葡萄PP2C家族基因的鉴定与表达分析.pdf

p园艺学报， 2018， 45 7 1237– 1250. Acta Horticulturae Sinica nbsp; doi 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0824； http //www. ahs. ac. cn nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 1237 收稿日期 2018– 04– 02； 修回日期 2018– 07– 09 nbsp; 基金项目 甘肃农业大学 SRTP 项目；国家自然科学基金项目（ 31460500） nbsp;* 通信作者 nbsp;Author for correspondence（ E-mail ； Tel 13659425539） nbsp;葡萄 PP2C 家族基因的鉴定与表达分析 nbsp;何红红1，路志浩2，马宗桓1，梁国平1，马丽娟1，万 nbsp;鹏1，毛 nbsp;娟1,*（1甘肃农业大学园艺学院，兰州 nbsp;730070；2华中农业大学园艺林学学院，武汉 nbsp;430070） nbsp;摘 nbsp;要 参考拟南芥（ Arabidopsis thaliana）的 PP2C 基因注册序列，从葡萄（ Vitis vinifera）全基因组中鉴定得到 PP2C 家族基因 27 个，分为 10 个亚族 A、 C I、 K、 L。编码氨基酸 181 1 084 个，理论等电点 4.46 8.98。亚细胞定位分析表明，葡萄 PP2C 基因家族主要在细胞质、叶绿体和细胞核中表达。二级结构主要以 α–螺旋和不规则卷曲为主。葡萄 PP2C 基因芯片表达谱分析发现，该家族成员在葡萄不同组织中响应不同的逆境胁迫。 qRT-PCR 分析表明，葡萄试管苗在 100 和 50 mmol L-1ABA、 10 NaCl和 10 PEG 单独处理 6 h 后 VvPP2C02 的诱导表达量最高，分别是对照的 11 倍、 8 倍、 14 倍和 13 倍。 nbsp;关键词 葡萄； PP2C 家族；基因克隆；基因芯片表达谱；实时定量 PCR 中图分类号 S 663.1 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;文献标志码 A nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;文章编号 0513-353X（ 2018） 07-1237-14 Genome-Wide Identification and Expression Analysis of the PP2C Gene Family in Vitis vinifera HE Honghong1， LU Zhihao2， MA Zonghuan1， LIANG Guoping1， MA Lijuan1， WAN Peng1， and MAO Juan1,*（1College of Horticulture， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China；2College of Horticulture and Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China） nbsp;Abstract In this study， 27 members of the VvPP2C gene family were identified in the whole genome of grapes（ Vitis vinifera L.） ， with reference to Arabidopsis thaliana PP2C gene registration sequence. The VvPP2C genes expression was analyzed by bioinatics， microarray expression and stress analysis. The results showed that the 27 members of VvPP2C gene family could be divided into 10 subpopulations of A，C– I， K， L. The analysis of physicochemical properties showed that the number of amino acids in the VvPP2C gene family was between 181– 1 084， and the theoretical pI distribution was between 4.46– 8.98. The VvPP2C gene family was