结球甘蓝CML家族基因及其在授粉后柱头中的表达.pdf

园艺学报， 2018， 45 (11)： 2129 2140. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0177； http： /www. ahs. ac. cn 2129 收稿日期 ： 2018 07 07； 修回日期 ： 2018 11 02 基金项目 ： 国家自然科学基金项目( 31572127)；重庆市研究生科研创新项目（ CYS16076） * 同等贡献者 * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： zhuliquanswu.edu.cn） 结球甘蓝 CML 家族基因及其在授粉后柱头中的表达 蒲 敏1,4,*，罗绍兰1,*，廉小平2，曾 静3，张贺翠1，刘倩莹1，左同鸿1，朱利泉1,*（1西南大学农学与生物科技学院，重庆 400715；2重庆市蔬菜重点实验室，重庆 400715；3长江师范学院生命科学与技术学院，重庆 408100；4涪陵第十四中学校，重庆 408000） 摘 要： 利用 NCBI 和甘蓝基因组数据库筛选获得了 76 个结球甘蓝 CML 家族基因，其随机分布在甘蓝的 9 条染色体上，染色体上最多的有 12 个基因，最少有 1 个基因。分析发现该基因家族编码蛋白氨基酸残基长度在 109 365 个之间，分子量大多在 20 kD 左右，为小分子蛋白，且均含有 2 4 个保守的EF-hand 结构域。甘蓝的 76 个 CML 基因依据与拟南芥的 CML 家族的进化关系及序列相似性分为 个亚家族，每个亚家族基因有较高的同源性，进化关系较近。经亚细胞预测分析发现大部分蛋白在质膜和胞外表达，少量在质膜、细胞核内和叶绿体等部位表达。数字表达谱分析发现在 76 个基因中，有 25个基因在自花和异花授粉后差异表达，其中 BoCML12、 BoCML42、 BoCML44、 BoCML45、 BoCML60、BoCML70、 BoCML71 和 BoCML74 等 8 个基因在自花和异花授粉后表达趋势有较大差异，表明这 8 个基因以不同的方式参与调控甘蓝自花和异花授粉后的反应过程，有可能与甘蓝的自交不亲和性相关。 关键词： 甘蓝； CML 家族基因；生物信息学；表达分析 中图分类号： S 635.1 文献标志码： A 文章编号： 0513-353X（ 2018） 11-2129-12 Bioinformatics and Expression Analysis After Pollination of Stigma of CML Family Genes in Brassica oleracea var. capitata PU Min1,4,*， LUO Shaolan1,*， LIAN Xiaoping2， ZENG Jing3， ZHANG Hecui1， LIU Qianying1， ZUO Tonghong1， and ZHU Liquan1,*（1College of Agronomy and Biotechnology， Southwest University， Chongqing 400715， China；2Key Laboratory in Olericulture of Chongqing， Chongqing 400715， China；3School of Life Science and Biotechnology， Yangtze Normal University， Chongqing 408100， China；4Fuling No. 14 Middle School， Chongqing 408000， China） Abstract： Seventy-six CML family genes in Brassica oleracea var. capitata were identified and characterized through B.oleracea genomics database and NCBI database.They are randomly distributed on 9 chromosomes. There are 12 genes at the most， and at least 1 gene. It was found that the amino acid residues of the family of encoded proteins ranged from 109 to 365， and the molecular weight was mostly about 20 kD. They were small molecular proteins and contained 2 4 conserved EF-hand domains. Pu Min， Luo Shaolan， Lian Xiaoping， Zeng Jing， Zhang Hecui， Liu Qianying， Zuo Tonghong， Zhu Liquan. Bioinformatics and expression analysis after pollination of stigma of CML family genes in Brassica oleracea var. capitata. 