一株耐盐溶磷真菌的筛选、鉴定及其生物肥料的应用效果.pdf

<p>一株耐盐溶磷真菌的筛选、鉴定及其生物肥料的应用效果江红梅，殷中伟，史发超，刘彩月，程明芳，范丙全*（中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081）摘要: 【目的】从内蒙古种植向日葵的盐碱地中筛选高效溶磷真菌，为农业生产中增产节肥，开发耐盐、溶磷微生物肥料提供菌种资源。【方法】利用形态特征和ITS rDNA序列鉴定菌株；LC-MS技术测定菌株M2在液体培养基中分泌有机酸和植物激素含量，明确菌株M2的溶磷和促生机理。采用液体摇床培养试验测定了鉴定菌株的溶磷能力。试验处理包括：在磷酸三钙、磷酸铝和5个磷矿的磷矿粉制备的100 mL难溶磷磷源 (含5g/L难溶磷) 中，接入1 mL灭菌培养液对照，和分别接种1 mL斜卧青霉菌P83和草酸青霉菌M2共15个处理。置于28、160 r/min摇床培养，分别于3、6和9 d，取菌液5 mL，在12000 r/min、4离心5 min，取上清液测定有效磷含量。采用含NaCl的固体培养基测定菌株的耐盐性。NaCl含量分别为0%、5%、7.5%、10%和12.5%的PDA平板中接入溶磷菌，置于28恒温培养箱中5 d，观察并记录菌丝的生长状况。采用盆栽试验方法检验了菌株的溶磷能力。以玉米种子 (郑单958) 为供试作物，以水稻土、黏性潮土、盐潮土和石灰性潮土为供试土壤，以Ca3(PO4)2、AlPO4 和昆阳磷矿粉 (RP) 为供试磷源 (磷源用量为1.0 g/kg土壤)。设置只加入灭菌草炭和Pikovskaya培养液对照，分别接种溶磷菌P83、M2，共计38个处理，144盆。玉米播种40天后收获，测定植株鲜重、干重和玉米根际土壤有效磷含量。田间试验以花生为供试作物，设置只加灭菌草炭和Pikovskaya培养液对照和分别接种ATCC20851、P83、M2溶磷菌剂三个处理。花生生长155 d后收获，称量花生植株鲜重和干重、花生果实鲜重和干重，同时采集花生根部土壤测定有效磷含量。【结果】溶磷菌株M2鉴定为草酸青霉 (Penicillium oxalicum)。液体培养基摇床培养6 d后，接种菌株M2，以Ca3(PO4)2为磷源的上清液中有效磷含量达972 mg/L，Ca3(PO4)2溶解率为59.2%；以AlPO4为磷源的有效磷含量达988 mg/L，溶解率为48.2%；以江苏锦屏、贵州开阳、云南晋宁、河北钒山和云南昆阳磷矿粉为磷源的有效磷释放量达21.0556mg/L。菌株M2在7.5%NaCl培养基中正常生长。盆栽试验结果发现，菌株M2对玉米植株促生效果显著，玉米植株鲜重比不接种菌剂 (CK) 提高26.4%99.2%、干重增加20.0%262.9%，土壤有效磷提高19.225.3mg/kg。菌株M2与4种土壤的适配性均高于对照菌株P83。田间小区花生产量结果显示，接种溶磷菌剂M2增产效果最好，花生果实产量达4.50 t/hm2，比CK增加0.85 t/hm2，增产23.29%。菌株M2 在含有磷酸三钙、磷酸铝和开阳磷矿粉3种难溶磷培养液中经过6 d培养，均产生7种有机酸，其中草酸和柠檬酸含量最高，分别为653.46 mg/L和269.61 mg/L；培养液中均能检测到吲哚乙酸 (IAA) 和玉米素，IAA含量为32.3866.17mg/L，玉米素浓度为0.050.07 mg/L。【结论】获得了一株耐盐、高效溶解多种难溶磷的草酸青霉菌M2，可显著增加土壤有效磷，促进玉米生长和花生增产，与4种典型土壤适配性好，具有良好的农业应用前景。关键词: 草酸青霉菌；溶磷作用；耐盐；促生效果；有机酸；植物激素Isolation and functional evaluation of phosphate-solubilizing fungiwith salt-tolerant characteristicsJIANG Hong-mei, &nbsp; YIN Zhong-wei, &nbsp; SHI Fa-chao, &nbsp; LIU Cai-yue, &nbsp; CHENG Ming-fang, &nbsp; FAN Bing-quan*( Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China )Abstract: 【Objectives】To supply effective microbial strains for biofertilizer production, we isolatedphosphate-solubilizing fungi from the saline-alkaline soils planting sunflower in Inner Mongolia.