基于牡丹类黄酮糖基转移酶基因建立VIGS技术体系.pdf

p园艺学报， 2018， 45 1 168– 176. Acta Horticulturae Sinica nbsp; 168 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;doi 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0522； http //www. ahs. ac. cn nbsp;收稿日期 2017– 09– 18； 修回日期 2018– 01– 12 基金项目 国家自然科学基金面上项目（ 31471909） ；山东省高等学校科技计划（ J15LF01） nbsp;* 并列第一作者 nbsp;** 通信作者 nbsp;Author for correspondence（ E-mail ） nbsp;基于牡丹类黄酮糖基转移酶基因建立 VIGS 技术体系 nbsp;舒庆艳1,*，朱 瑾1,2,*，门思琦1,2，郝 nbsp;青3，王倩玉1,2，刘政安1，曾秀丽4，王亮生1,2,**（1中国科学院北方资源植物重点实验室 /中国科学院植物研究所北京植物园，北京 nbsp;100093；2中国科学院大学，北京 nbsp;100049；3青岛农业大学园林与林学院，山东青岛 nbsp;266109；4西藏自治区农牧科学院蔬菜研究所，拉萨 nbsp;850032） nbsp;摘 nbsp;要 牡丹（ Paeonia suffruticosa Andrews）花色的化学基础研究较为深入，但因其无遗传转化体系，导致花色相关基因的功能验证只能利用其他植物进行旁证。利用保守区段长分别为 413 和 418 bp 的牡丹花瓣类黄酮糖基转移酶基因 PsUF3GT 和 PsUF5GT，通过 VIGS 表达载体，采用二因素三水平的试验体系对目的基因进行沉默。结果表明， PsUF3GT 和 PsUF5GT 的表达量在花斑中（盛开期花瓣，真空抽滤 15 min）和非斑中（蕾期花瓣，真空抽滤 10 min）分别比空载体处理的花斑中（盛开期花瓣，真空抽滤 10 min）和非斑中（蕾期花瓣，真空抽滤 15 min）降低了 65.0和 85.0；花斑中总花青苷含量分别降低了 24.2和 28.2， 尤其是盛开期花瓣 （真空抽滤 15 min） 处理后 3G 型糖苷降低了 92.2， 蕾期花瓣 nbsp;（真空抽滤 10 min）处理后 3G5G 型糖苷降低了 54.9 。由此获得了沉默 PsUF3GT 和 PsUF5GT 的适宜体系以盛开期或者花蕾期带花柄的花朵为材料，抽真空渗透 10 15 min 后，置于去离子水中暗培养 1 d（ 8 ℃，湿度 60） ；之后转移至 23 25 ℃、湿度 60的环境，光照培养 3 d 后可用于检测和分析。本研究中建立的 VIGS 体系可有效沉默花瓣中的内源基因， 为牡丹基因功能验证及其花色形成的分子机制研究奠定了基础。 nbsp;关键词 牡丹；花色； VIGS；类黄酮糖基转移酶基因（ UFGT） ；功能验证 nbsp;中图分类号 S 685.11 nbsp; nbsp; nbsp; 文献标志码 A nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;文章编号 0513-353X（ 2018） 01-0168-09 Establishing Virus Induced Gene Silencing（ VIGS） System in Tree Peony Using PsUFGT Genes SHU Qingyan1,*， ZHU Jin1,2,*， MEN Siqi1,2， HAO Qing3， WANG Qianyu1,2， LIU Zheng’an1，ZENG Xiuli4， and WANG Liangsheng1,2,**（1Key laboratory of Plant Resources and Beijing Botanical Garden， Institute of Botany， The Chinese Academy of Sciences，Beijing 100093， China；2University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China；3Landscape and Forestry College， Qingdao Agricultural University， Qingdao， Shandong 266109， China；4Institute of Vegetables， Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandary Sciences， Lhasa 850032， China） nbsp;Abstract Considerable progress has been made on the phytochemical basis of flower color ation 舒庆艳，朱 nbsp; 瑾，门思琦，郝 nbsp; 青，王倩玉，刘政安，曾秀丽，王亮生 . 