2130 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2129 2140. Phylogenetic analysis showed that these CML family genes could be classified into eight groups， combining with Arabidopsis CMLs and each subfamily genes have high homology and close evolutionary relationship. Subcellular predictive analysis showed that most of the proteins were expressed in the plasma membrane and extracellular membrane， and a few in the plasma membrane， nucleus and chloroplast. Among the 76 genes， 25 genes were differentially expressed after self-pollination and cross-pollination. Among them， 8 genes， such as BoCML12， BoCML42， BoCML44， BoCML45， BoCML60， BoCML70，BoCML71and BoCML74， have significant expression differences. The results indicated that these 8 genes were involved in the regulation of self-pollination and cross-pollination of cabbage in different ways and may be related to the self-incompatibility of cabbage. Keywords： Brassica oleracea var. capitata； CML family genes； bioinformatics； expression analysis 在植物细胞中，钙离子 Ca2+作为第二信使广泛参与了细胞信号传导过程，通过它将细胞信号传递给下游响应元件，如转录因子、转运蛋白和细胞骨架相关蛋白等，从而调节细胞代谢、跨膜转运和基因表达等生物学过程，对调控植物生长发育和胁迫响应等有重要作用（ DeFalco et al.， 2010；Dodd et al.， 2010； Batisti & Kudla， 2012） 。不同的外界刺激能诱导植物细胞产生特异的 Ca2+信号变化，其中有 4 种常见的钙信号变化：钙瞬变、钙振荡钙信号的空间定位和钙波，这些 Ca2+信号变化来源于胞外 Ca2+和胞内钙库 （如液泡、 内质网等） 通过膜上的转运蛋白和通道蛋白来完成的 Ca2+输入和输出。胞内钙信号的改变首先由钙感受器接收并解码，再由钙感受器互作蛋白将信号传递到下游，从而激活下游相关离子通道活性和早期响应基因的表达。其中，钙感受器对钙信号的准确感知和解码是钙信号转导途径中关键性的调控步骤（ Kudla et al.， 2010；郑仲仲 等， 2013） 。 目前研究发现主要有 3 类钙感应系统：钙调素蛋白 /类钙调素蛋白家族（ CaM/CML） 、钙依赖性蛋白激酶家族（ CDPK）和钙调磷酸酶 B 类蛋白家族（ CBL/CIPK） ，它们都含有复杂的 EF 手型结构域（ EF-hand domain） 。 EF-hand 结构域是一种具有钙结合位点的螺旋环螺旋结构，能够高亲和力的结合 Ca2+（ Bouché et al.， 2005； McCormack et al.， 2005） 。其中， CML 家族是植物中所特有一种 Ca2+感受器。近年来，在拟南芥、水稻和大豆中分别鉴定出 50、 32 和 68 个 CML 家族基因，它们除了含有中 2 6 个 EF-hand 结构域外， 还没有发现其他已被证明的保守结构域 （ Azimzadeh et al.，2009） 。最近的研究表明， CML 基因家族广泛参与调控植物多个生物学反应过程。拟南芥 CML42功能缺失突变体中表皮毛的分枝数增加， CML19 和 CML20 能够与 TON1 蛋白互作，在细胞表层微管组织的形成过程中有重要作用（ Azimzadeh et al.， 2009； Dobney et al.， 2009） 。拟南芥 CML24 功能敲除突变体开花延迟，而功能获得性突变体开花提前（ Tsai et al.， 2007） ；此外，它还能通过结合ATG4b（在自体吞噬过程中起作用的半胱氨酸蛋白酶）正向调节细胞的自体吞噬过程（ Wang et al.，2011； Liu & Bassham， 2012； Tsai et al.， 2013） 。 CML21 的过表达抑制了花粉管的伸长并且增加了花粉管的宽度（ Zhou et al.， 2009） 。 CML25 可能通过调节依赖 Ca2+的 K+流动而在花粉的萌发和生长中发挥作用（ Wang et al.， 2015） 。拟南芥 CML24 通过调节细胞内的 Ca2+浓度以及细胞骨架来影响花粉管的萌发和生长（ Yang et al.， 2014） 。 CML12 与 PINOID（参与调节生长素输出载体 PIN1 定位丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶）以 Ca2+依赖的方式互作而负向调节 PINOID 的激酶活性，从而降低顶端生长素的外运（ Benjamins et al.