mainly expressed in the cytoplasm， chloroplast and nucleus through the subcellular localization analysis. The VvPP2C gene family was mainly composed of α-helix and irregular coil in secondary structure analysis. The microarray analysis showed that VvPP2C gene members of the family responded to different stress in different tissues of the grape. The inducible expression of grape plantlets was the highest in 100， 50 mmol L-1ABA， 10 NaCl and 10 PEG， at 11， 8， 14 and 13 times in qRT-PCR analysis， respectively. Keywords grape； PP2Cs gene family； gene clone； gene chip expression profiling； real-time PCR PP2C（ 2C type protein phopatases）是一类单体丝氨酸 /苏氨酸残基蛋白磷酸酶。在真核生物中， nbsp;Genome-wide identification and expression analysis of the PP2C gene family in Vitis vinifera. He Honghong， Lu Zhihao， Ma Zonghuan， Liang Guoping， Ma Lijuan， Wan Peng， Mao Juan. 1238 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 7 1237– 1250. PP2C 在脱落酸、茉莉酸、水杨酸等信号传导途径中起着重要的调控作用（闵东红 nbsp;等， 2013） 。目前在植物体中发现 9 种 PP2C 蛋白磷酸酶，包括 ABI1、 ABI2、 HAB1、 HAB2、 AHG1、 AHG3/AtPP2CA、HAI1、 HAI2 和 HAI3（ Bhaskara et al.， 2012； Nakashima amp; Yamaguchi-Shinozaki， 2013） ，拟南芥中ABI1、 ABI2、 AHG1、 AHG3/AtPP2C-A、 HAB1 及 HAB2 等 PP2C 类蛋白属于 A 亚族，对 ABA 信号起负调控作用（ Nakashima amp; Yamaguchi-Shinozaki， 2013） 。 ABI1 在响应 ABA 介导的干旱胁迫时起负调控作用（ Zhang et al.， 2013） ， ZmPP2C 在盐和干旱胁迫反应中是一个负调控因子（ Mao et al.，2015； Xiang et al.， 2017） ， PP2C 中 G 组的 3 个基因被证明经盐胁迫后上调表达（ Xue et al.， 2008） 。qRT-PCR 分析发现，盐碱胁迫对 GsPP2C-D 和 AtPP2C-D 有显著影响（ Chen et al.， 2018） 。蛋白激酶和磷酸酶催化的可逆性蛋白磷酸化在植物细胞胁迫信号转导中起着重要作用（ Cao et al.， 2016） ，在苔藓中，破坏 PpABI-1A 和 PpABI-1B 会导致其耐受干旱性增强，因为在 ABA 诱导下这两个 PP2C-As基因会完全重叠（ Komatsu et al.， 2013） 。还有研究表明， ABI1 在不同的组织中表达，包括种子和保护细胞， AHG1 和 AHG3 在细胞核也有表达，并且 AHG3 参与低温信号传导并调节 ABA 的应答反应（ Umezawa et al.，2009； Banerjee amp; Roychoudhury， 2017） 。 SAUR 蛋白可以与一些 AtPP2C-D蛋白互作来调节 PM H-ATPase 活性（ Spartz et al.， 2014； Li et al.， 2016） 。 nbsp;植物通过调节自身的信号通路，改变相关基因的表达来适应逆境胁迫（ Shang et al.， 2013） ，蛋白质的去磷酸化与磷酸化在此过程中均起重要的作用（ Antoni et al.， 2012） 。在拟南芥中有 112 个基因编码的蛋白磷酸酶，其中有多种能够响应逆境胁迫（ Huang et al.， 2012； Sanchita et al.， 2014） 。PP2C 酶的活性受 Mg2和 Mn2调控 （ Cao et al.