【Methods】Petridishes method was used to isolate phosphate-solubilizing fungus and the isolated fungus was identified by ITS植物营养与肥料学报 2018, 24(3): 728742 doi: 10.11674/zwyf.17468Journal of Plant Nutrition and Fertilizers http:/www.plantnutrifert.org收稿日期： 20171211 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 接受日期： 20180404 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2013AA102801-7）；农业部“948”重点项目（2011-G25，2016-21X）资助。联系方式：江红梅 E-mail: jianghongmei2001163.com ； * 通信作者 范丙全 Tel: 010-82106212，E-mail：bqfancaas.ac.cnrDNA sequence homology analysis. Broth medium culture was used to measure the dissolving capacity ofinsoluble phosphate of the isolated M2. Insoluble phosphates: Ca3(PO4)2, AlPO4, and five phosphorous rockpowders as sole P source, respectively, were used to make PVK broth medium containing 5 g/L of phosphateseparately, and 1 mL of sterilized cultural media, strain P83 and strain M2 were added into 100 mL of the brothmedium and incubated at 28 for 3, 6 and 9 days at 160 r/min. Cultures were centrifuged at 12000 r/min for 5min at 4 and the supernatant immediately analyzed for available phosphorus. To determinate the salt toleranceof isolate M2 and strain P83 in petridishes, the PDA solid medium containing 0%, 5%, 7.5%, 10% and 12.5% ofNaCl were employed and the growth diameters of P-solubilizing isolates P83 and M2 were recorded, respectively,after 5 days of incubation. A pot experiment was carried out to investigate solubilizing phosphate effect of strainM2. Maize seeds (Zea mays L. Zhendan 958) were planted in the four types of soils (paddy soil, viscous fluvo-aquic soil, salinized fluvo-aquic soil and calcareous fluvo-aquic soil) in the presence of Ca3(PO4)2, AlPO4 andKunyang RP. The fresh and dry biomass and soil available phosphorus in treatments of P83 and M2 inoculationswere measured at 40 days after sowing. A field trial was conducted to investigate the plant growth promotioneffect of the produced bio-fertilizer with M2 strain. Peanut seeds were coated onto the mixture of fungal sporessuspension (strain ATCC20851, P83 and M2) with sterilized peat. The yields of peanut straw and seeds wererecorded and the soil available phosphorus was analyzed after harvest. Accumulation profiles of organic acid andphytohormone produced by the isolated M2 were analyzed using LC-MS method.