百合抗病无性系抗枯萎病的蛋白质组学分析.pdf

p园艺学报， 2018， 45 3 530– 540. Acta Horticulturae Sinica nbsp; 530 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; doi 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0343； http //www. ahs. ac. cn 收稿日期 2017– 09– 01； 修回日期 2018– 03– 05 基金项目 国家自然科学基金项目（ 31260484） ；云南省科技人才和平台计划项目（ 2017HB083） ；云南省科技创新人才计划科技领军人才项目（ 2016HA005） ；国家高技术研究发展计划“ 863”项目（ 2011AA100208） nbsp;* 通信作者 nbsp;Author for correspondence（ E-mail ， ） nbsp;百合抗病无性系抗枯萎病的蛋白质组学分析 nbsp;张艺萍1,2，瞿素萍2，杨秀梅2，马璐琳2，许 nbsp;凤2，王继华2,*，何月秋1,*（1云南农业大学植物保护学院，昆明 nbsp;650205；2云南省农业科学院花卉研究所，国家观赏园艺工程研究中心，云南省花卉育种重点实验室，云南省花卉工程技术研究中心，昆明 nbsp;650205） nbsp;摘 nbsp;要 以百合抗病无性系和感病无性系为试验材料，开展了百合抗尖孢镰刀菌枯萎病的蛋白质组学研究，以期明确抗病无性系参与抗病反应的关键蛋白。利用蛋白质双向凝胶电泳技术，对被百合尖孢镰刀菌诱导 0、 24、 48 和 72 h 的抗病无性系和感病无性系进行差异蛋白分析。经质谱检测及数据库检索，鉴定了 25 个差异蛋白质点，其中 10 个鉴定为未知功能的蛋白，其余 15 个依据其相关功能分为 4 类，即防御反应相关蛋白、光合作用相关蛋白、糖类及能量代谢相关蛋白和热激蛋白。其中参与防御反应的病程相关蛋白（推定的抗病蛋白 RPS2、推定的抗晚疫病同族蛋白 R1C-3、过氧化物酶 Q、抗坏血酸过氧化物酶和 NBS-LRR 类似蛋白）可能是百合抗病无性系介入抗病防御反应的关键蛋白。 nbsp;关键词 百合；总蛋白提取；双向电泳；尖孢镰刀菌百合专化型；差异蛋白质组 nbsp;中图分类号 S 682.2 nbsp; nbsp; nbsp; 文献标志码 A nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;文章编号 0513-353X（ 2018） 03-0530-11 Proteomics Analysis of Lily Blight Disease-resistant Clones nbsp;ZHANG Yiping1,2， QU Suping2， YANG Xiumei2， MA Lulin2， XU Feng2， WANG Jihua2,*， and HE Yueqiu1,*（1College of Plant Protection， Yunnan Agricultural University， Kunming 650205， China；2 Flower Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences， National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture， Yunnan Flower Breeding Key Laboratory， Yunnan Flower Engineering Center， Kunming 650205， China） nbsp;Abstract To elucidate the key proteins related to disease-resistance of lily induced by Fusarium oxysporum f. sp. lilii， protein two-dimensional gel electrophoresis technology was used to analyze profiles of the disease-resistant and susceptible clones after inoculation of Fusarium oxysporum f. sp. lilii for 0，24， 48 and 72 h. Tweenty-five differentially expressed proteins were successfully identified， including 10 differentially expressed proteins identified as unknown function proteins. The rest of the 15 differentially expressed proteins can be categorized