马铃薯早疫病拮抗菌的筛选及其代谢产物的抑菌活性.pdf

p马铃薯早疫病拮抗菌的筛选及其代谢产物 的抑菌活性 杨继业 1，2杨 帆 1，2，3崔冠慧 1，2孙劲冲 1，2王雅娜 1，2刘洪伟 1，2程辉彩 1，2张丽萍 1，2* （ 1 河北省科学院生物研究所，河北石家庄 050081； 2 河北省主要农作物病害微生物控制工程技术研究中心， 河北石家庄 050081； 3 河北工业大学，天津300130） 摘 要以马铃薯早疫病病原菌茄链格孢菌（Alternaria solani）为指示菌，通过平板对峙法，筛选出菌株及其发酵滤液对马 铃薯早疫病病原菌均具有较强拮抗作用的生防菌株BAF-6；通过形态特征、生理生化特性鉴定以及16S rDNA序列分析，该 菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株发酵滤液经60～80 ℃热处理，抑菌活性均在95以上；紫外线照 射8 h或在pH值为2～10的酸碱环境下，发酵滤液的抑菌活性稳定；经蛋白酶处理后抑菌活性仍达50以上。 关键词马铃薯；早疫病；拮抗菌；筛选；鉴定；抑菌活性 土壤养分不足，有机质含量下降，导致植株衰弱， 土传病害增加，如马铃薯早疫病病原菌茄链格孢菌 （Alternaria solani） ，更易侵染衰弱植株的叶片、 茎秆以及块茎，危害严重，是马铃薯的主要病害之 一（郭润婷 等，2016）。 目前国内外对马铃薯早疫病的防治主要通过化 学防治，常用药剂如丙森锌、代森锰锌、霜脲锰锌 等，化学农药虽然方便、快速，但长期使用易造成 生态环境污染严重，菌株抗药性增加，同时农产品 农药残留危害人类健康，因此亟须寻找环境友好型 杨继业，女，硕士，主要从事微生物菌肥研究，E-mail695819348 nbsp; *通讯作者（Corresponding author）张丽萍，女，研究员，主要从事生 物防治及微生物菌肥研究，E- 收稿日期2017-12-21；接受日期2018-03-20 基金项目河北省科学院科技计划项目（17310） 自我国启动马铃薯主粮化战略，马铃薯栽培 面积随之增加，成为仅次于水稻、小麦、玉米的 第四大粮食作物。与此同时，马铃薯倒茬困难、 连作障碍等问题日益严重（原霁虹，2015） ，使得 the control effect on Fusarium wilt by the of seedling inoculation．The results showed that S1，S4 and S6 nbsp;treatments could significantly promote watermelon growth．Their inds of plant height，stem diameter，fresh nbsp;weight above ground，root-crown ratio，strong seedling index，etc．were all higher than that of the contrast． nbsp;Biological agents had certain control effects on Fusarium wilt of watermelon．Compared with the respective nbsp;contrast，the disease index of ‘Zaojia 8424’ decreased 76.2-92.8，that of ‘Xinong No.8’ decreased 37.0-54.6． nbsp;Besides，the disease control effect of these 2 varieties was all outstanding as S6．Further studies found that nbsp;Bacillus subtilis could significantly inhibit mycelial growth and spore germination of Fusarium oxysporum f. sp. nbsp;niveum race1．Inhibition rate of mycelial growth reached 67.75 and the conidia germination number was only nbsp;24.4 of the contrast．The successive control on pathogenic bacteria could reach 49.3．In summary，S6 has the nbsp;best combination effect on watermelon growth promotion and control of watermelon Fusarium wilt．