， 2016） ， 并且参与植物体内的可逆磷酸化 （ Chen et al.，2018） 。大部分植物 PP2C 蛋白包含 3 个基序，即具有保守催化结构域的 C 末端，具有功能各异的膜定位信号序列延伸区的 nbsp;N 端和类似受体激酶互作结构域（张冬 nbsp;等， 2017） 。目前已对谷子（闵东红 nbsp;等， 2013） 、水稻（ Singh et al.， 2010） 、拟南芥（ Singh et al.， 2010） 、二穗短柄草（ Cao et al.，2016）等植物中的 PP2C 基因家族成员进行了研究分析。 nbsp;葡萄基因组测序已完成（ http //s.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/） ，但是葡萄PP2C 家族基因的研究还未见报道。土壤盐渍化、干旱以及冬季低温严重影响葡萄的生长发育和产量形成（王艳君 nbsp;等， 2017） 。本研究中参考拟南芥 PP2C 基因注册序列，同源克隆出葡萄 PP2C 基因家族成员并进行生物信息学分析，初步探究该基因家族在葡萄逆境胁迫中的表达特点和响应规律。 nbsp;1 nbsp;材料与方法 nbsp;1.1 nbsp;材料与处理 nbsp;试验于 2016 2017 年进行。试验材料为甘肃农业大学园艺学院保存的‘宝石无核’葡萄（ Vitis vinifera）试管苗。将芽的茎段接于 MS 培养基上，置于 LED 白光下培养 35 d，选择生长情况一致的试管苗用于处理。处理 A 100 mmol L-1ABA；处理 B 50 mmol L-1ABA；处理 C 10 NaCl；处理 D 10 PEG；以正常生长的试管苗为对照。每个处理 6 瓶，重复 3 次。将采集称量的样品用锡箔纸包裹后迅速置于液氮中速冻，然后放入– 80 ℃冰箱中保存。利用 RNA plant 植物 RNA 提取试剂（中科瑞泰）提取葡萄试管苗不同组织总 RNA。 nbsp;1.2 nbsp;葡萄 PP2C 家族基因成员鉴定 nbsp;从已知文献中得到 80 个拟南芥 PP2C 基因 ID。 在 NCBI 中输入所有的基因号获得每个基因对应何红红，路志浩，马宗桓，梁国平，马丽娟，万 nbsp; 鹏，毛 nbsp; 娟 . 葡萄 PP2C 家族基因的鉴定与表达分析 . 园艺学报， 2018， 45 7 1237– 1250. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;1239 的 CDS 与 Full-length 的序列。将获得的 CDS 输入到葡萄基因库中，获得葡萄 PP2C 基因组成员信息（ http //www.ncbi.nlm.nih.gov）。为避免重复对获得的所有序列进行 DNAMAN 比对筛选。在葡萄基因库获取已知序列的基因号、 CDS 长度、氨基酸数、等电点、分子量大小等理化性质数据（ http // s.fr/cgi-bin/blast_server/projet_ML/blast.pl）。 nbsp;1.3 nbsp;葡萄 PP2C 基因家族进化、基因结构、 motif 序列及亚细胞定位分析 nbsp;利用 MEGA5.0 和 clustalx. 分析蛋白系统进化关系；利用 GSDS（ http //gsds. （ Zhang et al.， 2012） ； 采用 http //meme-suite.org/tools/meme 进行 motif 分析 （ Bailey et al.， 2009）；采用 WoLF PSORT（ http // nbsp;1.4 nbsp;葡萄 PP2C 家族基因芯片表达谱分析 nbsp;从 NCBI 提供的 GEO（ http //www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）数据库中下载葡萄 RNASeq 数据，登录号为 GSE31662 和 GSE31594。 GSE31662 数据来自‘赤霞珠’葡萄，将软化的绿色果皮离体培养，在培养皿中加入 0.3 mol L-1蔗糖 nbsp; 脱落酸（ ABA）作为处理，未处理的作对照（ CK1） ，每个处理3 次重复，在处理后的 3 和 10 d 分别进行取样。 GSE31594 数据来自生长在水培滴灌系统中的‘赤霞珠’ ，用 120 mmol L-1（ NaCl︰ CaCl 10︰ 1）混合液、聚乙二醇（ PEG） 、 5 ℃低温分别进行处理，未处理的为对照（ CK2） ，每个处理 3 次重复，前两个处理分别在 1、 4、 8 和 24 h 采集叶片， 5 ℃处理在 1、 4 和 8 h 采集叶片。 nbsp;用葡萄 PP2C 核酸序列为探针检索出序列相同的 Affymetrix GeneChip 16K 基因 ID， 然后提取葡萄 PP2C 基因在各种非生物胁迫下的 RNASeq 数据，通过 Excel 对数据进行 log2 转换，最后用 HemI制作电子表达热图（ heat-map） 。 