into 4 classes according to the function， namely the defense reaction， photosynthesis， carbohydrate and energy metabolism， and heat shock-related proteins. The disease related proteins participated in the defense reaction including presumption of disease-resistant protein RPS2， putative late blight resistant protein homolog R1C-3， peroxidase Q， ascorbate peroxidase and NBS-LRR-like protein， which may play key roles in the resistance against lily blight. Keywords lily； protein extraction； two-dimensional electrophoresis； Fusarium oxysporum f. sp. lilii；differential proteomics 张艺萍，瞿素萍，杨秀梅，马璐琳，许 nbsp; 凤，王继华，何月秋 . 百合抗病无性系抗枯萎病的蛋白质组学分析 . 园艺学报， 2018， 45 3 530– 540. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 531 尖孢镰刀菌百合专化型（ Fusarium oxysporum f. sp. lilii）是引起百合枯萎病的土传真菌，很难有效防治（ van Heusden et al.， 2002； Lim et al.， 2005），选育和利用抗病品种成为主要的防治措施。采用蛋白质双向电泳技术来挖掘百合的抗病相关蛋白，可为百合抗病细胞工程育种提供理论依据。 nbsp;当植物受到病原菌侵害时，植物将改变体内蛋白质的表达来完成信号的感应和传递，引起植物相应的反应机制。所以病害的发生和抗病性的形成与蛋白质的数量和功能的改变密切相关。病原菌是诱发寄主植物发病的主要生物胁迫因子。以往关于模式植物抗病分子机制研究表明，植物受病原菌胁迫时，体内先天免疫受体（即抗病蛋白）会识别病原菌效应因子，引发寄主抗病反应，实现对病原菌胁迫信号的响应、传递以及生物学防御（ Volk et al.， 2008； Bednarek amp; Osbourn， 2009； Soh et al.， 2012） 。理永霞（ 2011）利用蛋白质双向电泳技术研究了杨树与溃疡病菌的互作机制，鉴定出606 个差异蛋白，其中 18 个是植物与病原菌互作相关蛋白， 10 个是过氧化蛋白， 31 个是苯丙氨酸合成代谢相关蛋白。高巍（ 2014）利用蛋白质双向电泳技术研究了棉花响应黄萎病菌的分子机制，共得到 188 个差异蛋白，其中参与细胞过程、代谢过程和应激反应的蛋白数量最多，这些蛋白共同参与了棉花对黄萎病菌入侵的响应。王晓清（ 2014）利用蛋白质双向电泳技术研究了拟南芥抗病突变体 cpr30 的抗病机制，鉴定出了 33 个差异蛋白点，这些差异表达蛋白包括防御相关蛋白、氧化还原相关蛋白、能量代谢相关蛋白、信号转导相关蛋白等。 nbsp;目前，关于百合枯萎病的研究主要集中于防治方法、 病原菌鉴定、 种质资源抗性评价等方面 （张丽丽， 2013；魏志刚， 2014；罗建让和谢松林， 2015） 。有关百合抗病机制的研究报道较少（饶建，2013） 。前期通过百合尖孢镰刀菌毒素加压筛选获得了百合抗病性无性系（ Zhang et al.， 2014） ，为揭示其抗性机制，开展了百合抗病无性系和感病无性系的差异蛋白质组研究，通过对抗性相关蛋白的差异表达分析，可从分子水平直接了解百合抗病无性系所启动的抗性机制。 nbsp;1 nbsp;材料与方法 nbsp;1.1 nbsp;植物材料和取样方法 nbsp;供试菌种百合枯萎病菌和东方百合品种‘卡萨布兰卡’抗病无性系和感病无性系均来自本实验室， 2014 年反复筛选并经过抗性鉴定获得。‘卡萨布兰卡’抗病无性系为中抗，病情指数为 28。本试验在 2015 2016 年在云南省农业科学院花卉育种重点实验室进行。 取抗病无性系和感病无性系生长健壮、长势一致的组培生根苗，以 1 106个 nbsp; mL-1（含 0.01吐温– 20，体积比）百合尖孢镰刀菌孢子悬浮液浸泡组培苗根部（根部切去一部分以便创造伤口） ， 25 ℃下光照 12 h/黑暗 12 h 交替培养。分别于接种前和接种后 24、 48 和 72 h 随机选取 9 株组培苗的叶片，液氮固定后于– 80 ℃冰箱保存备用，每 3 株作为 1 个重复，共 3 次重复。 nbsp;1.2 nbsp;百合叶片总蛋白提取 nbsp; 采用三氯乙酸（ TCA）丙酮法提取蛋白质（ Blacks amp; Wei， 1999）。