And its strain nbsp;has significant inhibitory effect on growth and spore germination of Fusarium oxysporum f. sp. niveum． Key wordsWatermelon；Biological agent；Fusarium wilt；Growth and development nbsp;62 nbsp; 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 nbsp;62 nbsp; 研究论文 中 国 蔬 菜 nbsp; nbsp; CHINA VEGETABLES 2018（5）62 - 66 生物防治的方法（Wharton et al.，2007；漆文选， 2017） 。王爱军等（2013）筛选出2株萎缩芽孢杆 nbsp;菌，对马铃薯黑痣病、干腐病病原菌具有较强抑制 作用。姚彦坡（2015）筛选出2株木霉菌株HNA14 和HNA12，对马铃薯晚疫病和辣椒疫病具有较好 的防病效果。 目前芽孢杆菌对马铃薯早疫病的防治研究较 少，因芽孢抗逆性强，具有耐高温、紫外线，易储 存等优点，本试验以马铃薯早疫病病原菌茄链格孢 菌作为指示菌，从河北省科学院生物研究所微生物 实验室保存的生防菌株中筛选对马铃薯早疫病具有 较强抑制效果的芽孢杆菌，对菌株进行生理生化及 16S rDNA鉴定，同时对菌株代谢产物性质进行研 究，以期得到代谢产物抑菌活性稳定的芽孢杆菌， 为进一步研制马铃薯早疫病新型生防制剂奠定前期 基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料 供试病原菌为马铃薯早疫病病原菌茄链格孢 菌，由河北农业大学植物保护学院朱杰华教授提 供。供试生防菌株为河北省科学院生物研究所微生 物研究室保藏的600多株生防菌株。 供试培养基PB培养基、NB培养基、PDA培 养基，配制方法参照细菌鉴定手册（布坎南和吉本 斯，1984；东秀珠和蔡妙英，2001）。 1.2 拮抗菌筛选 1.2.1 拮抗菌初筛 取活化好的直径为8 mm的 茄链格孢菌菌饼，点种于PDA培养基（直径90 nbsp;mm）中央，26 ℃培养2 d，在菌块四周点种生防菌 株，培养4 d后观察菌株抑菌效果。 1.2.2 拮抗菌复筛 将初筛所得拮抗菌经二级摇床 培养后，发酵液12 000 rmin -1 离心10 min去除菌 体，经0.22 μm无菌滤膜过滤得到无菌滤液。吸 取30 mL茄链格孢菌悬浮液（110 6 nbsp;cfumL -1 ）于 300 mL融化的PDA培养基中，混匀后倒入培养皿 中，待培养基凝固后，打孔并点入100 μL上述无 菌滤液，3～4 d后观察抑菌效果。 1.3 菌株鉴定 1.3.1 形态特征及生理生化特性 在PB平板上接 种菌株，32 ℃培养24 h后观察菌株菌落形态，复 红染色后于显微镜镜检。菌株生理生化特性参照伯 杰细菌鉴定手册（布坎南和吉本斯，1984）和常 见细菌系统鉴定手册 （东秀珠和蔡妙英，2001） 进行鉴定。 1.3.2 基因组提取及16S rDNA序列扩增与分 析 采用生工生物工程（上海）股份有限公 司DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA， 选用16S rDNA基因通用引物进行PCR扩增。 27F539;-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-339;，1492R 539;-CTACGGCTACCTTGTTACGA-339;。PCR反 应 体 系为50 μLDNA模板2.5 μL，上下游引物各2 nbsp;μL，2Mix 25 μL，ddH 2 O 18.5 μL。PCR反应程序 94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，30 个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1琼脂糖凝胶 电泳检测，并于生工生物工程（上海）股份有限公 司进行测序，将所得序列与GenBank数据库中序列 进行Blast分析比对，并构建系统发育树。 1.4 代谢产物的抑菌活性 1.4.1 热稳定性 将菌株BAF-6的发酵液经0.22 nbsp;μm无菌过滤器进行除菌，得到发酵滤液，分别在 60、70、80、90、100、121 ℃下热处理30 min，冷 却至室温后，采用打孔法在含有茄链格孢菌的平板 上打孔，并于孔中分别点入100 μL各处理的发酵 滤液，3～4 d后测量各处理抑菌圈的大小，以未经 热处理的发酵滤液为对照，以对照抑菌圈大小为活 性100，计算各处理的相对抑菌活性（杨艳红 等， 2017），每个处理3次重复。 1.4.2 蛋白酶稳定性 分别用质量浓度50 mgL -1 胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K于37 ℃处理菌株 BAF-6发酵滤液2 h（胡忠亮 等，2017），以未经 蛋白酶处理的发酵滤液为对照，采用1.4.1中的方 法测定并计算各处理的相对抑菌活性，每个处理3 次重复。 