乙烯响应因子ERF参与转基因菊花水培低氧胁迫耐受性的调控.pdf
<p>园艺学报， 2018， 45 (1)： 109 116. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0184； http： /www. ahs. ac. cn 109 收稿日期 ： 2017 05 11； 修回日期 ： 2017 12 12 基金项目 ： “十二五”农村领域国家科技计划课题（ 2013AA102700） ；国家自然科学基金青年基金项目（ 31401909） ；曹光彪高科技发展基金项目 * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： akunzju.edu.cn） 乙烯响应因子 ERF 参与转基因菊花水培低氧胁迫耐受性的调控 刘晓芬，向理理，殷学仁，李 方，陈昆松*（浙江省园艺作物整合重点实验室，浙江大学农业与生物技术学院，杭州 310058） 摘 要： 将参与柿果实低氧胁迫响应的异源基因 DkERF9 转化到切花菊九月九植株中，经 PCR检测，获得了 5 株过量表达（ 35S DkERF9）的阳性植株。进一步比较分析了 35S DkERF9 植株与野生型植株的耐淹水性，发现水培低氧胁迫处理 2 周后， 35S DkERF9 植株较野生型植物生长缓慢，根系生长和茎的伸长均受到显著抑制，叶片颜色较淡；移除水培低氧胁迫处理 3 周后，生长部分恢复，但是叶片颜色及整体长势均弱于野生型植株。 关键词： 菊花； ERF；涝害；低氧胁迫；遗传转化 中图分类号： S 682.1+1 文献标志码： A 文章编号： 0513-353X（ 2018） 01-0109-08 Ethylene Responsive Factors ERF Regulated the Hypoxia Response of Transformed Chrysanthemum Lines LIU Xiaofen， XIANG Lili， YIN Xueren， LI Fang， and CHEN Kunsong*（ Zhejiang Provincial Key Laboratory of Horticultural Plant Integrative Biology， College of Agriculture & Biotechnology，Zhejiang University， Hangzhou 310058， China） Abstract： The exogenous DkERF9， a reported hypoxia responsive gene from persimmon， was transformed into Jiuyuejiu chrysanthemum. Five positive lines（ 35S:DkERF9） were obtained and verified with PCR. Compared to the wild type plants， the growth of 35S:DkERF9 lines were inhibited significantly by water planting treatments for two weeks， as the length of roots and shoots were shorter in 35S:DkERF9 lines. The differences between 35S:DkERF9 lines and wild type plants remain significant，after three weeks recovery. Keywords： chrysanthemum； ERF； waterlogging； hypoxia； transformation 菊花（ Chrysanthemum morifolium Ramat.）是浅根、旱作观赏花卉，忌水涝（尹冬梅， 2011） 。中国南方地区雨量充沛，尤其是在梅雨季节往往因为降雨次数多、强度大、土壤粘重、排水不良而出现水涝胁迫，使菊花的品质受到严重影响，甚至因涝害致死（尹冬梅， 2011） 。 水涝导致土壤中氧气供应不足，造成低氧胁迫，抑制植株生长（ Yin et al.， 2012） 。在水涝过程 Liu Xiaofen， Xiang Lili， Yin Xueren， Li Fang， Chen Kunsong. Ethylene responsive factors ERF regulated the hypoxia response of transformed chrysanthemum lines. 110 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 109 116. 中，植物体内乙烯含量增加，是其对低氧胁迫的一种生态适应性反应（尹冬梅， 2011） 。目前已知模式植物拟南芥中至少有 4 个乙烯响应因子 （ ethylene response factor， ERF） 成员， 即 AtHER1、 AtHER2、AtRAP2.2 和 AtRAP2.12，参与植株低氧耐性的调控 （ Hinz et al.， 2010； Yang et al.