【Results】The isolated M2strain was identified as Penicillium oxalicum and had a strong ability to solubilize insoluble phosphates. Thephosphate release rate from the solubilized Ca3(PO4)2 by M2 strain was 59.2% and the concentration of availableP was 972 mg/L under shaking incubation after 6 days culture. The soluble P in AlPO4 liquid culture was lowerthan that in the medium with Ca3(PO4)2, the available P content was 988 mg/L and the solubilized rate of AlPO4reached up to 48.2%. The contents of solubilized P by M2 from Jinping RP, Kaiyang RP, Jinning RP, FanshanRP, Kunyang RP were ranged from 21.0 to 556 mg/L after 6 days shaking incubation. The isolated M2 straingrew well in the presence of 7.5% NaCl, exhibiting satisfactory salt resistance property. The pot experimentshowed that the M2 strain had significant growth promoting effects in all the four types of soils. Compared withthe no-inoculation control, the fresh and dry biomass of corn in the M2 inoculated treatments were increased by26.36%99.18% and 20.05%262.94%, respectively, and the soil available P contents were enhanced by19.2425.28 mg/kg. The adaptability of isolated M2 to four types of soils was better than that of strain P83.Field experiment showed that the M2 inoculation exhibited a greater enhancement in peanut yield, and the yieldwas averaged at 4.50 t/hm2 with an increase of 23.29% over the control. Seven organic acids and twophytohormones were all detectable in the liquid cultures of Ca3(PO4)2, AlPO4 and Kunyang RP, the concentrationsof oxalic acid and citric acid in the three liquid cultures were as high as 653.46 mg/L and 269.61 mg/L in thepresence of M2 stain, respectively. The concentrations of indole acetic acid (IAA) were ranged from 32.38 to66.17 mg/L, and zeatin concentrations were ranged from 0.05 to 0.07 mg/L.【Conclusions】A novel phosphate-solubilizing M2 strain was isolated and identified to be Penicillium oxalicum. The isolated M2 strain behaves wellin solubilizing insoluble phosphates under culture with petri dishes, broth medium and pot experiments, and couldsignificantly increase soil available phosphate and corn biomass, suggesting that Penicillium oxalicum M2 strain isprospective for biofertilizer production in the future.Key words: Penicillium oxalicum; phosphate solubilization; salt-tolerant; plant growth promotion effect;organic acid; phytohormone土壤缺磷是限制作物产量的一个重要因素，据统计，全世界约有57万公顷的耕地缺磷1，而我国约有2/3的耕地磷素缺乏尤为突出2。