1.4.3 紫外稳定性 将菌株BAF-6的发酵滤液放 置在紫外灯下（20 W）20 cm处，分别照射2、4、 6、8 h，以未经紫外灯照射的发酵滤液为对照，采 用1.4.1中的方法测定并计算各处理的相对抑菌活 性，每个处理3次重复。 1.4.4 酸碱稳定性 用1 molL -1 盐酸和1 molL -1 氢氧化钠溶液分别将菌株BAF-6的发酵滤液pH值 调节为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，静 nbsp;63 nbsp; 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 nbsp;63 nbsp; 研究论文 中 国 蔬 菜 nbsp; nbsp; CHINA VEGETABLES 置12 h后，调节pH至中性，以未经处理的发酵滤 液为对照，采用1.4.1中的方法测定并计算各处理 的相对抑菌活性，每个处理3次重复。 1.5 数据处理 采用MEGA 5.0软件对所筛菌株进行系统发 育树的构建，采用SPSS软件进行数据差异显著性 分析，并用Excel软件进行统计性分析及柱形图的 nbsp;制作。 2 结果与分析 2.1 拮抗菌筛选结果 通过平板对峙法筛选出对茄链格孢菌有较强抑 制作用的菌株11株，通过测定菌株无菌滤液的抑 菌活性，菌株BAF-6抑菌圈直径较大，为2.4 cm（图 1、2） ，说明菌株及菌株发酵滤液均对病原菌抑制 作用较强。Bacillus subtilis strain H1-7 KR061433.1Bacillus tequilensis strain 10b NR 104919.1Bacillus subtilis strain JCM 1465 NR 113265.1Bacillus subtilis subsp. inaquosorum strain BGSC 3A28 NR 104873.1Bacillus amyloliquefaciens strain Md1-43 MF581449.1BAF-6Bacillus sonorensis strain AF302118Virgibacillus proomii strain 2M HQ992819.1Bacillus alkalidiazotrophicus strain MS 6 EU143680.1Bacillus arsenicus partial AJ606700.1 99 100 99 100 56 65 34 0.005 图 4 菌株 BAF-6的 16S rDNA的系统发育树 图 3 菌株 BAF-6菌体形态 图 1 拮抗菌初筛 图 2 拮抗菌复筛 BAF-6 BAF-6 菌株形态观察及生理生化特性鉴定（表1） ，初步 鉴定该菌株属于芽孢杆菌属（Bacillus）。 2.2.3 菌株BAF-6的分子鉴定 将菌株BAF-6的 16S rDNA序列和NCBI网站中与其基因序列同源性 较高的菌株进行比对，构建系统发育树（图4） ， 结合菌株的形态特征、生理生化鉴定结果以及16S nbsp;rDNA分子鉴定结果，将菌株BAF-6鉴定为解淀粉 芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。 2.3 菌株 BAF-6的代谢产物性质 2.3.1 热稳定性 从图5可以看出，60～80 ℃热处 理菌株BAF-6的发酵滤液后，滤液对茄链格孢菌 的相对抑菌活性均与对照无显著差异，抑菌活性均 在95以上。90～121 ℃处理下，发酵滤液的相对 2.2 菌种鉴定 2.2.1 菌株BAF-6的形态特征 菌株BAF-6菌落 呈白色，不透明，近圆形，边缘不规则，菌体杆状， 菌体长约1.8 μm，宽约0.6 μm（图3），产生椭圆 形芽孢，芽孢中生。 2.2.2 菌株BAF-6的生理生化特性 通过2.2.1中 表 1 菌株 BAF-6的生理生化鉴定结果 测定项目 BAF-6 测定项目 BAF-6 革兰氏染色 吲哚试验 - 厌氧生长 酪素分解试验 - 甲基红试验 柠檬酸盐利用 V-P反应 4 ℃条件下生长 酪氨酸水解 - 50 ℃条件下生长 淀粉水解 pH5条件下生长 明胶液化 pH9条件下生长 接触酶反应 注表中阳性反应用“”表示，阴性反应用“-”表示。 nbsp;64 nbsp; 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 nbsp;64 nbsp; 研究论文 中 国 蔬 菜 nbsp; nbsp; CHINA VEGETABLES 抑菌活性显著降低，但100 ℃处理下发酵液的相对 抑菌活性仍在85以上，121℃下的相对抑菌活性 在50以上，说明菌株发酵滤液具有较高的热稳 定性。 