， 2011； Gasch et al.，2016； Paul et al.， 2016） 。在菊花植株中， ERF 成员是否同样可参与低氧胁迫的调控，尚不清楚。 由于菊花高度杂合的特点，其常规杂交育种存在不确定性（成丽娜 等， 2013） 。近年来菊花转基因育种获得较大发展，主要集中在观赏性状、花朵开放、抗病性及抗虫性和非生物胁迫耐性等方面（ Brugliera et al.， 2013；成丽娜 等， 2013） ，其中非生物胁迫耐性改良育种主要集中在对高温、低温和盐胁迫等的抗性（ Hong et al.， 2006a， 2006b， 2009； Chen et al.， 2011， 2012） ，但针对菊花耐涝性相关的遗传转化鲜有报道。 Min 等 （ 2012） 发现柿果实 DkERF9 可增强丙酮酸脱羧酶编码基因 DkPDC2 启动子的转录活性，从而促进乙醛含量增加。乙醛可在脱氢酶 ADH 的催化下生成乙醇（ Loreti et al.， 2016） ，若大量积累可对植株产生毒害效应。据此推测 DkERF9 可负向调节植物低氧胁迫响应。 为验证这一推论，本研究构建了九月九切花菊品种的遗传转化体系，并获得 35S:DkERF9转基因植株。分析其影响菊花对水涝低氧耐性的作用，为后续挖掘菊花同源 ERF，改良抗涝性奠定基础。 1 材料与方法 1.1 植物材料 供试菊花九月九品种地下茎芽材料于 2014 年采自浙江省新昌丰岛花卉基地，并在浙江大学果树所组培室经表面消毒后培养成无菌苗，培养条件为 16 h/8 h 光暗周期、温度 25 。 1.2 遗传转化体系的建立 将柿果实乙烯响应因子 DkERF9（ GenBank JX117848）搭载到双元表达载体 pGreen SK 的多克隆位点中，构建过表达质粒 pGreen SK:DkERF9。进而将质粒电转到 EHA105 农杆菌菌株中，以无菌苗的叶片及其部分叶柄为外植体进行遗传转化。 农杆菌浸染浓度为 OD600= 0.6 0.8， 浸染 10 min。筛选培养基为 MS + 1.0 mg · L-16-BA + 0.5 mg · L-1NAA + 10 mg · L-1Kan + 50 mg · L-1 Meropenem的再生培养基。 待不定芽伸长生长至 1 cm 以上时，转至诱根培养基 MS + 10 mg · L-1Kan 和 50 mg · L-1Meropenem。待植株根系生长至 2 cm 以上时，将其移栽到基质（泥炭土 珍珠岩 蛭石 草木灰 = 5 1 1 1）中，覆透光保湿的塑料薄膜，炼苗培养 7 d。培养箱条件为 16 h/8 h 光暗周期，昼夜温度25 /20 ，相对湿度 60%。 1.3 阳性植株 PCR 检测 切取约 0.1 g 的转基因菊花组培苗叶片，经液氮冷冻后研磨成粉，选用 TPS 试剂结合水浴法提取基因组 DNA。以 DkERF9 目标基因特异序列克隆引物（表 1） ，选用 Phanta®Super-Fidelity DNA Polymerase（ Vazyme，中国）结合 PCR 技术扩增植株中目标基因。以野生型植株 DNA 为阴性对照，电泳分析转基因植株中目标基因 DkERF9 的整合情况。 刘晓芬，向理理，殷学仁，李 方，陈昆松 . 乙烯响应因子 ERF 参与转基因菊花水培低氧胁迫耐受性的调控 . 园艺学报， 2018， 45 (1)： 109 116. 111 表 1 研究所用引物列表 Table 1 Primer sequences used in this study 用途Test 引物名称 Primer 序列 Sequence 35: DkERF9 阳性株检测 Test the positive 35S:DkERF9 DkERF9-T-FP GTCGCCTCAGAAAGCCAAAAGGC DkERF9-T-RP TCATCCAGCAGCTTCACATTCTTC DkERF9 表达检测 Test the DkERF9 expression patterns DkERF9-Q-FP CAGATCAGCGGCTTGATTTC ERF9-Q-RP TAGGCATCAACTTCGGCATC 实时定量 PCR 内参基因引物 The reference gene used in real-time PCR CmACT-Q-FP CACCCCCAGAGAGAAAATAC CmACT-Q-FP ATCTGTTGGAAGGTGCTGAG 切取约 0.1 g 的转基因菊花组培苗叶片，经液氮冷冻后研磨成粉，选用 TRIZOL（ Invitrogen，中国）试剂提取叶片总 RNA。 应用 DNase（ Fermentas， USA）消除 RNA 中潜在的基因组 DNA。吸取 1 g RNA 逆转录合成 cDNA（ Bio-rad， USA） 。 选用 SsoFast Eva Green supermix（ Bio-rad， USA） ， 结合目标基因 DkERF9的实时定量 PCR 引物， 分析 35S:DkERF9 植株中基因表达。 以野生型植株组培苗 RNA 为阴性对照，设置 CmACT 为内参，计算 DkERF9 相对表达量。每株野生型和 35:DkERF9 植株取 3 个样品，分别检测基因表达情况。 