准确称取东方百合品种‘卡萨布兰卡’抗病无性系和感病无性系、接种百合枯萎病菌后 24 和 48 h 的百合叶片各 2 g，于液氮中迅速研磨成粉末。取 20 mL 10三氯乙酸丙酮溶液（含 1苯甲基磺酰氟和 1 mg mL-1二硫苏糖醇） ， 将研钵内粉状物清洗至 50 mL 离心管中， 迅速置于– 20 ℃冰箱中保存过夜； 而后 20 000 r min-1离心 20 min； 弃上清液； 量取 20 mL 80的预冷丙酮溶液 （含 1苯甲基磺酰氟和 1 mg mL-1二硫苏糖醇）加入离心管中，振荡后于– 20 ℃冰箱中放置 2 h，使蛋白质沉降； 4 ℃， 20 000 r min-1Zhang Yiping， Qu Suping， Yang Xiumei， Ma Lulin， Xu Feng， Wang Jihua， He Yueqiu. Proteomics analysis of lily blight disease-resistant clones. 532 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 3 530– 540. 离心 15 min，弃上清液；重悬沉淀于等体积 80的预冷丙酮溶液各洗涤 2 次； 4 ℃， 15 000 r min-1离心 15 min；沉淀进行真空冷冻干燥后，置于– 80 ℃超低温冰箱中保存。 nbsp;1.3 nbsp;蛋白质样品溶解与定量 nbsp;将 450 L 裂解液（ 7 mol L-1尿素， 2 mol L-1硫脲， 40 mg mL-1 CHAPS， 65 mmol L-1DTT和 0.2 Bio-Lyte）加入到 30 mg 蛋白干粉中，裂解 1 h； 4 ℃， 12 000 r min-1离心 15 min，上清液中加入 1 600 2 000 L 无水丙酮（含 1 mg mL-1二硫苏糖醇） ，边加边摇匀，– 20 ℃冰箱中放置2 h， 4 ℃， 15 000 r min-1离心 30 min，弃上清液；加入 1 mL 4 ℃预冷的超纯水（含 1 mg mL-1二硫苏糖醇） ， 4 ℃， 15 000 r min-1离心 25 min，弃上清液；加入 7 mol L-1水化液（含 0.2载体两性电解质和 0.1 mg mL-1二硫苏糖醇） 150 200 L。蛋白质的定量参考 Bradford 的方法进行测定（ Gurusamy amp; Christof， 2006） 。 nbsp;1.4 nbsp;双向电泳 nbsp;第一向等点聚焦选用 11 cm 非线性 pH 4 7 的 IPG 胶条（ Bio-Rad 公司） 。蛋白样品溶液中加入水化缓冲液（ 2 mol L-1的硫脲， 7 mol L-1的尿素， 40 mg mL-1的 CHAPS， 10 mg mL-1的 DTT，0.4的 Bio-Lyte 和 0.001溴酚蓝）至终体积 300 L，蛋白样品上样量为 600 g； 20 ℃下按 Bio-Rad 公司提供的等电聚焦程序设定后聚焦。聚焦完毕，将 IPG 胶条放入平衡液Ⅰ（ 6 mol L-1尿素， 20 mg mL-1SDS， 0.375 mol L-1 pH 8.8 Tris-HCl， 20甘油， 10 mg mL-1DTT）中并置于摇床上， 30 40 r min-1，摇动 15 min，随后再放入平衡液Ⅱ（ 6 mol L-1 的尿素， 20 mg mL-1的 SDS， 0.375 mol L-1pH 8.8 Tris-HCl， 20甘油， 5碘乙酰胺）中并置于摇床上， 30 40 r min-1，摇动 15 min，平衡结束后进行第二向凝胶电泳。将平衡好的 IPG 胶条推进 12.5的聚丙烯酰胺凝胶上，使用Bio-Rad PROTEAN XL/PowerPac（ 11 cm IPG 胶条）的电泳系统进行电泳， 11 ℃的循环水冷却；开始时电压设置为每板 100 V（ Bio-Rad PROTEAN XL/PowerPac） ，当溴酚蓝完全进入凝胶后加大电压为每板 400 V（ Bio-Rad PROTEAN XL/PowerPac） ，待溴酚蓝跑至聚丙烯酰胺凝胶底部的距离为 0.5 cm 时，终止电泳（李勤， 2011） 。 nbsp;1.5 nbsp;染色及图像采集分析 nbsp;凝胶先用固定液（ 40乙醇和 10乙酸）固定 1 3 h，用超纯水清洗 2 次，再用染色液（ 100 mg mL-1硫酸铵， 10磷酸， 0.12 mg mL-1G-250， 20甲醇）染色 1 d，而后用超纯水漂洗后再用脱色液（ 50 mg mL-1硫酸铵， 10甲醇）脱色，直到背景干净，蛋白质点清晰为止。采用伯乐蛋白质扫描仪（ Bio-Rad GS900）扫描凝胶图像（分辨率为 300 dpi） ，用 Bio-Rad 的 PD Quest 8.0 软件进行凝胶电泳图谱的斑点检测。 nbsp;1.6 nbsp;差异蛋白点酶解处理及质谱分析 nbsp;将差异表达蛋白点从凝胶上切下来，通过胶内原位酶解方法，抽提酶解肽段，再经过 Zip Tip脱盐、酶解液真空浓缩等完成酶解处理（张彩霞 nbsp;等， 2015）。