300410160 ） ； 河南省重点实验室项目 （ 132300413220 ） * 通信作者 E-mail ： zhangzhenchen 126. com 甘 薯 褪 绿 矮 化 病 毒 RNaSe3 蛋 白 的 原 核 表 达 及 抗 血 清 制 备 秦 艳 红 ，乔奇 ，王爽 ，张 德 胜 ，王 永 江 ，田 雨 婷 ，张 振 臣 * （河南省农业科学院植物保护研究所 ，河南省农作物病虫害防治重点实验室 ， 农业部华北南部作物有害生物综合治理重点实验室 ，郑州450002 ） 摘 要以 本 实 验 室 保 存 的 重 组 质 粒 为 模 板 ， 利 用 PCR 方 法 扩 增 获 得 了 甘 薯 褪 绿 矮 化 病 毒 SPCSV 的 RNase3 基 因 ， RNase3 基 因 由 690 个 核 苷 酸 组 成 ， 编 码 229 个 氨 基 酸 。 将 RNase3 基 因 克 隆 到 原 核 表 达 载 体 pET-28a （ + ） ， 转 化 大 肠 杆 菌 BL21 （ DE3 ） ， 经 IPTG 诱 导 ， 对 诱 导 产 物 进 行 SDS-PAGE 分 析 。 结 果 表 明 ， RNase3 在 大 肠 杆 菌 中 能 高 效 表 达 ， 融 合 蛋 白 分 子 量 约 为 26. 5kD 。 以 表 达 的 融 合 蛋 白 为 抗 原 ， 免 疫 家 兔 ， 制 备 了 SPCSV-RNase3 的 特 异 性 抗 血 清 。 ACP-ELISA 检 测 结 果 表 明 ， 制 备 的 抗 血 清 对 RNase3 融 合 蛋 白 的 效 价 达 10 万 倍 。 关 键 词甘 薯 褪 绿 矮 化 病 毒 ；RNase3 基 因 ；原 核 表 达 ；抗 血 清 中 图 分 类 号 ：S432. 41 文 献 标 识 码 ：A DOI ：10. 16688 j. zwbh. 2017298 Prokar y oticex p ressionofRNase3ofSweet p otato chlorotic stunt virus and p re p arationofitsantiserum QINYanhong ，QIAOQi ，WANGShuang ，ZHANGDesheng ， WANGYongjiang ，TIANYuting ，ZHANGZhenchen （ InstituteofPlantProtestion ， HenanAsademyofAgrisulturalSsienses ， HenanKeyLaboratoryof CropPestControl ， KeyLaboratoryofIntegratedPestManagementonCropsinSouthernPartof NorthChina ， MinistryofAgrisulture ， Zhengzhou 450002 ， China ） Abstract Withtherecombinantplasmidstoredinourlaboratoryastemplate ， RNase3geneofSweetpotatoshlo- rotisstuntvirus （ SPCSV ） wasamplifiedbyPCR.Thefull-lengthRNase3geneconsistsof690ntandencodes229 aminoacidresidues.TheRNase3genewasclonedintoexpressionvectorpET-28a （ + ） forover-expressioninpro- karyoticcells.TherecombinantplasmidpET-RNase3wastransformedintoEssherishiasoli strainBL21 （ DE3 ） competentcells.SDS-PAGEresultshowedthatspecificfusionproteinwiththemolecularweightofabout26. 5kD wasproducedafterinductionbyIPTG ， indicatingthattheRNase3fusionproteinwashighlyexpressedinprokary- oticcells.TheexpressedproteinwaspurifiedfromSDS-PAGEandtheantiserumagainstRNase3 proteinwas raisedinrabbit.ACP-ELISAdetectionindicatedthatthetiterofRNase3antiserumwasover1100000against RNase3fusionprotein. Keywords Sweetpotatoshlorotisstuntvirus ；RNase3gene ；prokaryoticexpression ；antiserum甘薯是重要的粮食作物 、食品加工原料和新型 能源作物 。