， 2003； Friml et al.， 2004） 。水 稻 CML4 受盐和干旱诱导，过量表达 CML4增强抗旱性（ Yin et al.， 2015） 。拟南芥 CML24、 CML18、 CML9 等基因都参与植物非生物胁迫响应过程（ Magnan et al.， 2008； Chinpongpanich et al.， 2012； Leba et al.， 2012； Munir et al.， 2016） 。 蒲 敏，罗绍兰，廉小平，曾 静，张贺翠，刘倩莹，左同鸿，朱利泉 . 结球甘蓝 CML 家族基因及其在授粉后柱头中的表达 . 园艺学报， 2018， 45 (11)： 2129 2140. 2131 目前关于甘蓝 CML 家族基因研究的报道较少。本研究中通过生物信息学分析方法，利用 NCBI数据库和甘蓝基因组数据库等筛选获得了 76 个结球甘蓝 CML 家族基因，并对其序列信息、进化关系和在不同授粉处理后甘蓝柱头中的表达模式等进行了分析，以期为以后甘蓝 CML 家族基因的功能研究提供了理论依据和参考。 1 材料与方法 1.1 材料及处理 以西南大学十字花科蔬菜研究所选育的自交不亲和结球甘蓝高代自交系 A4 和 F1 为材料。 A4为 S28 单倍型， F1为 S7 单倍型，二者异交亲和。于 2016 年 4 月在开花前 1 2 d 将长势相同的 A4花蕾人工去雄，用新鲜 F1花粉授粉 0、 15、 30 和 60 min 精细处理，简称杂交（ CP）组。用新鲜 A4花粉给去雄的 A4柱头自花授粉 0、 15、 30 和 60 min 精细处理，简称自交（ SI）组。处理时间到后，快速扫去柱头上的花粉，取下整个饱和授粉的花柱，立即放入液氮中，后置于 80 保存备用。 1.2 甘蓝 CML 家族基因鉴定及序列比对与进化分析 在 NCBI 数据库 （ https： /www.ncbi.nlm.nih.gov/） 和甘蓝基因组数据库 （ http： /www.ocri-genomics. org/bolbase/index.html）中 通过 Blast 比对，检索 CML 基因家族的所有成员。利用 ExPASy-ProtParam tool（ http： /www.expasy.org/）分析蛋白的理化性质，用 Smart（ http： /smart.embl-heidelberg.de/） 、Swiss-model（ http： /swissmodel.expasy.org/） 和 InterProScan（ http： /www. ebi.ae.uk/interpro/scan.html）等在线软件分析预测蛋白质的功能位点和高级结构域， 用 WOLF PSORT（ http： /www.genscript.com/ wolf-psort.html）和 Soft berry（ http： /linux1.softberry.com/berry.phtml）在线预测蛋白的亚细胞定位。 利用 ClustalX2 软件（ Larkin et al.,2007）对甘蓝 CML 基因家族编码蛋白进行多序列比对，用MEGA5 软件， 采用邻接法 （ Neighbor-joining） 构建系统进化树， 其他参数为系统默认 （ Tamura et al.，2011） 。 1.3 数据表达谱测序分析 参照植物总 RNA 提取试剂盒（ RNAprep Pure Plant Kit， TIANGEN）说明书提取不同甘蓝样品的总 RNA，送北京百迈克生物科技有限公司，在 IlluminaHiSeq2000 平台进行双端测序。各样品的有效数据均达到 7.31 Gb， Q30 碱基百分比都在 93.22%以上。经过质量控制之后得到的高质量的有效数据，利用 TopHat2 将其与参考基因组进行序列比对。同时采用 FPKM（ Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped） 来量化基因的表达水平。 基于 CML 家族基因的 FPKM 结果，采用 Multiple Array Viewer 软件绘制热图，进行表达聚类分析。 1.4 差异基因的荧光定量表达分析 利用荧光定量 PCR 进一步确定从数据表达谱筛选出的 8 个表达差异较大的 CML 家族基因在授粉后的表达模式。根据各基因序列设计特异引物（表 1） ，以同期样品 RNA 逆转录得到的 cDNA 为模板，参照 SYBR®Premix Ex TaqTM说明书，以 Actin3 为内参，在 7500 型实时荧光定量 PCR 仪上进行 PCR 扩增。反应体系为 20 L： 2× SYBR® Premix Ex TaqTM10 L，引物各 1 L， cDNA 模板 1 L，加超纯水至 20 L。扩增程序为 95 预变性 1 min； 95 15 s， 60 15 s， 72 30 s，共 40 个循环。 Pu Min， Luo Shaolan， Lian Xiaoping， Zeng Jing， Zhang Hecui， Liu Qianying， Zuo Tonghong， Zhu Liquan. Bioinformatics and expression analysis after pollination of stigma of CML family genes in Brassica oleracea var. capitata. 2132 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2129 2140. 