浓缩后的酶液用 ABI 4800 MALDI TOF/TOF 串联飞行时间质谱仪（ Applied Biosystems， Foster City， CA）进行肽指纹图谱（ PMF）鉴定。质谱操作采用正离子反射模式，质谱分析使用标准肽混合物[ 904.458， Gradykinin； 1296.685，AngiotensinⅠ； 1570.677 Glul-Fibrinopeptide； 2093.08， ACTH（ 1-17）； 2465.199， ACTH（ 18-39）；3657.929， ACTHⅡ（ 7-38）]（ ABI4700 Calibration Mixture）作为外标校正，每个样品质谱信号累张艺萍，瞿素萍，杨秀梅，马璐琳，许 nbsp; 凤，王继华，何月秋 . 百合抗病无性系抗枯萎病的蛋白质组学分析 . 园艺学报， 2018， 45 3 530– 540. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 533 计扫描 600 800 次，扫描范围为 800 4 000 D 得到鉴定蛋白的肽指纹图谱。从一级质谱的肽质量指纹图谱中选择信噪比（ S/N）大于 50 的 7 个得分最高的前体离子做 MS/MS 分析，质谱信号累计扫描 900 1 200 次，得到其序列信息，对一级质谱鉴定的蛋白质进行进一步确认。 nbsp;1.7 nbsp;数据库检索 nbsp;酶解样品经过质谱检测后得到 PMF 图谱数据， 从 GPS Explorer 软件 （ V3.6， Applied Biosystems）得到 MS 和 MS/MS 的数据，然后进行 NCBI 数据库搜库。搜库的参数设置如下种类 all species，切割酶 Trypsin，允许最大未酶切位点（ Missed cleavage）数为 1，部分修饰为 cysteine carboamido methylated 和 methionine oxidized，无固定修饰。 MS 的误差 150 200 mg mL-1， MS/MS 的误差为0.2 0.3 D， 去除已知污染物 keratin。 得分 （ MS 和 MS/MS 联合） 超过 65 被认为超过阈值 （ P ≤ nbsp;0.05） ，为可信的鉴定结果。 nbsp;1.8 nbsp;鉴定蛋白质不同时间点的表达 nbsp;从鉴定出的蛋白质中选取与抗病性紧密相关的蛋白质，并以百合感病无性系为对照，计算其在百合抗病无性系中 24、 48 和 72 h 的表达倍数。 nbsp;2 nbsp;结果与分析 nbsp;2.1 nbsp;百合抗病无性系和感病无性系接种尖孢镰刀菌后的症状表现 nbsp;百合抗病无性系和感病无性系接种尖孢镰刀菌 7 d 后，抗病无性系仅见轻微的症状，小鳞茎基部稍发褐， 而感病无性系则发生明显的枯萎病症状，叶片萎蔫，小鳞茎基部褐化， 并见白色菌丝 （图 1） 。 nbsp;图 1 nbsp;百合抗病无性系和感病无性系接种尖孢镰刀菌后的症状 nbsp;Fig. 1 nbsp;Symptom induced by Fusarium oxysporum f. sp. lilii in disease-resistant and susceptible clones 2.2 nbsp;百合抗病无性系和感病无性系的双向电泳图谱分析 nbsp;对抗病无性系和感病无性系及其接种尖孢镰刀菌后 24、 48 和 72 h 的叶片总蛋白进行分析，经双向电泳分离后获得清晰的蛋白质表达谱（图 2）。 nbsp;Zhang Yiping， Qu Suping， Yang Xiumei， Ma Lulin， Xu Feng， Wang Jihua， He Yueqiu. Proteomics analysis of lily blight disease-resistant clones. 534 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 3 530– 540. 图 2 nbsp;百合抗病无性系和感病无性系接菌不同时间点蛋白质双向电泳图 nbsp;Fig. 2 nbsp;Separation 2-D profiles of lily disease-resistant and susceptible clones for different time inoculated by Fusarium oxysporum f. sp. lilii 张艺萍，瞿素萍，杨秀梅，马璐琳，许 nbsp; 凤，王继华，何月秋 . 百合抗病无性系抗枯萎病的蛋白质组学分析 . 园艺学报， 2018， 45 3 530– 540. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 535 4 组凝胶图谱经 PD Quest™ 2-D Analysis Software 8.0 软件分析，每张图谱上均有 800 个以上可重复清晰蛋白点被检测到， 蛋白点主要分布在 pH 4 7， 分子量为 10 000 150 000 D 的区域内。 