长期以来，施用磷肥是粮食增产的重要举措。大量研究显示，施入土壤的磷肥当季利用率不超过20%3，其中绝大部分磷与土壤中Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+ 等离子结合转化3 期江红梅，等：一株耐盐溶磷真菌的筛选、鉴定及其生物肥料的应用效果729 &nbsp;为难溶磷，不易被植物吸收利用1。迄今，世界各国依靠大量消费磷肥确保作物增产，保障粮食安全，从而导致磷矿资源的消费量逐年增加。我国90%以上磷矿为中低品位，按现有的年消费量，我国磷矿使用年限将不足20年3。因此，提高磷肥及磷矿资源的利用效率和土壤磷库的有效性，延长磷矿资源的使用期限，对世界各国农业的可持续发展具有重要意义45。溶磷微生物能活化土壤难溶磷、提高磷肥利用率、增加作物吸磷量、促进作物增产46，其生物肥料制剂已经成为一种高效、经济、环境友好的转化土壤难溶磷的生物措施。溶磷微生物依靠自身产生有机酸78、分泌H+ 离子9，将难溶磷转化为有效磷，同时通过自身产生植物促生物质10，在磷素的生物有效性和作物增产中发挥重要作用。自1903年Staltrom10从土壤中成功分离到溶磷细菌以来，溶磷微生物一直是研究热点，国内外相继开展了溶磷微生物的大量筛选工作1213，以期通过接种溶磷微生物制剂提高土壤难溶磷的有效性和磷肥利用率，从而减少磷矿资源的消费量7, 14。已有的报道表明，真菌的溶磷能力大于细菌，且溶磷性能稳定11。世界各国科学家分离了大量溶磷真菌，其种类主要是青霉菌6、曲霉菌8、木霉菌15、酵母菌16、篮状菌17、正青霉菌18、根霉菌19、镰刀菌20、小菌核菌21和轮枝菌22等，其中绝大部分为青霉菌和曲霉菌。溶磷青霉菌是一类重要的溶磷微生物资源，现已报道的溶磷青霉菌有微白青霉23、产黄青霉24、桔青霉25、常现青霉23、微紫青霉26、梅利尼青霉25、黑青霉27、特异青霉28、橄榄色青霉23、岛青霉23、草酸青霉13、产紫青霉26、局限青霉23、红色青霉26、皱褶青霉27、托姆青霉28、斜卧青霉29、指状青霉30、变换青霉30、绳状青霉32、拜莱青霉32、紫棕青霉 (P. cf. fuscum)33、嗜松青霉34、淡紫青霉35、黄灰青霉9和棘孢青霉36，达26种之多。绝大多数溶磷菌株是从作物根际土壤中分离，而一些溶磷菌株则是从特殊环境中获得，以期更好地利用该类菌株具有溶磷功能和兼具适应土著环境的特性。Chatli等36从低温沙漠地区分离了溶磷青霉菌株FC28、FC39，对磷酸三钙的溶解量分别为136.9 mg/L和103.3 mg/L；Bhattacharya等37从蚯蚓粪便中分离到溶磷菌株V1，对磷矿粉最大溶解率为36%，土壤有效磷含量提高13.65 mg/kg；Naveenkumar等38从槟榔壳废弃物中获得了溶磷菌Strain-1，对磷酸三钙的溶解量为200 mg/L；Rinu等39从海拔18003610 m的喜马拉雅山脉土壤中分离到溶磷菌株ITCC2546、ITCC4210和ARIFCC771，在盆栽实验中使玉米种子干重分别增加10.71%、33.33%和21.43%，小麦种子干重分别增加33.33%、37.04%和25.92%；李海云等40从猪粪堆肥中筛选到溶磷产黄青霉菌株PSM-1，对磷酸三钙的溶解量为138.36 mg/L；Nath等41从茶树叶中分离出溶磷菌Penicillium sp.1和Penicillium sp. 2，对磷酸三钙的溶解量分别为86.10 mg/L和84.25 mg/L；Chai等42从明矾矿石中筛选到溶磷青霉菌株PSM11-5，对磷矿粉的溶解率达74.5%，且耐受重金属Cd2+、Co2+ 和Cr6+ 的能力较好。我国盐碱地耕地面积约有1300万公顷，是我国最具增产潜力的低产农田。盐碱土壤主要面对盐碱胁迫和养分吸收两大障碍16，鉴于目前盐碱土壤治理采用的管道排盐44、抗 (耐) 盐育种17收效甚微，功能微生物及其制剂的应用正在展现巨大潜能44。无论盐分胁迫土壤，还是非盐分胁迫的土壤，有效磷含量低是制约作物产量的主要因素之一13。因此，溶磷微生物，尤其耐盐溶磷微生物受到农业生产的高度重视17。国内外已有少量耐盐溶磷菌株的研究报道，其中，耐盐溶磷青霉菌主要有菌株PSF244、菌株PSFWRB-245和菌株QL150146。此外，红酵母菌(Rhodotorula sp.) PS416、木霉菌TRC315和疣孢蓝状菌 (Talaromyces verruculosus) P1017等溶磷菌株的耐盐能力较突出。本研究旨在筛选具有耐盐能力的高效溶磷真菌，并对菌株的溶磷能力、代谢产物及促生增产效果进行研究，为开发适用于盐碱农田土壤的溶磷生物肥料提供菌种资源。