表 1 定量 PCR 引物表 Table 1 Primers used in RT-PCR 基因 Gene 正向引物（ 5 3） Forward primer 反向引物（ 5 3） Reverse primer BoCML12 AGGACGGAGACGGTCGGAT CTTCATCTCCTATCTCATCCTCGTC BoCML42 GAGCGAAAATCCTGAAACCAC CGAATGCTTCTCGGACCTC BoCML44 GATCAGGACAAGAACGGGCTC GTTGTTGCTGTTAGCGAGGGAG BoCML45 GCTCGCATCTTTTTGTCCAG CAAACTTGACATCTCCTTGGAAC BoCML60 CCTGAAGAAGAGACAACGGATAC ATTCTTCAAGGCTTTTGGACTC BoCML70 GCTCGCATCTTTTTATCCACA CACTTCCTCTAAGCTCGCCTC BoCML71 CTTAGGACTTCTCGCCGACTC ATCATTCTCCTGCAGTTCTCAAG BoCML74 GACCACAAGCCGCACAAA CCTGGAAGCAAGTCACGATG Actin3 ATGGAAACATCGTCCTCAGTGGTG AGTGCTGAGGGATGCCAAGATG 2 结果与分析 2.1 甘蓝 CML 家族基因鉴定及序列分析 根据拟南芥 CML 基因家族序列在 NCBI 和甘蓝基因组数据库通过同源序列比对，手工去除重复序列后，共得到 76 个 CML 家族基因序列（表 2） 。保守结构域分析发现该基因家族编码蛋白氨基酸残基长度在 109 365 个之间，分子量大多在 20 kD 左右，为小分子蛋白，且均含有 2 4 个保守的 EF-hand 结构域；除 BoCML1 的理论等电点在 8.53 外，其他的等电点（ pI）均在 7 以下，说明构成 BoCML 家族蛋白的氨基酸大部分为酸性氨基酸。 76 个 CML 家族基因随机分布在甘蓝的 9 条染色体上（图 1） ，其中第 3 条和第 5 条染色体分布最多，各分布有 12 个基因，第 2 条染色体分布最少，只有 1 个基因，第 9 号染色体有 7 个基因，第 1 和第 6 条染色体各有 9 个基因，第 4 和第 7 条染色体各有 8 个基因，第 8 号染色体分布有 10 个基因。 经亚细胞预测分析发现大部分蛋白在质膜和胞外表达，少量在质膜、细胞核内和叶绿体等部位有表达。 图 1 结球甘蓝 CML 家族基因在染色体上的分布 Fig. 1 Genomic distribution of CML genes on chromosomes of Brassica oleracea var. capitata 蒲 敏，罗绍兰，廉小平，曾 静，张贺翠，刘倩莹，左同鸿，朱利泉 . 结球甘蓝 CML 家族基因及其在授粉后柱头中的表达 . 园艺学报， 2018， 45 (11)： 2129 2140. 2133 表 2 结球甘蓝 CML 基因家族基本信息 Table 2 Basic information of CML gene family of Brassica oleracea var. capitata 编号 No. 基因 Gene 登录号 Gene ID 编码区 /bp Coding region CDS/ bp 预测的蛋白 Predicted protein 亚细胞定位 Subcellular localization EF-hand氨基酸 /aaAmino acid分子量 /kD Formula weightpI 1 BoCML1 106315659 688 570 4 189 21.53 8.53 质膜 Plasma membrane 2 BoCML2 106341076 646 459 4 152 17.16 4.35 质膜 Plasma membrane 3 BoCML3 106310180 805 459 4 152 17.25 4.59 质膜 Plasma membrane 4 BoCML4 106333747 506 462 4 153 17.39 4.29 质膜、核 Plasma membrane， nucleus 5 BoCML5 106327736 673 450 4 149 17.00 4.38 质膜 Plasma membrane 6 BoCML6 106293836 876 462 4 153 17.34 4.23 质膜、核 Plasma membrane， nucleus 7 BoCML7 106296877 705 615 4 204 23.32 4.54 核 Nucleus 8 BoCML8 106310600 823 603 4 200 22.71 4.43 核 Nucleus 9 BoCML9 106331793 937 645 4 214 24.25 4.91 核 Nucleus 10 BoCML10 106337204 933 636 4 211 23.70 4.81 核 Nucleus 11 BoCML11 106309401 462 462 3 153 17.59 4.50 质膜、核 Plasma membrane， nucleus 12 BoCML12 106333401 779 465 4 154 17.59 4.55 细胞质 Cytoplasm 13 BoCML13 106315454 809 459 4 152 17.36 4.37 细胞质 Cytoplasm 14 BoCML14 106310861 815 456 4 151 16.99 4.37 液泡 Vacuole 15 BoCML15 106299297 