nbsp;通过 PD Quest 软件计算蛋白点相对丰度的变化，可初步获得差异表达的蛋白点。 4 组图谱差异分析结果显示，有 25 个蛋白质点发生变化（相对体积增加或者降低 nbsp;≥ 1.5 倍）。 nbsp;2.3 nbsp;差异蛋白质点质谱分析及功能鉴定 nbsp;对检验出的 25 个差异蛋白点进行质谱（ MALDI-TOF/TOF MS）分析，根据各蛋白点鉴定所得PMF 图谱数据，去除杂峰后，进入蛋白质数据库进行匹配检索。在鉴定的差异蛋白中共包括 4 个下调蛋白和 21 个上调蛋白（图 3，表 1）。 nbsp;图 3 nbsp;百合抗病无性系和感病无性系接种尖孢镰刀菌后 nbsp;0、 24、 48 和 72 h 差异蛋白点表达图谱放大图 nbsp;Fig. 3 nbsp;Enlarged views of differential protein spots of lily disease-resistant and susceptible clones for nbsp;0， 24， 48 and 72 h inoculated by Fusarium oxysporum f. sp. lilii Zhang Yiping， Qu Suping， Yang Xiumei， Ma Lulin， Xu Feng， Wang Jihua， He Yueqiu. Proteomics analysis of lily blight disease-resistant clones. 536 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 3 530– 540. 表 1 nbsp;通过质谱和数据库搜索鉴定出来的差异蛋白点 nbsp;Table 1 nbsp;Identification of differential proteins of lily disease-resistant clone and susceptible clone with MALDI-TOF/TOF and database searching 斑点编号 nbsp;Spot No. nbsp;蛋白名称 nbsp;Protein name 登录号 nbsp;Accession No. 蛋白分子量 /等电点Protein MW/pI 物种 nbsp;Species 蛋白得分 nbsp;Protein nbsp;score 可能的功能 nbsp;Possible function S1 二磷酸核酮糖羧化 /加氧酶 nbsp;Ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase gi|134035003 15 036.4/4.35 花生 nbsp;Arachis hypogaea 204 光合作用 nbsp;Phytosynthesis S2 未知 Unknown gi|217072704 29 191.6/4.7 蒺藜状苜蓿 nbsp;Medicago truncatula 57 未知蛋白 nbsp;Unknown protein S3 未知蛋白 Uncharacterized nbsp;protein LOC100286153 gi|226531522 84 417.3/5.85 玉米 nbsp;Zea mays 157 未知蛋白 nbsp;Unknown protein S4 琥珀酸脱氢酶 nbsp;Succinate dehydrogenase gi|255579273 68 462.8/6.18 蓖麻 nbsp;Ricinus communis 49 三羧酸循环代谢 nbsp;TCA metabolic A1 代谢转运超级家族 nbsp;Drug/Metabolite transporter nbsp;superfamily gi|303277003 37 909.1/10.07 微胞藻 nbsp;Micromonas pusilla CCMP1545 51 能量代谢 nbsp;Energy metabolismA2 假设蛋白 Hypothetical nbsp;protein VITISV_001216 gi|147804938 97 671.3/6.12 葡萄 Vitis vinifera 43 未知蛋白 nbsp;Unknown protein A3 假设蛋白 nbsp;Hypothetical protein OsI_04745 gi|125528674 102 532.4/6.35 籼稻 Oryza sativa nbsp;Indica Group 64 未知蛋白 nbsp;Unknown protein A4 预测蛋白 nbsp;Predicted protein gi|224094841 50 820.5/6.4 毛果杨 nbsp;Populus trichocarpa 51 未知蛋白 nbsp;Unknown protein A5 放氧增强蛋白 1 Oxygen-evolvingenhancer protein 1， chloroplasticgi|11133881 