1 &nbsp; &nbsp;材料与方法1.1 &nbsp; &nbsp;供试材料1.1.1 &nbsp;土壤来源 &nbsp; 从内蒙古五原县 (东经107°3570108°3750，北纬40°463041°1645) 轻中度盐碱农田采集向日葵根围土壤样品150个，土壤pH值为8.67，电导率EC为0.96 ms/cm。盆栽土壤来自北京市石灰性潮土、安徽省阜阳黏性潮土、安徽水稻土和山东沿海盐潮土。土壤理化性状见表1。1.1.2 &nbsp;草炭 &nbsp; 本研究菌剂使用的载体为草炭，该草炭产自我国东北地区，有效磷97.14 mg/kg、速效钾48.36 mg/kg、有机质219.74 g/kg。1.1.3 &nbsp;培养基 &nbsp; 1) 菌株筛选与培养：无机磷培养基、PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基等4。2) Pikovskaya改良培养基 (g/L)：葡萄糖 10.0730植 物 营 养 与 肥 料 学 报24 卷g、(NH4)2SO4 0.5 g、酵母抽提物 0.5 g、KCl 0.2 g、FeSO4·7H2O 0.001 g、MnSO4·4H2O 0.001 g、Ca3(PO4)25.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、pH 7.047。3) PDY培养基：土豆200 g与1 L蒸馏水混合煮沸20 min过滤，滤液补水至1 L，加入蔗糖10 g、酵母粉1 g。4) PDA培养基：PDY加琼脂18 g/L。5) 耐盐培养基：PDA加NaCl。分别配制NaCl含量为0%、5%、7.5%、10%和12.5%的培养基。以上培养基灭菌条件均为121，20 min。1.1.4 &nbsp;供试磷源 &nbsp;1) 分析纯磷酸三钙Ca3(PO4)2 (P 20%)、分析纯磷酸铝AlPO4 (P 25.41%)，购于天津科密欧试剂公司。2) 磷矿粉：贵州开阳磷矿粉 (Kaiyang rockphosphate，Kaiyang RP，P 14.79%)；江苏锦屏磷矿粉 (Jinping rock phosphate，JPRP，P 15.01%)；云南晋宁磷矿粉 (Jinning rock phosphate，JNRP，P14.75%)；河北钒山磷矿粉 (Fanshan rock phosphate，FSRP，P 14.80%) ；云南昆阳磷矿粉 (Kunyang rockphosphate，Kunyang RP，P 14.90%)。磷矿石均粉碎过100目 (149 m) 筛，钼锑抗比色法测定有效磷含量。1.1.5 &nbsp;液质联用 (Liquid chromatograph-massspectrometer，LC-MS) 试剂 &nbsp;1) 有机酸标准品 酒石酸 (DL-Tartaric acid)、草酸 (Oxalic acid) 、柠檬酸 (Citric acid)、苹果酸 (DL-Malic acid)、乳酸 (L(+)-Lactic acid)、琥珀酸(Succinic acid) 和延胡索酸 (Fumaric acid)，购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。2) 植物激素标准品 生长素 (IAA)、玉米素(Zeatin)，购于德国Dr. Ehrenstorfer公司。磷酸二氢钾和磷酸为国产优级纯，甲酸铵、丙酸和甲醇(Methyl alcohol) 为色谱纯 (美国Tedia公司)。试验用水为超纯水 (电阻率为18.20 M.cm)。1.1.6 &nbsp;Hoagland培养液配方 (mol/L) &nbsp; K2SO4 8 × 104、MgSO4 6.5 × 104、KCl 1 × 104、Ca(NO3)2 2 × 103、CuSO4 1 × 107、MnSO4 1 × 106、EDTA-Fe 1 × 107、H3BO3 1 × 105、ZnSO4 1 × 106、(NH4)6Mo7O24 5 ×109。用0.01 mol/L NaOH溶液和0.01 mol/L HNO3溶液调节pH至5.848。1.1.7 &nbsp;供试菌株 &nbsp; 草酸青霉 (Penicillium oxalicum) 菌株M2为本试验筛选菌株；斜卧青霉 (Penicilliumdecumbens) 菌株P83为本实验室保存菌株。斜卧青霉P83和拜莱青霉ATCC20851作为对照菌株。1.1.8 &nbsp;主要的试剂和仪器 &nbsp; 真菌总DNA提取试剂盒、Taq酶和dNTP购自天根生化科技有限公司，其他试剂为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。