基于牡丹类黄酮糖基转移酶基因建立 VIGS 技术体系 . 园艺学报， 2018， 45 1 168– 176. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;169 on tree peony（ Paeonia suffruticosa Andrews） . However， due to lack of genetic transation system，function of the genes related to flower color ation has to be characterized using other model plant systems. We utilized virus induced gene silencing（ VIGS） for establishing the functional characterizing technique to study UDP-glucose flavonoid glycosyltransferases（ UFGTs） genes in tree peony. The fragments with 413 bp and 418 bp length with a putatively conserved domain of PsUF3GT and PsUF5GT were selected for constructing VIGS recombinant vectors， respectively. Nine treatments with two factors and three levels were conducted to test the gene silencing effects. The results showed that the expression level of PsUF3GT after infiltrating petals of blooming for 15 min， or the expression level of PsUF5GT after infiltrating petals of bud stage for 10 min， were reduced 65.0 and 85.0 as compared with that of control petals of blooming or bud stage infiltrated using empty vectors for 10 min or 15 min， respectively. Meanwhile， total anthocyanins content in petal blotch were also decreased 24.2 and 28.2 after treatment of flowers at blooming or bud stage by infiltration for 15 min or 10 min， respectively， in which，cyanidin 3-O-glucoside reduced 92.2 in petals at blooming stage infiltrated for 15 min and cyanidin 3,5-O-diglucoside reduced 54.9 in petals at bud staged infiltrated for 10 min. Therefore， an optimal VIGS system has been established in tree peony， namely， flowers at blooming or bud stage were subjected to vacuum infiltration for 10– 15 min， then kept in dark for 1 d at 8 ℃ nbsp;with relative 60 humidity，afterwards， kept at 23– 25 ℃ nbsp;with normal light and relative 60 humidity for 3 d， then， treated samples could be used for further functional characterization of the silenced genes. Our VIGS would be beneficial to functional characterization of the genes related to flower color ation， and study the