34 847.8/6.26 田野贝母 nbsp;Fritillaria agrestis 247 光合作用 nbsp;Photosynthesis A6 抗病蛋白 RPS2 Disease resistant protein RPS2 gi|255581680 128 309.3/5.84 蓖麻 nbsp;Ricinus communis 54 防御反应 nbsp;Defense response A7 热激蛋白 nbsp;Heat shock protein gi|255545176 80 723.1/ 4.99 蓖麻 nbsp;Ricinus communis 164 保护反应 nbsp;Protect response A8 预测蛋白 nbsp;Predicted protein gi|326490934 48 201.4/5.39 青稞 Hordeum vulgare nbsp;subsp. vulgare 61 未知蛋白 nbsp;Unknown protein A9 二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶大 nbsp;亚基结合蛋白 Rubisco large nbsp;subunit-binding protein subunit nbsp;beta， chloroplastic gi|2506277 62 945.3/5.85 豌豆 Pisum sativum 226 光合作用 nbsp;Phytosynthesis A10 假设蛋白 nbsp;Hypothetical protein gi|50726121 15 823.1/11.7 粳稻 Oryza sativa nbsp;Japonica Group 58 未知蛋白 nbsp;Unknown protein B1 假设蛋白 Hypothetical protein OsJ_11623 gi|222625312 65 595.5/9.68 粳稻 Oryza sativa nbsp;Japonica Group 60 未知蛋白 nbsp;Unknown protein B2 推定抗晚疫病蛋白同族 R1C-3 Putative late blight resistant nbsp;protein homolog R1C-3 gi|75261520 149 682.2/5.84 马铃薯野生种 nbsp;Solanum demissum 43 防御反应 nbsp;Defense response B3 热激蛋白 nbsp;Heat shock protein 90 gi|260505494 90 303.7/4.92 牵牛花 nbsp;Ipomoea nil 121 保护反应 nbsp;Protect response B4 Os07g0136500 gi|297606704 13 014.7/10.88 粳稻 Oryza sativa nbsp;Japonica Group 51 未知蛋白 nbsp;Unknown protein B5 过氧化物酶 nbsp;Peroxiredoxin Q gi|215254425 23 574.1/9.37 海篷子 nbsp;Salicornia herbacea 66 防御反应 nbsp;Defense response B6 热激蛋白 nbsp;Heat shock protein 70 gi|189380223 75 068.5/5.54 茶树 nbsp;Camellia sinensis 193 保护反应 nbsp;Protect response C1 假设蛋白 Hypothetical protein nbsp;CHLNCDRAFT_20689 gi|307109747 14 424.3/7.04 小球藻 nbsp;Chlorella variabilis 60 未知蛋白 nbsp;Unknown protein C2 推定的乌头酸水合酶 nbsp;Putative aconitate hydratase，cytoplasmic gi|75225211 98 020.6/5.67 粳稻 Oryza sativa nbsp;Japonica Group 54 糖类代谢 nbsp;Carbohydrate metabolism C3 抗坏血酸过氧化物酶 nbsp;Ascorbate peroxidase gi|223931154 27 282.7/5.21 五唇兰 nbsp; 蝴蝶兰的杂交种 Doritis pulcherrima Phalaenopsis hybrid 160 防御反应 nbsp;Defense response C4 推定的乙烯反应蛋白 Putative ethylene-responsive protein gi|21536534 18 726.4/5.59 拟南芥 nbsp;Arabidopsis thaliana 45 防御反应 nbsp;Defense response C5 NBS-LRR 类似蛋白 nbsp;NBS-LRR-like protein gi|332002196 19 088.0/8.65 山荆子 Malus baccata 50 防御反应 nbsp;Defense response 张艺萍，瞿素萍，杨秀梅，马璐琳，许 nbsp; 凤，王继华，何月秋 . 