570 456 4 151 17.01 4.09 细胞质 Cytoplasm 16 BoCML16 106310681 690 462 4 153 17.51 3.97 质膜、核 Plasma membrane， nucleus 17 BoCML17 106336819 810 456 4 151 16.97 4.18 细胞质 Cytoplasm 18 BoCML18 106311087 613 330 2 109 12.27 4.20 质膜、核 Plasma membrane， nucleus 19 BoCML19 106332076 709 465 4 154 17.53 3.90 细胞质 Cytoplasm 20 BoCML20 106293446 783 468 4 155 17.65 4.05 细胞质 Cytoplasm 21 BoCML21 106342915 842 543 4 180 20.54 4.16 细胞质 Cytoplasm 22 BoCML22 106309698 803 447 3 148 16.50 4.78 细胞质、质膜 Cytoplasm， plasma membrane23 BoCML23 106292602 792 447 3 148 16.47 4.78 细胞质、核 Cytoplasm， nucleus 24 BoCML24 106320002 791 447 3 148 16.46 4.65 细胞质、质膜 Cytoplasm， plasma membrane25 BoCML25 106311269 572 471 4 156 16.98 4.17 质膜、核 Plasma membrane， nucleus 26 BoCML26 106294278 474 474 4 157 17.14 4.23 质膜、核 Plasma membrane， nucleus 27 BoCML27 106303756 800 489 4 162 17.71 4.45 质膜 Plasma membrane 28 BoCML28 106316270 697 486 4 161 17.54 4.27 质膜 Plasma membrane 29 BoCML29 106293886 1 085 501 4 166 18.64 4.81 质膜 Plasma membrane 30 BoCML30 106342993 722 510 4 169 18.71 4.49 细胞质 Cytoplasm 31 BoCML31 106293459 824 519 4 172 19.76 4.84 质膜、核 Plasma membrane， nucleus 32 BoCML32 106326955 805 510 4 169 19.60 4.81 质膜 Plasma membrane 33 BoCML33 106310973 1 082 678 4 225 25.96 4.44 细胞外、叶绿体、过氧化物酶体 Extracellular fluid， chloroplast， peroxisome34 BoCML34 106306816 1 011 687 4 228 26.51 4.51 细胞外、叶绿体、过氧化物酶体 Extracellular fluid， chloroplast， peroxisome35 BoCML35 106305895 987 693 2 230 26.61 5.07 细胞外、叶绿体、过氧化物酶体 Extracellular fluid， chloroplast， peroxisome36 BoCML36 106311713 1 008 702 2 233 26.67 5.33 细胞外、叶绿体、过氧化物酶体 Extracellular fluid， chloroplast， peroxisome37 BoCML37 106298520 712 462 4 153 17.02 4.45 质膜、核 Plasma membrane， nucleus 38 BoCML38 106337151 776 477 4 158 17.41 4.88 核 Nucleus 39 BoCML39 106293479 914 570 4 189 20.55 4.60 细胞质 Cytoplasm 40 BoCML40 106305118 798 555 4 184 20.22 4.66 细胞质 Cytoplasm 41 BoCML41 106335804 773 552 4 183 20.07 4.74 细胞质 Cytoplasm 42 BoCML42 106298504 756 480 4 159 17.60 4.41 质膜、核 Plasma membrane， nucleus Pu Min， Luo Shaolan， Lian Xiaoping， Zeng Jing， Zhang Hecui， Liu Qianying， Zuo Tonghong， Zhu Liquan. Bioinformatics and expression analysis after pollination of stigma of CML family genes in Brassica oleracea var. capitata. 2134 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2129 2140. 续表 2 编号 No. 