我国甘薯种植面积位居世界第一 1 。病 毒病对甘薯产业造成很大影响 。研究表明 ，我国甘 薯上至少存在甘薯褪绿矮化病毒 Sweetpotatochlo- roticstuntvirus （ SPCSV ）和甘薯羽状斑驳病毒 Sweetpotatofeatherymottlevirus （ SPFMV ）等 20 余种病毒 2 6 。 SPCSV 与 SPFMV 共同侵染可引起 甘薯复合病毒病 （ Sweetpotatovirusdisease ， SPVD ） ， 44 卷第 3 期 秦艳红等 ：甘薯褪绿矮化病毒 RNase3 蛋白的原核表达及抗血清制备 该病可使甘薯减产 50% 98% ，甚至绝收 7 。 2010 年 ， Qiao 等首次报道了 SPCSV 在我国发生 8 。 2012 年 ，张振臣等首次证明我国甘薯上已发生 SPVD 9 。近年来 ， SPCSV 在我国的发生面积逐渐 扩大 ，在全国范围内迅速蔓延 ，对甘薯的危害日趋严 重 ，是甘薯上危害最严重的病毒之一 。 SPCSV 隶属长线形病毒科 Closteroviridae 毛 形病毒属 Crinivirus ，基因组为两条单链正义 RNA ， RNA1 编码蛋白主要参与病毒的复制 ， RNA2 编码蛋 白主要负责病毒的包装和运输 。 RNA1 上编码的 RNase3 蛋白是其基因沉默抑制子 ， RNase3 蛋白包含 一个核糖核酸内切酶结构域和一个双链 RNA 结合结 构域 ， RNase3 可以抑制由正义 RNA 介导的 RNA 干 扰 （ RNAi ） ， 在体外 ， RNase3 可以将 21 、 22 和 24nt 的 siRNA 切割成 14nt ， RNase3 的核糖核酸内切酶活性 对其沉默抑制活性是必需的 11 。 RNase3 蛋白还能够 增强 p22 蛋白的沉默抑制活性 12 ，研究表明 ， RNase3 单独即可介导 SPCSV 与 SPFMV 等其他病毒的协生 作用 11 。目前 ， 对 SPVD 致病机理方面的研究还较薄 弱 ， 关于 SPCSV 与 SPFMV 等病毒协生作用的分子 机理还不十分清楚 ， 因此 ，本研究针对 SPCSV 编码的 RNase3 这一重要蛋白 ，利用原核表达的策略 ，在大肠 杆菌中表达了 RNase3 的融合蛋白 ，制备了 SPCSV RNase3 的多克隆抗体 。 1 材 料 与 方 法 1. 1 材 料 大肠杆菌 JM109 和 BL21 （ DE3 ）菌株 ，含 RNase3 基因的重组质粒 SPCSV-RNA1-4410-8637-T 10 和 原核表达载体 pET-28a （ + ）均由本实验室保存 ； UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒购自 Axygen 公 司 ；氨苄青霉素 （ Amp ） 、卡那霉素 （ Kan ） 、 IPTG 和 SDS 等购自上海生工生物工程有限公司 ； 质粒小量抽 提试剂盒购自 Omega 生物科技公司 ； ExTaq DNA 聚 合酶 、 限制性内切酶 、 T4DNA 连接酶 、 DNA 分子量标 准和蛋白质分子量标准等购自宝生物工程 （大连 ）有 限公司 ； 其他常用试剂为国产分析纯 。 根据本实验室测定的重组质粒序列 10 ，设计扩 增 RNase3 基因的引物 ，正向引物 RNase3-BamH - 5F 的序列为 5 -CGTGGATCCATGATTCCGATC- TTTTCTGAT-3 ） ，与 RNase3 基因的 1-21nt 位 置对应并引入 BamH 酶切位点 ，反向引物 RNase3- Hind -3R 的序列为 5 -GGCAAGCTTTCAAT- TCAAATTTAGAGCTTCGAC-3 ，与 RNase3 的终 止密码子附近序列互补并引入了 Hind 酶切位点 ， 引物由上海生工生物工程技术有限公司合成 。 1. 2 方 法 1. 2. 1 SPCSVRNase3 基 因 的 PCR 扩 增 以重组质粒 SPCSV-RNA1-4410-8637-T 为模 板 ，以 RNase3-BamH -5F 和 RNase3-Hind -3R 为引物进行 PCR 扩增 。 PCR 反应体系为 ：正 、反向 引物各 1 L ， 2. 