molecular mechanism of flower color variation. Keywords tree peony； flower color； VIGS； flavonoid； UDP-glucose； flavonoid glycosyltransferases （ UFGTs） ； functional characterization 牡丹（ Paeonia suffruticosa Andrews）花色形成的化学基础研究较为深入，花瓣中含有 12 种花青苷，其中天竺葵素 3–葡萄糖苷（ Pg3G） 、天竺葵素 3,5–二葡萄糖苷（ Pg3G5G） 、矢车菊素 3–葡萄糖苷（ Cy3G） 、矢车菊素 3,5–二葡萄糖苷（ Cy3G5G） 、芍药花素 3–葡萄糖苷（ Pn3G）和芍药花素 3,5–二葡萄糖苷（ Pn3G5G）是主要的花青苷（ Wang et al.， 2001， 2004；张晶晶 nbsp;等， 2006；李崇晖， 2010） 。牡丹栽培品种，尤其是西北牡丹品种群，花瓣基部具有鲜艳硕大的色斑，不仅增加了其观赏价值，而且色斑常作为品种分类的重要依据之一。这些牡丹花瓣中色斑部分的花青苷主要由 Pn3G5G、 Cy3G5G 和 Cy3G 组成， Pn3G 含量很低，几乎不含 Pg 型色素，推测花瓣基部 Cy 的糖苷化、甲基化和高花青苷含量是形成色斑的主要原因（ Wang et al.， 2001， 2004） 。 Zhang 等（ 2007）分析了 35 个西北牡丹品种花瓣的花青苷组成，斑中以 Cy3G 为主，非斑以 Pn3G5G 为主，斑中的花青苷含量明显高于非斑。 nbsp;类黄酮是植物中一类重要的次生代谢产物，通常需要在合成的最后一步进行糖苷化修饰，以增加其在细胞内的稳定性、溶解性并影响花的显色（田鹏和刘占林， 2011；陈嘉景 nbsp;等， 2016） 。类黄酮糖苷化由糖基转移酶（ UDP-glucose flavonoid glycosyltransferases， UFGTs）完成，其糖基供体通常是核苷酸糖（ nucleotide sugar， Uridine diphosphate， UDP） ，如 UDP–葡萄糖等。最早发现的是控制玉米粒色素的基因 Bronze1，其编码类黄酮 UDP–糖基转移酶（ Dooner amp; Nelson， 1997） 。已经在很多植物中发现了类黄酮糖基转移酶基因， 如玉米、 金鱼草、 龙胆和牵牛等的 UF3GT（ Schiefelbein Shu Qingyan， Zhu Jin， Men Siqi， Hao Qing， Wang Qianyu， Liu Zheng’an， Zeng Xiuli， Wang Liangsheng. Establishing virus induced gene silencing（ VIGS） system in tree peony using PsUFGT genes. 170 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 1 168– 176. et al.， 1985； Martin et al.， 1991； Tanaka et al.， 1996； Morita et al.， 2015） ，及龙胆和葡萄的 UF5GT等（ Nakatsuka et al.， 2008； Yang et al.， 2014） 。此外，在月季中还有一种糖基转移酶先将花青苷5– O–糖苷化后再继续将 3– O–修饰形成 3,5–双– O–糖苷，聚类分析表明其与花青苷 3GT–和5GT–糖基转移酶亚家族明显不同（ Ogata et al.， 2005） 。可见在不同物种中，类黄酮糖苷化修饰基因存在多样性并由超家族基因组成。牡丹花瓣中类黄酮（包括花青苷）合成途径中部分相关酶基因已有克隆和表达分析（周琳 nbsp;等， 2010， 2011； Du et al.， 2015； Zhao et al.， 2015） ，而类黄酮糖基转移酶基因相关研究尚未见报道。 nbsp;牡丹再生和遗传转化非常困难，尚未见其遗传转化体系的报道，利用转基因技术验证牡丹基因的功能，存在技术瓶颈。而牡丹从实生苗到开花需要 3 4 年的时间，开花相关的表型鉴定困难较大。病毒诱导的基因沉默 VIGS（ Virus-induced gene silencing）是近年来发现的一种转录后基因沉默现象，可引起内源 mRNA 序列特异性降解（ Ratcliff et al.， 2001） 。 VIGS 已作为一种高效的反向遗传学新技术应用于植物基因功能研究（ Purkayastha amp; Dasgupta， 2009） ，包括蝴蝶兰（ Hsieh et al.，2013） 、矮牵牛（ Broderick amp; Jones， 2014） 、月季（ L et al.， 2014）和番茄（季娜娜 nbsp;等， 2016）等。从技术、材料自身角度考虑，利用 VIGS 技术建立牡丹基因功能研究的技术体系，可能是克服牡丹遗传转化困难瓶颈的手段。 