引物由上海生工生物技术有限公司合成，ITS1 (5&#39;-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3&#39;) 和ITS4 (5&#39;-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3&#39;)49；pH计为Mettler Toledo S40 seven multi；电导仪为MettlerToledo FEP30；培养箱为DHP-9162型，购自上海一恒科技有限公司；PCR仪为GeneAmp PCR System9700；高速离心机为Heraeus公司的Sorvall BiofugeStratos；光学显微镜为OLYMPUS BH-2；扫描电子显微镜为FEI-QUANTA200；紫外分光光度仪为天美科技有限公司UV-7501。三重串联四极杆液质联用仪器 (美国Agilent)：主机Agilent LC 1290 Infinity2，Agilent QQQ 6470；工作站Agilent Masshunter。1.2 &nbsp; &nbsp;试验方法1.2.1 &nbsp;溶磷菌株的分离鉴定 &nbsp; 采用梯度稀释法获得系列稀释倍数的土壤菌悬液。称取1g保藏于4冰箱的新鲜土壤，用0.85%灭菌的生理盐水将土壤样品稀释至102105倍，分别吸取0.1 mL土壤悬液涂布于无机磷培养基平板上，每个浓度土壤悬液重复涂布3个平板。置于培养箱中28倒置培养，选择溶磷圈较大的菌株，转接到PDA固体培养基平板上，纯化后接入PDA斜面保藏。表 1 &nbsp; 供试土壤理化性状Table 1 &nbsp; The physico-chemical properties of test soils土壤类型Soil type电导率 (mS/cm)EC有机质 (g/kg)Organic matter有效磷 (mg/kg)Avail. P速效钾 (mg/kg)Avail. K水稻土Paddy soil 0.25 17.46 5.58 185.99黏性潮土Fluvo-aquic soils 0.30 10.96 6.01 219.81盐潮土Salinized fluvo-aquic soil 1.04 21.61 5.94 318.43石灰性潮土Calcareous fluvo-aquic soil 0.22 31.22 8.26 129.633 期江红梅，等：一株耐盐溶磷真菌的筛选、鉴定及其生物肥料的应用效果731 &nbsp;1.2.2 &nbsp;悬浮培养试验 &nbsp; 将100 mL含5 g/L难溶磷的Pikovskaya培养液盛入三角瓶中，难溶磷磷源分别为磷酸三钙、磷酸铝、开阳磷矿粉 (Kaiyang RP)、锦屏磷矿粉 (JPRP)、晋宁磷矿粉 (JNRP)、钒山磷矿粉(FSRP) 和昆阳磷矿粉 (Kunyang RP)。于121灭菌30 min，接种1 mL溶磷菌悬液于无菌培养基中。试验处理包括：1) 对照 (CK)，接入1 mL灭菌培养液； 2) 黑曲霉菌P83；3) 草酸青霉菌M2。每个处理3次重复。置于28、160 r/min摇床培养，分别于3、6和9 d，取菌液5 mL，12000 r/min、4离心5 min，取上清液测定有效磷含量。1.2.3 &nbsp;供试菌株在磷酸三钙、磷酸铝和磷矿粉溶磷过程中的pH值变化 &nbsp; 试验设置同1.2.2的方法，分别测定在磷酸三钙、磷酸铝和5种磷矿粉中接种菌株M2、P83时，溶液pH值的变化。1.2.4 &nbsp;供试菌株耐盐性测定 &nbsp; 用无菌接种环从长满菌丝体的PDA培养液中，挑取一个较大的小球体接入固体耐盐培养基中央，置于28恒温培养箱中，从第3 d开始每日观察并记录菌丝在NaCl含量分别为0%、5%、7.5%、10%和12.5%的PDA平板中的生长状况。1.2.5 &nbsp;溶磷菌剂的制备 &nbsp; 将50 g草炭置于500 mL三角瓶中，121间歇式灭菌3次，每次30 min。供试溶磷菌株M2、P83分别接种于PDA固体平板上，28倒置培养5 d，用接种环轻轻刮取孢子到50 mL灭菌PDB培养液中。在显微计数板上计数，用培养液平衡至孢子数量约为1 × 108 cfu/mL时，供试菌株的菌液与灭菌草炭以11 (v/w) 混合均匀，28恒温箱中培养1周备用。1.2.6 &nbsp;液质联用 (LC-MS) 测定草酸青霉菌M2溶磷过程中产生的有机酸 &nbsp; 在200 mL三角瓶中装入100mL的Pikovskaya液体培养基，磷源分别为磷酸三钙、磷酸铝和昆阳磷矿粉三种。灭菌后接种1 mL106 cfu溶磷真菌M2的孢子悬液，在28，170 r/min摇床振荡培养6 d。将菌液12000 r/min离心2 min取上清，加入2滴0.05%百里酚以抑制微生物活动并防止有机酸分解。将菌液过水相0.22 m滤膜后上机测试。有机酸标准液配制：分别精确称取酒石酸(Tartaric acid)、草酸 (Oxalic acid)、苹果酸 (Malicacid)、柠檬酸 (Citric acid)、乳酸 (Lactic acid)、延胡索酸 (Fumaric acid) 和琥珀酸 (Succinic acid)7种有机酸的标准品 (精确至0.0001 g)，用流动相A溶解稀释，用孔径0.22 m的微孔滤膜过滤，定容于50mL容量瓶中，配制质量浓度为100 mg/L的储备液，4冷藏。