1.4 阳性植株二次生根验证 选取成功诱导生根的阳性植株，切取其带有 2 片嫩叶的茎尖，置于 MS + 25 mg · L-1Kan + 50 mg · L-1Meropenem 培养基中继续诱根培养 7 14 d，观察根系的生长状况，确认其遗传转化成功的可信性。 1.5 植株水培低氧胁迫处理及生长指标 选取带 4 片叶片且长势相同的野生型和 35S:DkERF9 组培苗，炼苗后将根系置于盛满水的组培盒（锡箔包裹）中至底部第 1 片叶片接近水位，重新置于培养室内培养 14 d。水培（低氧胁迫）处理后，将植株重新栽培于基质中进行恢复培养。 测量低氧胁迫后植株整株质量、地上部茎长和根长。 2 结果与分析 2.1 35S:DkERF9 转基因植株的获得 将无菌苗（图 1， A）制备外植体，经过含 35S:DkERF9 表达质粒的 EHA109 农杆菌浸染转化后，移至筛选培养基进行不定芽诱导， 14 d 后外植体发黄变软，切口处形成愈伤组织（图 1， B） ；继续培养 28 d 后，愈伤组织则分化出较多不定芽或者形成芽点（图 1， C） ；待不定芽生长至 1 cm以上时，将其切离外植体并置于 MS + 10 mg · L-1 Kan + 50 mg · L-1Meropenem 的培养基上进行生根诱导（图 1， D） ，获得了多个潜在的 35S:DkERF9 植株。 Liu Xiaofen， Xiang Lili， Yin Xueren， Li Fang， Chen Kunsong. Ethylene responsive factors ERF regulated the hypoxia response of transformed chrysanthemum lines. 112 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 109 116. 图 1 35S:DkERF9九月九菊花遗传转化体系构建 A：无菌苗培育； B：外植体筛选培养 14 d 后长势； C：外植体筛选培养 28 d 后长势； D：抗性苗根诱导培养。 Fig. 1 The 35S:DkERF9 Jiuyuejiu chrysanthemum transformation was showed with the photos in different cultural time A： The aseptic seedling culture； B： The selective culture of explants for 14 days； C： The selective culture of explants for 28 days； D： The root culture of the adventitious buds. PCR 电泳检测结果（图 2）显示，有 5 株基因组 DNA 中呈现 DkERF9 特异序列条带，而野生型植株（ WT）基因组 DNA 中则无目标条带，有些植株则为假阳性。 图 2 目标基因 DkERF9 在九月九菊花中遗传转化 PCR 检测 Fig. 2 Transformation of DkERF9 into Jiuyuejiu chrysanthemum was detected by PCR 进一步分析 5 株 35S:DkERF9 植株中目标基因 DkERF9 的相对表达量，结果（图 3）发现，其DkERF9 的相对表达量显著上调，其中 Line4 和 Line7 中表达量最高， Line8 中 DkERF9 的表达量则相对较低，而野生型植株（ WT）则无表达。 刘晓芬，向理理，殷学仁，李 方，陈昆松 . 乙烯响应因子 ERF 参与转基因菊花水培低氧胁迫耐受性的调控 . 园艺学报， 2018， 45 (1)： 109 116. 113 图 3 35S:DkERF9 植株中 DkERF9 表达的 RT-PCR 分析 Fig. 3 The transcript levels of DkERF9 in 35S:DkERF9 transgenic lines were analyzed with real-time PCR 2.2 应用二次生根方法再次确认目标基因 DkERF9 在 35S:DkERF9 植株中的表达 为了确保每批次扩繁的 35S:DkERF9 植株中目标基因不丢失，所有用于后续处理的组培苗均经过抗生素选择压再次诱根。结果（图 4）显示， 5 株 35S:DkERF9 植株的茎尖在含有 Kan 的选择培养基中均能在 7 d 左右快速生根。进一步说明 DkERF9 稳定存在于 35S:DkERF9 植株基因组中。 图 4 应用二次生根法验证目标基因 DkERF9 存在于阳性转基因菊花基因组中 Fig. 4 Verification of DkERF9 existing in the genome of the positive transgenic lines 2.3 水培低氧胁迫处理显著抑制 35S:DkERF9 菊花植株的长势 本研究中发现，野生型和 5 个 35S:DkERF9 株系植株经水培低氧胁迫处理 14 d 后，长势均受到影响（图 5） ：野生型植株虽然叶片数量增加明显，但是基部叶片出现失绿萎蔫现象；与野生型相比，5 个 35S:DkERF9 株系植株叶片增长均被显著抑制，其中 Line7 和 Line4 极为显著， Line8 尽管叶片数量有所增加，但是叶片却呈浅绿色，这与尹冬梅（ 2011）的研究结果一致。