nbsp;利用同源克隆技术克隆了牡丹类黄酮糖基转移酶基因 PsUF3GT 和 PsUF5GT 的保守区段作为靶基因构建 TRV2 载体，成功建立了 VIGS 沉默体系，有效地降低了这两个基因的表达量和总花青苷含量。本研究结果对牡丹基因功能研究具有重要意义，也为解析牡丹色斑形成的分子机制奠定了基础。 nbsp;1 nbsp;材料与方法 nbsp;1.1 nbsp;材料 nbsp;紫斑牡丹‘青海湖银波’ （ Paeonia suffruticosa‘ Qinghaihu Yinbo’ ）栽植于中国科学院植物研究所牡丹芍药种质资源圃，其斑为紫红色，非斑为白色，非斑部分未检测出花青苷，斑部花青苷有 4种矢车菊素 3–葡萄糖苷（ Cy3G） 、矢车菊素 3,5–二葡萄糖苷（ Cy3G5G） 、芍药花素 3–葡萄糖苷（ Pn3G）和芍药花素 3,5–二葡萄糖苷（ Pn3G5G） （ Zhang et al.， 2007） 。 nbsp;VIGS 载体来自烟草脆裂病毒载体（ tobacco rattle virus， TRV） ， TRV1/TRV2 为中国农业大学观赏植物采后和逆境生理实验室马男教授馈赠，载体信息参考 Tian 等（ 2014）的文献。所用标准品矢车菊素– 3–葡糖苷（ Cy3G）购自法国 Extrasynthese 公司（ Genay， France） 。 nbsp;1.2 nbsp;基因克隆 nbsp;花瓣总 RNA 的提取参照试剂盒说明书进行[ RNAprep Pure Plant Kit， FastQuant cDNA 天根生化科技（北京）有限公司]。根据公共数据库中 3GT 和 5GT 序列设计上、下游引物克隆靶片段（ AQZ26785、 ARA67360 和 AF171902）。用于 VIGS 沉默的 PsUF3GT 和 PsUF5GT 片段设计上、下游引物并添加 BamHⅠ和 XhoⅠ酶切位点。 nbsp;扩增引物见表 1。 nbsp;舒庆艳，朱 nbsp; 瑾，门思琦，郝 nbsp; 青，王倩玉，刘政安，曾秀丽，王亮生 . 基于牡丹类黄酮糖基转移酶基因建立 VIGS 技术体系 . 园艺学报， 2018， 45 1 168– 176. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;171 表 1 nbsp;本研究所用引物序列相关信息 nbsp;Table 1 nbsp;Primer lists and related ination used in this study 用途 Purpose 编号 Code 引物序列（ 5′– 3′） Primer sequence 长度 /bpLengthqRT-PCR 3GT F TGGGGTTGCCTTTTTATGGTCACTT； R TCCACCTCCGATACTCTCTA 198 5GT F TCGTTTGGAAGCGTCTCTGTTTTAC； R CCATTCCTTGCTTTTCCAAATCTTC 169 内参 Reference PsTub F GCACCAAAGAAGTGGACGAACAAAT； R AGTAAACTGTTCACTCACACGCCTG 183 阳性克隆检测 PCR check nbsp;for positive clone TRV1 F TTACAGGTTATTTGGGCTAG； R CCGGGTTCAATTCCTTATC 646 TRV2 F TGGGAGATGATACGCTGTT； R CCTAAAACTTCAGACACG 280 载体构建 Vector construction 3GT-V F AAGGATCCCATGGCTCAATGACCAAAAGGCTAA； nbsp;R TTACTCGAGCATTCTTCGTAAATACT CCACCGTCG 413 5GT-V F AAGGATCCTTTGGAAAAGCAAGGAATGGTGGTG； nbsp;R ACGCTCGAGTCACAAATCACCACC TTTCCCCACC 418 注下划线表示碱基酶切位点。 nbsp;Note Underline indicated restriction enzyme cutting sites. 1.3 nbsp;VIGS 体系建立 nbsp;采用二因素三水平试验体系共设 9 个处理进行 VIGS 试验。花发育因素设盛开期（斑色紫红，非斑部分花瓣白色） 、半开期（斑色深紫红，非斑部分花瓣白色） 、蕾期（斑浅红色，非斑部分花瓣黄绿色） 3 个水平；真空抽滤时间因素设 3 个水平分别为 10、 15 和 20 min。 nbsp;TRV2-3GT 和 TRV2-5GT 为目标基因， 相应的 TRV2 空载体为对照 （表 2） 。 转化方法参照 Tian等（ 2014）的抽真空法，重悬菌液的吸光值 A600 1.0， pTRV2-3/5GT、 pTRV1 和 pTRV2 菌液的A600值相同。