标准曲线绘制：根据文献12及实际操作中紫外吸收灵敏度，将草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、延胡索酸、琥珀酸按照2.555550.515的比例配制混标，逐级稀释成5、10、20倍分别为a、b、c和d级别的标准液，现配现用。其中a级别标准溶液的质量浓度为56、120、140、103、150、10.8和300 mg/L。1) 高效液相条件 流动相A配制：精准称量KH2PO4 (精确至0.000 1 g)，用超纯水溶解配制浓度为0.01 mol/L，加入适量H3PO4调节pH值至2.73，经水系孔径为0.22 m的微孔滤膜过滤，超声脱气后备用。流动相B为0.1%丙酸水甲醇 = 8020，经超声脱气后备用。色谱柱为ZORBAX SB C18 (5 m，250 mm × 4.6 mm)，流速为0.5 mL/min，柱温为25，进样量10 L，运行时间10 min。2) 质谱条件 负离子扫描，SIM模式，干燥气温度300，鞘气温度250，毛细管电压3500 V，喷嘴电压500 V。1.2.7 &nbsp;液质联用 (LC-MS) 测定草酸青霉菌M2溶磷过程中分泌的植物激素 &nbsp; 试验设计同1.2.6的方法。植物激素标准液配制：分别精确称取生长素(IAA) 和玉米素 (Zeatin) 标准品 (精确至0.0001 g)，以甲醇溶解稀释，用孔径0.22 m的微孔滤膜过滤，定容于50 mL容量瓶中，配制质量浓度为100 mg/L的储备液，4冷藏。1) 高效液相条件 流动相为5 mmol/L甲酸铵水甲醇 = 7030。色谱柱为Eclipse XDB C18(3.5 m，2.1 mm × 150 mm)，流速为0.3 mL/min，柱温为25，进样量10 L，运行时间6 min。2) 质谱条件 正离子扫描，MRM模式，干燥气温度300，鞘气温度250，毛细管电压3500 V，喷嘴电压500 V。1.2.8 &nbsp;盆栽试验 &nbsp; 玉米种子用0.4%的次氯酸钠进行表面消毒，用无菌蒸馏水冲洗4次，除去次氯酸钠，再用55无菌蒸馏水浸种，30温箱培养过夜后将种子转入灭菌纱布上催芽。试验使用塑料盆 (18 cm ×15 cm × 15 cm)，每盆装土壤750 g。供试土壤有四种，水稻土、黏性潮土、盐潮土和石灰性潮土。供试磷源为三种，分别是Ca3(PO4)2、AlPO4 和昆阳磷矿粉 (RP)，每种磷源用量为1.0 g/kg土壤。菌剂处理为：1) 对照 (CK)，加入灭菌草炭和Pikovskaya培养液；2) 接种溶磷菌P83；3) 接种溶磷菌M2。称取菌732植 物 营 养 与 肥 料 学 报24 卷剂1.50 g/盆，与2.25 g灭菌草炭混匀后，与土壤混合均匀。试验采用完全随机设计方案。每个处理重复4次，共计144盆。温室种植 (2014年3月28日种植，5月4日收获，北京白天平均28，夜间平均18)，每盆播种2粒发芽的玉米种子。生长期间保持土壤湿度在65%75%。采集玉米根际土壤样品和收获玉米植株，测定植株鲜重、干重和土壤有效磷含量。玉米品种为郑单958。1.2.9 &nbsp;小区试验 &nbsp; 2014年5月在北京市唐家岭布置了田间小区试验。供试菌株为M2、P83和ATCC20851为对照菌株，试验地面积为40 m2 (10 m × 4 m)，将其划分为1.8 m × 0.8 m的小区，每个小区接种菌剂300 g。菌剂处理为：1) 对照 (CK)，只加入灭菌草炭和Pikovskaya培养液；2) 接种ATCC20851溶磷菌剂；3) 接种P83溶磷菌剂；4) 接种M2溶磷菌剂。每个处理重复4次，溶磷菌剂与表层15 cm土壤混合均匀后培垄 (200 cm × 20 cm × 20 cm)，每个垄种植花生16棵，155 d收获。测定花生植株鲜重和干重、花生果实鲜重和干重。将小区产量折合为每公顷的产量，收获时采集花生根部土壤测定土壤有效磷含量。1.3 &nbsp; &nbsp;数据统计分析采用SAS 9.2统计软件对数据进行统计分析 (SASInstitute Inc., Cary, NC, USA)。利用SPSS 19.0软件中的一般线性模型 (General Lineral Model forUnivariate，GLMUnivariate) 进行多因素方差分析。2 &nbsp; &nbsp;结果和分析2.1 &nbsp; &nbsp;溶磷菌的筛选、鉴定从向日葵根围土壤样品中共分离到5株溶磷真菌，其中真菌M2在无机磷培养基上生长良好，7天能够将9 cm培养皿内的无机磷全部溶解，说明该菌溶磷能力较强，故选择菌株M2作为本试验的供试菌株。菌株M2在PDA培养基中28培养，菌落生长迅速，菌丝体为白色，菌落中央有脐凸。3天后出现灰绿色分生孢子，5天时分生孢子多且极易脱落，无渗出液背面为浅黄色。显微镜下观察到菌丝成束且无隔断，呈帚状枝单轮生，壁光滑。分生孢子为圆形，直径约3 m。利用ITS rDNA特异引物对菌株进行PCR扩增得到562 bp的目的DNA片段，利用Blast软件与GenBank的序列进行同源性比较，</p>