百合抗病无性系抗枯萎病的蛋白质组学分析 . 园艺学报， 2018， 45 3 530– 540. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 537 将所鉴定的蛋白点进行数据库检索及相关的文献查阅，共获得 25 个蛋白质点的功能信息。其中 10 个蛋白质点鉴定为未知功能蛋白（ S2、 S3、 A2、 A3、 A4、 A8、 A10、 B1、 B4、 C1），其余15 个依据其相关功能分为 4 类。防御反应相关蛋白共包括 6 个，即推定的抗病蛋白 RPS2（ A6）、推定的晚疫病同族蛋白 R1C-3（ B2）、过氧化物酶 Q（ B5）、抗坏血酸过氧化物酶（ C3）、推定的乙烯反应蛋白（ C4）和 NBS-LRR 类似蛋白（ C5），呈明显上调表达。光合作用相关蛋白（ S1、 A5、A9）除了二磷酸核酮糖羧化加氧酶（ S1）下调表达外，其他 2 个蛋白均呈明显上调表达。鉴定获得3 个糖类及能量代谢相关蛋白（ S4、 A1、 C2），均呈上调表达。此外，还鉴定得到 3 个热激蛋白（ A7、B3、 B6），均呈下调表达。 nbsp;2.4 nbsp;百合受尖孢镰刀菌侵染后的蛋白质差异表达 nbsp;对差异蛋白 A6、 B5 和 C5 的分析发现，三者在百合抗病无性系中的表达量均比在感病无性系中高，呈上调表达， A6 在抗病无性系中的表达量随着时间的延长而增加； B5 在抗病无性系中的表达量呈先上升后降低的趋势； C5 在抗病无性系中的表达量随着时间的延长而降低（图 4，表 2）。 nbsp;图 4 nbsp;差异蛋白 A6、 B5、 C5 在百合抗病无性系和感病无性系中不同时间的表达 nbsp;Fig. 4 nbsp;The A6， B5 and C5 expression of differential time points in lily disease-resistant and susceptible clones 表 2 nbsp;相对于感病无性系 A6、 B5 和 C5 在百合抗病无性系中不同时间点的表达 nbsp;Table 2 nbsp;The A6， B5 and C5 expression of differential time points in lily disease-resistant clones nbsp;蛋白点 Protein 24 h 48 h 72 h A6 2.6 2.0 1.8 B5 2.5 3.7 1.6 C5 2.7 2.5 2.4 注 表示增量。 nbsp;Note Indicates increment. Zhang Yiping， Qu Suping， Yang Xiumei， Ma Lulin， Xu Feng， Wang Jihua， He Yueqiu. Proteomics analysis of lily blight disease-resistant clones. 538 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 3 530– 540. 3 nbsp;讨论 nbsp;3.1 nbsp;光合作用和能量代谢相关蛋白参与百合的防卫反应 nbsp;病原菌的侵入对寄主植物最明显的影响就是干扰其光合作用（ Christelle et al.， 2017）。 Rubisco是卡尔文循环中的关键酶之一。有学者经过分析外源 JA 诱导下马铃薯叶片蛋白质组的变化，发现其中两个 Rubisco 蛋白表现为下调表达（杨艳丽， 2010）。还有学者证明了 Rubisco 可因活性氧的产生而受到抑制，从而表现下调表达（ Chen et al.， 2013）。本研究中通过分析百合抗病无性系和感病无性系的差异蛋白质，鉴定获得了 3 个与光合作用相关的蛋白。其中两个为 Rubisco（ S1、 A9）的蛋白质， S1 的表达量表现为下调，而 A9 的表达量表现为上调，这可能与百合抗病无性系植株细胞内复杂的防卫反应有关。 nbsp;本研究鉴定获得 4 个糖类代谢及能量代谢相关的蛋白，有 2 个蛋白（ S4、 A10）参与三羧酸循环， 1 个蛋白（ A1）参与代谢转运， 1 个蛋白（ C2）参与碳水化合物的代谢，均呈现明显上调表达。这就表明百合抗病无性系植株可能是通过调控能量代谢途径，从而为完成抗病反应提供物质能量。 nbsp;3.2 nbsp;防卫反应相关蛋白是抗病的关键因素 nbsp;病程相关（ pathogenesis-related， PR）蛋白是寄主植物中普遍存在的一类具有广谱抗病性的可溶性蛋白（ Gloria et al.， 2013），病程相关蛋白主要有 β– 1,3–葡聚糖酶（ PR-2）、几丁质酶（ PR-3）、过氧化物酶类（ PR-9）、过敏反应相关的 PR 蛋白（ PR-10）（ Loon et al.， 2006； I/p