将 pTRV2-3/5GT 和 pTRV1、 pTRV2 和 pTRV1 菌液按体积比 1︰ 1 分别混合，暗处静置4 h。 nbsp;将牡丹花朵带 5 cm 花柄剪下，分别置于 9 个处理的菌液中，抽真空至 0.7 atm，负压处理，缓慢放气。每处理 3 朵花，单花重复。将抽吸后的花瓣用去离子水漂洗，去除多余菌液。花柄没于去离子水中， 8 ℃，湿度 60，暗培养 1 d；之后转移至 23 25 ℃，相对湿度 60左右，正常光照下培养 3 d。侵染 4 d 后采样，将花瓣的斑部与非斑部分分开。选取花瓣作为 RNA 提取检测样本和色素抽提样本， RNA 检测样本置于液氮中速冻并存于– 80 ℃，色素抽提样本经冷冻干燥处理后保存于茶色干燥器中。之后检测目的基因的表达水平以及花青苷积累量相对于对照的变化。因非斑部分不积累花青苷，所以侵染后仅测斑部花青苷成分及含量。 nbsp;1.4 nbsp;基因表达分析 nbsp;基因表达分析参照 Du 等（ 2015），提取所有样品总 RNA，并反转录成 cDNA，作为荧光定量PCR 的模板， 具体方法参照试剂盒说明进行[ FastQuant cDNA 和 SYBR Green， 天根生化科技 （北京）有限公司]。采用 2-∆∆CT（ Livak）法计算实时荧光定量 PCR 试验中基因的相对表达量，以 PsTubulin作为内参基因（ Du et al.， 2015） 。将花瓣斑与非斑分开进行表达量分析，分 3 次生物学重复和 3 次技术重复。1.5 nbsp;斑部花青苷测定 nbsp;将干燥后的花斑称重后提取花青苷（ Li et al.， 2009）。采用 Dionex HPLC-DAD 分析系统，色谱柱为 TSK gel ODS-80Ts QA， 4.6 mm（内径） 150 mm（柱长）（日本 Tosoh 株式会社）。花青苷的定性和定量分析参照 Zhang 等（ 2007）和 Li 等（ 2009）的方法。利用 Agilent 1100 LC/MSD Trap Shu Qingyan， Zhu Jin， Men Siqi， Hao Qing， Wang Qianyu， Liu Zheng’an， Zeng Xiuli， Wang Liangsheng. Establishing virus induced gene silencing（ VIGS） system in tree peony using PsUFGT genes. 172 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 1 168– 176. VL 液质联用仪（ Agilent Technologies， Palo Alto， CA， USA）进行 HPLC 分析。标准品为矢车菊素3– O–葡萄糖苷（ Cy3G），通过半定量法计算花青苷含量（ Wang et al.， 2001）。总花青苷含量TA（ mAU） 0.0012[Cy3G（ μg mL-1）] nbsp; 0.0121， R2 0.994，花青苷含量以 mg g-1干燥花瓣计。用 Chameleon 软件（ Ver. 6.60）分析结果。 nbsp;1.6 nbsp;数据分析 nbsp;荧光定量 PCR 和花青苷测定数据采用软件 SPSS 13.0 v （ SPSS Inc., Chicago, IL）进行显著性差异分析 （ P lt; 0.05） 。 采用 Excel 2007 进行数据分析及绘制图表， 利用 DNAMAN5.0 及公共网站 （ https//www.ncbi.nlm. nih.gov/）数据库等进行序列分析。 nbsp; 2 nbsp;结果与分析 nbsp;2.1 nbsp;PsUF3GT 和 PsUF5GT 靶片段的克隆和序列分析 nbsp;根据上、 下游引物扩增的 PsUF3GT 靶片段长度为 413 bp， 对推测编码的氨基酸序列进行 Blast P分析， 与滇牡丹 （ P. delavayi） 同源序列花青苷 3– O–糖基转移酶 PdA3GT_AQZ26785 和 PsUF3GT_ ARA67360）相似性为 94和 89、与葡萄（ Vitis vinifera， VvUF3GT_BAB41024）和忍冬（ Lonicera japonica， LjA3GT_ALL32290） 同源序列相似性分别为 69和 66。 利用在线网络软件 （ http //prosite. expasy.org/mydomains/）分析，其属于 Glycosyltransferase_GTB_type 超家族，含有 PSPG 基序（ plant secondary product glycosyltransferase box，图 1） 。 nbsp;WLNDQKAESV AYISFGTAAT PPPTEILAIA EALEASGVAF LWSLKDHLNV HLPKGFLDKT RACGMVVPWA PQLQILAHGA VGVFITHCGW NSVLESIGGG VPMICRPFFG DQKLNACMVE DVWEIGVKID GGVFTKN 图 1 nbsp;PsUF3GT 靶片段核苷酸推测编码的氨基酸序列 nbsp;下划线表示 PSPG 基序。 