基因 Gene 登录号 Gene ID 编码区 /bp Coding region CDS/bp 预测的蛋白 Predicted protein 亚细胞定位 Subcellular localization EF-hand氨基酸 /aa Amino acid分子量 /kD Formula weightpI 43 BoCML43 106427179 902 534 4 177 18.71 4.19 质膜、 线粒体 Plasma membrane， mitochondria44 BoCML44 106307408 776 534 4 177 18.75 4.18 质膜、细胞质 Plasma membrane， cytoplasm45 BoCML45 106301202 762 567 2 188 21.85 4.45 细胞外、 叶绿体 Extracellular fluid， chloroplast46 BoCML46 106292428 399 399 4 132 15.1 4.62 细胞外、过氧化物酶体 Extracellular fluid， chloroplast， peroxisome47 BoCML47 106317509 629 414 4 137 15.88 4.84 细胞外、叶绿体、过氧化物酶体 Extracellular fluid， chloroplast， peroxisome48 BoCML48 106320619 571 432 4 143 16.45 4.44 质膜、核 Plasma membrane， nucleus 49 BoCML49 106341079 432 432 4 143 15.85 4.26 核 Nucleus 50 BoCML50 106294128 514 399 4 132 14.68 4.26 细胞外、叶绿体、过氧化物酶体 Extracellular fluid， chloroplast， peroxisome51 BoCML51 106299518 625 402 4 133 14.87 4.07 核 Nucleus 52 BoCML52 106336975 1 026 642 4 213 23.18 4.63 细胞外、叶绿体、过氧化物酶体 Extracellular fluid,chloroplast， peroxisome53 BoCML53 106336749 1 112 654 4 217 23.47 4.44 细胞外、过氧化物酶体 Extracellular fluid， peroxisome 54 BoCML54 106292802 1 020 657 4 218 23.90 4.53 细胞外、过氧化物酶体 Extracellular fluid， peroxisome 55 BoCML55 106315943 877 555 4 184 20.45 4.63 质膜 Plasma membrane 56 BoCML56 106298973 741 540 4 179 20.47 4.79 细胞外、过氧化物酶体 Extracellular fluid， peroxisome 57 BoCML57 106298447 711 543 4 180 20.57 4.76 质膜 Plasma membrane 58 BoCML58 106299503 638 510 4 169 19.11 4.57 细胞外、过氧化物酶体 Extracellular fluid， peroxisome 59 BoCML59 106295164 852 426 2 141 16.24 4.77 细胞外、过氧化物酶体 Extracellular fluid， peroxisome 60 BoCML60 106333174 628 426 2 141 16.34 4.69 细胞外、过氧化物酶体 Extracellular fluid， peroxisome 61 BoCML61 106303908 834 612 4 203 22.65 5.27 细胞外、过氧化物酶体 Extracellular fluid， peroxisome 62 BoCML62 106333126 743 555 3 184 20.43 4.78 细胞外、过氧化物酶体 Extracellular fluid， peroxisome 63 BoCML63 106321023 820 576 3 191 21.15 4.24 细胞外 Extracellular fluid 64 BoCML64 106303869 951 561 3 186 20.69 4.37 细胞外 Extracellular fluid 65 BoCML65 106325716 733 582 3 193 21.87 4.84 细胞外 Extracellular fluid 66 BoCML66 106304901 667 549 3 182 20.47 4.41 细胞外 Extracellular fluid 67 BoCML67 106292783 908 465 3 154 17.98 4.38 叶绿体 Chloroplast 68 BoCML68 106337738 714 591 2 196 22.57 4.92 细胞外 Extracellular fluid 69 BoCML69 106296834 850 582 2 193 22.49 5.15 细胞外 Extracellular fluid 70 BoCML70 106316925 721 555 2 184 21.42 4.50 细胞外 Extracellular fluid 71 BoCML71 106319711 1 015 597 2 198 22.69 4.79 细胞外 Extracellular fluid 72