5mmol L 的 dNTP 混合物 4 L ， 10× ExTaqbuffer5 L ， ExTaqDNA 聚合酶 0.5 L ， 重组质粒 1 L ， ddH2O37.5 L 。 PCR 反应程序 为 ： 94 预变性 5min ； 94 变性 30s ， 58 退火 30s ， 72 延伸 40 s ，共 30 个循环 ； 72 延伸 10 min 。 PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 ，按照 Axygen 公司 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒的说明书 回收目的片段 。 1. 2. 2 SPCSVRNase3 基 因 原 核 表 达 载 体 的 构 建 及 序 列 测 定将 1.2.1 中的胶回收产物用 BamH 和 Hind 酶切后与相应酶切的 pET-28a （ + ）载体连接 。将 连接产物转化至大肠杆菌 JM109 ，提取质粒 ，经 PCR 扩增和酶切筛选出重组质粒 ，将重组质粒 pET-RNase3 送上海生工生物工程技术有限公司测 序以验证阅读框架的正确性 。 1. 2.3 SPCSVRNase3 蛋 白 的 诱 导 表 达 及 SDS- PAGE 分 析将读框正确的重组质粒 pET-RNase3 及空载体 pET-28a （ + ）转化大肠杆菌 BL21 （ DE3 ） ，挑取单菌 落于 2mLLB 培养液中 （含 100 g mLKan ） ， 37 振荡培养过夜 ，将过夜培养的菌液按 1100 稀释到 新鲜的 LB 培养液中 （含 100 g mLKan ） ，振荡培 养至 OD600 达到 0.6 以上 ，加入 IPTG 至终浓度为 1mmol L ， 于 37 继续诱导 6 8h 。取 1.5mL 培 养液 ， 经 10000r min 离心 1min 收集菌体 ，用 50 L 灭菌 ddH2O 悬浮 ，加入 50 L2× 的样品缓冲液 （ 40mmol LTris-HCl ， 10% 甘油 ， 2%SDS ， 5% 巯基 乙醇 ， 0.1% 溴酚蓝 ， pH 6.8 ） ，颠倒混匀后 ，煮沸 10min ，用 12. 5% 的胶进行 SDS-PAGE 分析 。 1. 2. 4 SPCSVRNase3 抗 血 清 的 制 备 和 效 价 测 定 1. 2. 3 中的原核表达产物经 SDS-PAGE 电泳后 ， 将凝胶用预冷的染色液 （ 0. 25mol LKCl ， 1mmol L · 9 3 1 · 2018 DTT ） 染色至条带清晰 ，切下所需的蛋白条带 ，加入等 体积 0. 85% 的生理盐水 ， 于冰浴中研磨 。 12000r min 离心 5min ，收集上清即为回收到的蛋白 。利用回收 的蛋白免疫家兔 ，经过 6 次免疫后 ，获得抗血清 。利 用 ACP-ELISA 对抗血清进行效价测定 。免疫家兔 等工作由郑州博赛生物技术公司协助完成 。 2 结 果 与 分 析 2. 1 SPCSVRNaSe3 基 因 原 核 表 达 载 体 构 建 及 表 达 产 物 SDS-PAGE 分 析利用 PCR 扩增获得大小约为 690bp 目的条 带 ，将目的片段割胶回收 ，将胶回收产物和 pET-28a （ + ）质粒分别利用 BamH 和 Hind 酶切后进行 连接 ，转化大肠杆菌 JM109 ，菌液 PCR 验证为阳性 的样品 ，提取质粒后再进行酶切鉴定 （图 1a ） ，并送 上海生工生物工程有限公司测序 ，证明阅读框架正 确 ，表明原核表达载体 pET-RNase3 构建成功 。 将 pET-RNase3 和 pET-28a （ + ）分别转化至大 肠杆菌 BL21 （ DE3 ）中 ，利用 IPTG 诱导表达 ，分别 以未诱导的 pET-RNase3 和诱导的 pET-28a （ + ）为 对照 。经过 SDS-PAGE 分析表明 ，含有重组质粒的 工程菌诱导后可产生大小约为 26.5kD 的目的蛋 白 ，而对照没有相应条带 （图 1b ） ，表明 RNase3 在大 肠杆菌中得到了表达 。 图 1 pET-RNaSe3 重 组 质 粒 的 酶 切 鉴 定 及 表 达 产 物 的 SDS-PAGE 电 泳 分 析 Fig. 1 EnzymedigeStionofrecombinantplaSmidpET- RNaSe3andSDS-PAGEanalySiSofexpreSSionproductS 2. 2 SPCSVRNaSe3 抗 血 清 的 制 备 和 效 价 测 定 以纯化的重组蛋白作为抗原免疫家兔 ，经过 6 次免疫后获得了 SPCSV-RNase3 的抗血清 ，以 RNase3 的融合蛋白为抗原 ，利用 ACP-ELISA 对抗血 清的效价进行测定 ， 结果表明 ， 抗血清稀释 100000 倍 后仍能与抗原发生阳性反应 （表 1 ） 。 