2.3.2 蛋白酶稳定性 从图6可以看出，采用蛋白 酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶处理菌株BAF-6发酵 滤液后，滤液对茄链格孢菌的相对抑菌活性均显著 降低，但仍在50以上，说明菌株具有抑菌活性 的物质可能不是蛋白质，也可能是蛋白质但不包含 芳香族、脂族氨基酸的羧基肽键，不含赖氨酸、精 氨酸及疏水残基肽键。 2.3.3 紫外稳定性 从图7可以看出，经紫外线照 射后，菌株BAF-6发酵滤液对病原菌的相对抑菌 活性均无显著变化。说明菌株发酵滤液抑菌活性不 因紫外照射而降低，适合于田间应用。 2.3.4 酸碱稳定性 从图8可以看出，菌株BAF-6 发酵滤液在pH值为2～9时的相对抑菌活性与对 照均无显著差异，当pH值为10时，菌株的相对 抑菌活性仍为80以上，说明菌株发酵滤液具有 较高的酸碱稳定性。 图 5 菌株 BAF-6发酵滤液的热稳定性 120 100 80 60 40 20 0 相对抑菌活性／％ 温度／℃ CK 60 70 80 90 100 121 a a a ab b c d 图 8 菌株 BAF-6发酵滤液的酸碱稳定性 120 100 80 60 40 20 0 相对抑菌活性／％ pH值 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 CK aaaaa a aaa b c d 图 7 菌株 BAF-6发酵滤液的紫外稳定性 120 100 80 60 40 20 0 相对抑菌活性／％ 时间／h CK 2 4 6 8 a aa a a 图 6 菌株 BAF-6发酵滤液的蛋白酶稳定性 120 100 80 60 40 20 0 相对抑菌活性／％ 时间／h CK 蛋白酶K 胃蛋白酶 胰蛋白酶 c a b b 3 结论与讨论 利用对病原菌具有拮抗作用的细菌等有益微生 物及其代谢产物进行生物防治是防治农作物病害的 有效方法与技术（邱德文，2010） ，既响应农药减 施及化肥零增长的政策，同时有益于环境、生态和 人类健康。寻找高效生防菌资源，是生物防治途径 中最重要的环节。 目前防治马铃薯早疫病的生物菌剂主要为放线 菌、木霉菌，芽孢杆菌的应用很少。芽孢杆菌可产 生耐热抗逆的芽孢，生存能力强，同时是土壤和植 物微生态区系优势种群，有利于在环境中存活、定 殖和繁殖，因此具备较好的生防特性及开发前景（齐 爱勇 等，2011） 。本试验以马铃薯早疫病病原菌茄 链格孢菌为指示菌，通过平板对峙法筛选到1株对 其具有较强抑制效果的菌株BAF-6，经鉴定该菌株 为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。 解淀粉芽孢杆菌是植物病害防治中一大类 芽孢杆菌类群，在生长过程中可产生肽类、聚酮 类、脂肽类等具有抗菌活性的代谢产物（Chen nbsp;et al.，2009）。薛鹏琦等（2011）从解淀粉芽孢杆 菌YBWC43菌株中提取出可抑制油菜菌核病菌的 nbsp;65 nbsp; 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 nbsp;65 nbsp; 研究论文 中 国 蔬 菜 nbsp; nbsp; CHINA VEGETABLES 杆菌霉素D和芬枯草菌素。本试验对BAF-6菌株 发酵滤液性质进行研究，结果表明菌株BAF-6发 酵滤液具有较高的热稳定性，且经蛋白酶K、胰蛋 白酶、胃蛋白酶处理后，发酵滤液的相对抑菌活 性仍在50以上，说明抑菌活性物质可能有一部 分并不是蛋白质，需要进一步对有效抑菌物质进行 分离纯化；菌株BAF-6发酵滤液对紫外线照射具 有较强的抗性，在后期菌株田间应用过程中，发酵 滤液中的活性物质可以有效保留；发酵滤液在pH 值2～10时，相对抑菌活性仍在80以上，说明 菌株发酵滤液具有较高的酸碱稳定性。可见菌株 BAF-6具有开发成马铃薯早疫病新型生防制剂的 nbsp;潜力。 参考文献 布坎南，吉本斯．1984．伯杰细菌鉴定手册．中国科学院微生物 研究所伯杰细菌鉴定手册翻译组译．8版．北京科学出 nbsp;版社． 东秀珠，蔡妙英．2001．常见细菌系统鉴定手册．北京科学出 nbsp;版社． 郭润婷，王惟萍，谢学文，李宝聚．2016．马铃薯早疫病的诊断与 防治．中国蔬菜，（11）80-82． 胡忠亮，郑催云，田兴一，李警保，韩正敏，樊奔．2017．解淀粉 芽孢杆菌HZM9菌株发酵液的抑菌谱及稳定性测定．南京林 业大学学报，3（41）65-70． 齐爱勇，赵绪生，刘大群．2011．芽孢杆菌生物防治植物病害研究 现状．中国农学通报，27（12）277-280． 漆文选．2017．高寒山区马铃薯种薯主要病虫害调查与防治方法． 中国蔬菜，（9）93-98． 邱德文．2010．我国植物病害生物防治的现状及发展策略．植物保 护，36（4）15-18． 王爱军，柴兆祥，李金花，郭庆刚，王蒂．2013．马铃薯干腐病菌 和黑痣病菌拮抗芽胞杆菌的筛选及鉴定．中国生物防治学报， 29（4）586-594． 薛鹏琦，刘芳，乔俊卿，伍辉军，冯致科，高学文．