其余 4 株不仅叶片数量增加缓慢，部分叶片甚至变成褐色。 水培低氧胁迫处理同时显著抑制 35S:DkERF9 植株茎和根的生长（图 5） 。处理 14 d 后，野生型植株茎伸长为 12.5 cm，而 5 株 35S:DkERF9 植株 Line8、 Line3、 Line2、 Line7 和 Line4 的茎长则Liu Xiaofen， Xiang Lili， Yin Xueren， Li Fang， Chen Kunsong. Ethylene responsive factors ERF regulated the hypoxia response of transformed chrysanthemum lines. 114 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 109 116. 分别为 4.5、 3.5、 3.0、 2.5 和 1.8 cm，仅为野生型植株的 16% 30%。处理 2 周后，野生型植株根系伸长为 20 cm，且有大量的须根生成。 Line8、 Line3、 Line2、 Line7 和 Line4 的根长则分别为 11、 13、13、 10.5 和 8.0 cm，且须根生成的数量远远少于野生型植株。 此外， 5 株 35S:DkERF9 菊花植株鲜样质量的增长亦被水培低氧胁迫处理所抑制。在低氧胁迫处理 2 周后，野生型植株鲜样质量为 1.8 g，而 5 株 35S:DkERF9 植株的鲜样质量则仅为野生型的10% 45%。 图 5 水培低氧胁迫对 35S:DkERF9 植株叶片和根系生长的影响 Fig. 5 The effect of water planting on the leaves and roots development of 35S:DkERF9 transgenic lines 2.4 移除水培低氧胁迫处理后 35S:DkERF9 菊花植株的生长情况 水培低氧胁迫处理 14 d 后，将野生型和 35S:DkERF9 植株重新栽培于基质中，维持正常的水肥管理，恢复生长 21 d。除 Line4 在此期间死掉外，其余植株整体长势良好，叶片伸展面积增大，色泽均匀。然而与野生型相比， 4 个 35S:DkERF9 株系植株叶片伸展较小，且色泽呈现浅绿色或黄绿色，而且其茎的伸长亦短于野生型（图 6） ，整体长势滞后于野生型。 图 6 转基因各株系植株在水培低氧胁迫处理后恢复 21 d 后的生长状况比较 Fig. 6 The growth status of wild type plants and 35:DkERF9 lines after 21 days in the normal growth condition 刘晓芬，向理理，殷学仁，李 方，陈昆松 . 乙烯响应因子 ERF 参与转基因菊花水培低氧胁迫耐受性的调控 . 园艺学报， 2018， 45 (1)： 109 116. 115 3 讨论 淹水、涝害等非生物胁迫可直接或间接的影响植物生理代谢，抑制其生长，甚至致死。多数研究表明， 淹水会导致植物根系导水性能损坏 （ Jackson & Drew， 1984） ， 植株萎蔫 （ Parent et al.， 2008） ，叶片叶绿素含量降低（齐琳 等， 2015）等。本研究中淹水可极显著的抑制 35S:DkERF9 菊花植株根系的生长，以及叶片颜色。 对于耐涝性强的物种，可通过改变不同器官的组织形态来适应逆境胁迫。 Yin 等（ 2012）研究发现淹水 10 d 后，耐涝物种紫花野菊叶片上下表皮、栅栏组织和海绵组织等厚度均有所增加，其中栅栏组织与海绵组织厚度的比值亦较对照上升 40%；根系皮质组织中细胞间隙的空间亦增大为对照的 8.9 倍。进一步分析发现，淹水时紫花野菊根系中乙醇脱氢酶（ ADH）和丙酮酸脱羧酶（ PDC）活性仅有瞬时的增强，然而不耐涝的菊花脑中此两种酶的活性则是持续增强（ Yin et al.， 2013） 。 在植物体内， PDC 和 ADH 可分别催化丙酮酸和乙醛生成乙醇（ Loreti et al.， 2016） ，而较高浓度的乙醇则显著抑制植物根系的生长，甚至致死（ Yin et al.， 2013） 。柿果实 DkERF9 可显著增强DkPDC2 启动子活性，进而增强 DkPDC2 酶活性，调控柿果实对低氧胁迫的响应（ Min et al.， 2012） 。当 DkERF9 在菊花植株中过量表达时，推测菊花体内 PDC 酶会维持较高的活性，此是 35S:DkERF9菊花植株淹水处理时生长受抑制的主要原因。然而这一推论尚需后续验证。 后续研究可挖掘与抗涝性相关的菊花同源 ERF 成员，分析其调控机制，进而达到改良菊花耐涝性的目标。 References Brugliera F， Tao G Q， Tems U， Kalc G， Mouradova E， Price K， Stevenson K， Nakamura N， Stacey I， Katsumoto Y， Tanaka Y， Mason J G. 2013. 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