nbsp;Fig. 1 nbsp;The deduced amino acid sequences of the target fragment of PsUF3GT Underline indicated plant secondary product glycosyltransferase box（ PSPG-box） . 克隆的 PsUF5GT 靶片段长度为 418 bp， 与芍药 （ Paeonia lactiflora， 黄酮醇 5– O–糖基转移酶，PlF5GT_AF171902） 和滇牡丹 （ P. nbsp;d e l a v a y i， PdF5GT_ARA67364） 同源序列相似性分别为 99和 71，与矮牵牛（ Petunia hybrida，花青苷 5– O–糖基转移酶， PhA5GT_BAA89009）同源序列相似性为73。利用在线网络软件（ http //prosite.expasy.org/mydomains/）分析，其属于 Glycosyl-transferase_ GTB_type 超家族，其氨基酸在 337 380 处有 UDPG（ UDP-glycosyltransferases）特征序列（图 2） 。 nbsp;LEKQGMVVPW CNQLEVLSHK SVGCFLTHCG WNSSLESLVC GVPVVAFPQW ADQATNAKLI EDVWKTGVRM VVNEDGVVEG CEIKRCLEMV MGGGERGEEM RRNVEKWKEL AREAVKDGES SDKNLKAFVN EVGKGGDL * 图 2 nbsp;PsUF5GT 靶片段推测编码的氨基酸序列 nbsp;下划线表示 UDPG 特征序列。 nbsp;Fig. 2 nbsp;The deduced amino acid sequences of the target fragment of PsUF5GT Underline indicated UDPG characteristic sequence. 舒庆艳，朱 nbsp; 瑾，门思琦，郝 nbsp; 青，王倩玉，刘政安，曾秀丽，王亮生 . 基于牡丹类黄酮糖基转移酶基因建立 VIGS 技术体系 . 园艺学报， 2018， 45 1 168– 176. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;173 2.2 nbsp;VIGS 沉默 UFGTs 体系建立 nbsp;2.2.1 nbsp;花瓣中沉默 PsUFGT 后的表达量 nbsp;利用所扩增保守区片段长分别为 413 和 418 bp 的 PsUF3GT 和 PsUF5GT 基因片段构建 TRV2载体，用于沉默目的基因。通过二因素三水平 9 个试验处理，寻找 UFGT 基因沉默的最佳处理条件，对沉默后的基因表达量进行分析（表 2） 。 nbsp;通过对不同处理花瓣的斑与非斑中 PsUF3GT 和 PsUF5GT 基因表达量分析发现， 9 个处理中，盛开期花瓣经过真空抽滤 15 min（处理 2）沉默 PsUF3GT 基因，其表达量在斑中降低最多，比对照空载体盛开期花瓣真空抽滤 10 min（处理 1） 、半开期花瓣真空抽滤 20 min（处理 6）和蕾期花瓣真空抽滤 15 min（处理 8） ，分别降低了 65.0、 45.0和 71.0，但在非斑中表达量没有显著降低。蕾期花瓣真空抽滤 10 min 沉默 PsUF5GT 后（处理 7） ，其在非斑中的表达量降低最多，比处理 8 降低了 85.0（表 2） 。因此， PsUF3GT 的最佳沉默处理条件是将盛开期的花真空抽滤 15 min；而PsUF5GT 的最佳沉默处理条件是将蕾期的花真空抽滤 10 min。 nbsp;表 2 nbsp;不同处理沉默 PsUFGT 后牡丹花瓣中的表达量 nbsp;Table 2 nbsp;Relative expression levels of petals after silencing PsUFGT by VIGS treatment 2.2.2 nbsp;沉默 PsUFGT 后的花斑中花青苷的含量 对 9 个处理花斑中花青苷组分和含量进行了测定（表 3） ，检测结果与基因荧光定量结果基本一致。