表 1 ACP-ELISA 测 定 抗 血 清 的 效 价 1 ） Table1 ThetiterofantiSerumteStedbyACP-ELISA 样品稀释倍数 Dilutionmultiple ofsample OD405 重复 1 Repeat1 重复 2 Repeat2 平均 Average I H 检测结果 Detection result 1000 1. 552 1. 274 1. 413 1333 阳性 3000 1.173 1.140 1.157 1076 阳性 5000 1. 028 0. 958 0. 993 913 阳性 10000 0. 925 0. 765 0. 845 765 阳性 30000 0. 791 0. 718 0. 755 674. 5 阳性 50000 0. 645 0. 618 0. 632 551. 5 阳性 100000 0. 606 0. 380 0. 494 413. 5 阳性 阳性对照 Positivecontrol 0. 569 0. 507 0. 538 458 阳性 阴性对照 Negativecontrol 0. 082 0. 080 0. 081 1 阴性 空白对照 Blankcontrol 0. 080 0. 080 0. 080 - -1 ） OD405= 在 405nm 的光吸收值 ； I H= （ 样品平均吸光值 - 空白对 照平均吸光值 ） （ 健康对照平均吸光值 - 空白对照平均吸光值 ） 。 OD405=Absorptionvalueat405nmwavelength ； I H= （ aver- ageabsorptionvalueofsample-averageabsorptionvalueof blankcontrol ） （ averageabsorptionvalueofhealthycontrol- averageabsorptionvalueofblankcontrol ） . 3 讨 论 研究表明 ， SPCSV 可以与多种甘薯病毒发生协 生作用 ，使甘薯的症状加重 ，其他病毒的含量增 加 13 16 ， RNase3 介导了这一过程 。表达植物病毒 蛋白最常见的就是大肠杆菌表达体系 ，它具有产量 高 、成本低 、生产周期短 、表达稳定等优点 ，本研究利 用原核表达的方法制备了 SPCSV-RNase3 蛋白的 抗血清 ，该抗血清对 RNase3 融合蛋白的效价可达 100000 以上 ，可以用于 RNase3 融合蛋白的检测 。 利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体 ，是目前 抗体研究中普遍采用的一种方法 ，制备的抗体可以 用于内源蛋白的表达水平分析 、蛋白质的体外互作 分析 、免疫胶体金定位分析等试验 17 。因此 ，下一 步可以通过 Westernblot 技术利用制备的特异性抗 体对 RNase3 在甘薯不同部位的分布和表达量的差 异开展研究 ；另外 ，还可以通过酵母双杂交技术筛选 与 SPCSV-RNase3 互作的其他协生病毒蛋白或寄 主因子 ，将表达的融合蛋白应用于 RNase3 蛋白与 其他蛋白的体外互作验证 。本研究为后续 SPCSV · 0 4 1 · 44 卷第 3 期 秦艳红等 ：甘薯褪绿矮化病毒 RNase3 蛋白的原核表达及抗血清制备 的致病机理研究提供了材料 ，为探索新的抗病毒策 略奠定基础 。 参 考 文 献 1 MAD ， LIHM ， TANGJ ， etal.Currentstatusandfuturepros- pectsofdevelopmentofsweetpotatoindustryinChina C Sweet PotatoinFoodandEnergySecurity ： ProceedingsofChinaXuzhou 4thInternationalSweetPotatoSymposium4thChina-Japan-Ko- reaSweetPotatoWorkshop.Xuzhou ， China ， 2010 ： 3 10. 2 乔奇 ，张振臣 ，张德胜 ，等 . 中国甘薯病毒种类的血清学和分子 检测 J . 植物病理学报 ， 2012 ， 42 （ 1 ） ： 10 16. 3 QINYH ， LIXC ， ZHANGZC ， etal.Firstreportofsweetpo- tatobadnavirusAinChina J . 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