nbsp;1.5 nbsp;实时荧光定量 PCR 将葡萄 PP2C 家族基因的 CDS 序列进行在线引物设计[生工生物工程（上海）股份有限公司网站]， 将设计好的引物 （表 1） 交由该公司合成。 cDNA 合成用 Prime Script RT reagent Kit（ Perfect Real Time）试剂盒（ TaKaRa）。反转录产物在– 20 ℃下保存备用。实时荧光定量 PCR（ qRT-PCR）用Bio-Rad iCycler iQ 实时定量 PCR 仪，以葡萄 UBQ 基因为内参（许明 nbsp;等， 2017） ，对葡萄 PP2C 基因家族进行特异性表达分析。扩增体系含 1 μL cDNA，上、下游引物各 0.8 μL， SYBR 10 μL 反应MIX， 7 μL ddH2O，总 体 系 20 μL。反应程序为 95 ℃ nbsp;30 s， 95 ℃ nbsp;5 s， 60 ℃ nbsp;34 s， 95 ℃ nbsp;15 s， 60 ℃ nbsp;60 s， 95 ℃ nbsp;15 s，共 40 个循环。试验 3 次重复。试验数据用 Excel 软件分析。 nbsp;表 1 nbsp;葡萄 PP2C 基因家族表达分析的实时荧光定量引物 nbsp;Table 1 nbsp;qRT-PCR primers for expression analysis of PP2C in Vitis vinifera 基因 Gene 上游引物（ 5′– 3′） Forward primer 下游引物（ 5′– 3′） Reverse primer VvPP2C01 GGTCTGGGATGTTTTGAGCA TGAGTTTCCATTCACGAGCA VvPP2C02 ACCGCTATCCTTGTTGGTGA TCAGTTTGGTCTGGCTTGTG VvPP2C03 TCTGTCGGTGGAGGATGAAT GCCAGTCTCTTGGAGCACAT VvPP2C04 CAAGGGTTTGTTATGGGATGA TCCACCTCCTCTGATTCTCCT VvPP2C05 GCATCTGTAGGGGATTCTCG TTCAGCCTTCCAACTTCACC VvPP2C06 GGGTCAGGAGGAGGAAGAAC CAAAGAGGCGAAATCACTCG VvPP2C07 CCCTTCAGTCCTTCATCACC TGGGCAACAACCTCTTCATT VvPP2C08 TGGGTCTTGTGTTTTGGTTG GCTGGATGGCTTTCAATCTC VvPP2C09 CAACACTGAAAGAGGCAGCA TTATCTCCAAAAGCCCGAGA VvPP2C10 ACAAGGTTTGGCGTGTGAA TGAAGGGTTGAGGCAATCTAA VvPP2C11 ATGGGCTATGGGAGAACCTT TCTTTGCCGCTTCCTGTAAT Genome-wide identification and expression analysis of the PP2C gene family in Vitis vinifera. He Honghong， Lu Zhihao， Ma Zonghuan， Liang Guoping， Ma Lijuan， Wan Peng， Mao Juan. 1240 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 7 1237– 1250. 续表 1 基因 Gene 上游引物（ 5′– 3′） Forward primer 下游引物（ 5′– 3′） Reverse primer VvPP2C12 TCTTTGCCGCTTCCTGTAAT GAAGTCCTCCCCTTTCTTGC VvPP2C13 TTCAAAGTCACCCTCGCAAT AACCCCTCGGTCAATCTTCT VvPP2C14 GGCGGATGTGATAAAGAAGG CGCACCAACTAAACAACAGG VvPP2C15 GACTGGGAAGTGAGGAGTGC GCTGGTGGAGAAGATGGAAC VvPP2C16 CGATGGAATGAGCCAAAGAT TTCTTCAGCCAAAGCCAAAT VvPP2C17 TGGTGTGATTGCTGTTCCTG AACGGTCTGGCTGGAGAGA VvPP2C18 TCACACAACAGCAGCCAGA CCAGGAAGAGGCACACTACAG VvPP2C19 GGTTTGATGGGATTGATTGG CGAGATGGGGAAAGTGAATG VvPP2C20 CGAGATGGGGAAAGTGAATG GAGGACCCTTTGGCTTTTGT VvPP2C21 ATGATTGGGCATTTGAGGAG CACCAGCATTAGCAACAACAAVvPP2C22 