即盛开期花瓣真空抽滤 15 min（处理 2）和半开期花瓣真空抽滤处理 10min（处理 4）后，沉默 PsUF3GT 的花斑中检测出的 4 种花青苷总含量比对照空载体、真空抽滤处理 10 min 后的盛开期花斑中总花青苷含量（处理 1）降低了 24.2，其中降低最多的是 Pn3G 为 20.0，其次是 Cy3G、 nbsp;表 3 nbsp;不同处理沉默 PsUFGT 后牡丹花斑中花青苷成分和含量 nbsp;Table 3 nbsp;Anthocyanin component and content of petal blotch after silencing PsUFGT by VIGS treatment 发育时期 nbsp;Stage 抽滤时间 /min Infiltration 处理 nbsp;Treatment 靶基因 nbsp;Target gene 花青苷成分和含量 /（ mg g-1） nbsp;Cy3G5G Cy3G Pn3G5G Pn3G 盛开期 Blooming 10 1 TRV2 0.26 0.02 a 0.92 0.04 a 0.93 0.04 a 13.68 0.31 a 15 2 TRV2-3GT 0.18 0.06 ab 0.56 0.28 abc 0.71 0.15 ab 10.52 2.36 ab20 3 TRV2-5GT 0.16 0.01 bc 0.63 0.01 ab 0.68 0.03 abc 10.04 0.37 b 半开期 Semi-blooming 10 4 TRV2-3GT 0.05 0.01 d 0.46 0.02 bc 0.79 0.11 ab 4.92 0.18 cd 15 5 TRV2-5GT 0.08 0 cd 0.38 0.02 bc 0.59 0.08 bcd 5.91 0.84 c 20 6 TRV2 0.02 0 d 0.34 0.02 bc 0.54 0.04 bcd 1.88 0.06 d 蕾期 Bud 10 7 TRV2-5GT 0.02 0 d 0.17 0.01 c 0.28 0.01 d 1.53 0 d 15 8 TRV2 0.03 0.01 d 0.25 0.07 bc 0.37 0.08 cd 1.90 0.44 d 20 9 TRV2-3GT 0.03 0 d 0.39 0.06 bc 0.63 0.09 abc 2.82 0.37 cd 发育时期 nbsp;Stage 抽滤时间 /min Infiltration nbsp;处理 nbsp;Treatment 靶基因 nbsp;Target gene PsUF3GT 表达量 nbsp;PsUF5GT 表达量 nbsp;斑 Blotch 非斑 Non-blotch 斑 Blotch 非斑 Non-blotch盛开期 Blooming 10 1 TRV2 1.00 0.07 cd 1.00 0.10 cd 1.00 0.01 b 1.01 0.16 b 15 2 TRV2-3GT 0.35 0.06 f 1.23 0.23 c 1.00 0.13 b 0.91 0.07 bc 20 3 TRV2-5GT 1.32 0.04 b 3.24 0.27 a 1.41 0.12 a 1.10 0.12 b 半开期 Semi-blooming 10 4 TRV2-3GT 1.76 0.15 a 1.48 0.10 bc 0.29 0.01 d 0.51 0.05 bc 15 5 TRV2-5GT 0.79 0.09 de 1.99 0.33 b 0.54 0.05 c 1.20 0.05 b 20 6 TRV2 0.64 0.03 e 1.02 0.09 cd 0.24 0.02 d 0.21 0.02 c 蕾期 Bud 10 7 TRV2-5GT 1.69 0.11 a 2.72 0.20 a 0.72 0.05 c 0.85 0.08 bc 15 8 TRV2 1.21 0.11 bc 0.43 0.23 d 0.17 0.03 d 5.67 0.37 a 20 9 TRV2-3GT 1.10 0.12 bc 0.91 0.17 cd 0.35 0.01 d 1.00 0.59 b Shu Qingyan， Zhu Jin， Men Siqi， Hao Qing， Wang Qianyu， Liu Zheng’an， Zeng Xiuli， Wang Liangsheng. Establishing virus induced gene silencing（ VIGS） system in tree peony using PsUFGT genes. 174 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 1 168– 176. Pn3G5G、 Cy3G5G，分别为 2.3、 1.4和 0.1； 3G 型糖苷降低了 92.2， 3G5G 型降低了 7.8。利用蕾期花瓣真空抽滤 10 min 沉默 PsUF5GT（处理 7） ，其斑中检测出的 4 种花青苷总含量比对照空载体真空抽滤 15 min 的蕾期花斑（处理 8）中降低了 28.2，其中降低最多的是 Pn3G 为 12.5，其次是 Pn3G5G、 Cy3G5G、 Cy3G 分别降低了 9.3、 6.1和 0.01；其中 3G5G 型糖苷比对照（处理 8）降低了 54.9，而 3G 型糖苷降低了 45.1。 nbsp;3 nbsp;讨论 nbsp;影响 VIGS 沉默效果的因素很多。首先是沉默基因片段长度和位置的选择，前人研究结果表明3/p