2011．油菜菌 核病生防芽孢杆菌的分离鉴定及其脂肽化合物分析．植物保 护学报，38（2）127-132． 杨艳红，余瑛，胡永强，余溪，李青青．2017．解淀粉芽孢杆菌 AF1发酵液的抗菌活性与抗菌机理．生物技术通报，33（9） 233-230． 姚彦坡．2015．防治马铃薯晚疫病和辣椒疫病木霉菌的筛选及生防 机制研究〔博士论文〕．北京中国农业大学． 原霁虹．2015．马铃薯连作障碍的研究进展．中国马铃薯，29（1） 46-50． Chen X H，Koumoutsi A，Scholz R，Borriss R，Schneider K，Vater nbsp;J，Sssmuth R，Piel J，Borriss R．2009．Genome analysis of nbsp;Bacillus amyloliquefaciens FZB42 reveals its potential for biocontrol nbsp;of plant pathogens．Journal of Biotechnology，140（1）27-37． Wharton P S，Kirk W W，Berry D，Tumbalam P．2007．Seed nbsp;treatment application-timing options for control of Fusarium decay nbsp;and sprout rot of cut seedpieces．American Journal of Potato nbsp;Reseach，84（3）237-244． Screening of Antagonistic Bacteria Against Potato Early Blight and Antibacterial nbsp;Activity of Its Metabolites YANG Ji-ye nbsp;1，2 ，YANG Fan 1，2，3 ，CUI Guan-hui nbsp;1，2 ，SUN Jin-chong nbsp;1，2 ，WANG Ya-na 1，2 ，LIU Hong- wei 1，2 ，CHENG Hui-cai nbsp;1，2 ，ZHANG Li-ping 1，2* （ 1 Institute of Biology，Hebei Academy of Science，Shijiazhuang 050081，Hebei，China； 2 Main Crop Disease Microbial nbsp;Control Engineering Technology Research Center of Hebei Province，Shijiazhuang 050081，Hebei，China； 3 Hebei nbsp;University of Technology，Tianjin 300130，China） AbstractTaking Alternaria solani as a target，this study screened the biocontrol strain BAF-6 with nbsp;strong antagonism against pathogenic bacteria of potato early blight by plate confrontation . The strain was nbsp;identified as Bacillus amyloliquefaciens through morphological，physiological and biochemical tests and 16S nbsp;rDNA sequence analysis. The extracellular metabolites of the strain after 60-80 ℃ heat treatment，its antibacterial nbsp;activity nbsp;was over 95. Under UV irradiation for 8 hours，or when the pH value was 2-10，its antibacterial nbsp;properties were still stable. After protease treatment the strain antibacterial activity was still over 50. Key wordsPotato；Early blight；Antagonistic bacteria；Screening；Identification；Antibacterial activity nbsp;66 nbsp; 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 nbsp;66 nbsp; 研究论文 中 国 蔬 菜 nbsp; nbsp; CHINA VEGETABLES/p