TGGATTTTGCCAGGAGAAGA GAAGCACACCACAACAGCAG VvPP2C23 AAGCAACAGTCCAACCCTTC TGTCCGCAATGTCCAAATAA VvPP2C24 CAAGGGTTTGTTATGGGATGA TCCACCTCCTCTGATTCTCCT VvPP2C25 GGCAGATGTTGGTGTTGATG TTCGCTTTTGTGCTTGAGTG VvPP2C26 TTCAAACTGCCCCCTAAGC ACCGCACACTGGCTACTCAT VvPP2C27 GACGATGGCAAGGAAAGAAC TCTGGGGAGAAGCAAATCAC2 nbsp;结果与分析 nbsp;2.1 nbsp;葡萄 PP2C 家族基因理化性质分析 nbsp;经同源克隆得到的 27 条葡萄 PP2C 家族基因，分别命名为 VvPP2C01 VvPP2C27。其分布于葡萄 19 条染色体中的 14 条上，其中 4 号染色体上分布最多，有 5 个，其次是 18 号染色体，有 4 个，1、 9、 11、 12、 13、 14、 19 号染色体上各有 1 个（表 2） 。有两个基因 VvPP2C04/VvPP2C24 在 6 号 nbsp;表 2 nbsp;葡萄 nbsp;PP2C 基因理化性质 nbsp;Table 2 nbsp;Physical and chemical property of PP2C in Vitis vinifera 基因 nbsp;Gene 染色体 nbsp;定位 nbsp;Chr 基因登录号 nbsp;Gene accession No. 氨基酸数 nbsp;Amino acid 分子量 /kD Molecular nbsp;weight pI cDNA 全长 /bp FL-cDNA 分子式 nbsp;ula 基因全长 /bp Full length nbsp;VvPP2C01 12 GSVIVT01030553001 448 49 898.3 5.99 2 050 C2164H3426N624O680S265 701 VvPP2C02 4 GSVIVT01036034001 293 31 524.0 5.05 1 749 C1375H2159N393O444S77 133 VvPP2C03 8 GSVIVT01025802001 660 73 121.3 5.50 2 257 C3252H5110N884O977S2813 155 VvPP2C04 6 GSVIVT01024976001 629 70 525.1 5.62 2 146 C3089H4866N880O970S213 070 VvPP2C05 14 GSVIVT01031195001 431 46 407.0 7.97 1 627 C2039H3286N572O626S187 248 VvPP2C06 4 GSVIVT01019076001 462 50 856.4 6.58 2 784 C2220H3561N637O700S155 190 VvPP2C07 7 GSVIVT01028223001 181 20 610.3 5.44 1 194 C915H1425N253O276S75 158 VvPP2C08 5 GSVIVT01017754001 504 55 318.3 4.87 2 306 C2410H3832N668O774S245 084 VvPP2C09 18 GSVIVT01009035001 284 31 053.1 7.05 1 338 C1351H2162N398O420S113 425 VvPP2C10 8 GSVIVT01025572001 381 42 543.8 8.94 2 008 C1905H3025N535O550S103 132 VvPP2C11 13 GSVIVT01032637001 386 42 793.7 7.73 1 783 C1895H3015N545O565S106 464 VvPP2C12 18 GSVIVT01009518001 430 46 466.7 5.26 2 477 C2032H3238N564O639S219 648 VvPP2C13 3 GSVIVT01023994001 397 43 771.6 8.20 1 593 C1926H3050N572O573S125 033 VvPP2C14 3 GSVIVT01037875001 380 42 324.2 8.98 1 594 C1877H2980N550O547S103 811 VvPP2C15 1 GSVIVT01011853001 428 46 202.9 8.52 1 759 C2006H3270N588O615S234 221 VvPP2C16 9 GSVIVT01016816001 507 54 882.2 4.95 2 734 C2385H3852N674O763S223 592 VvPP2C17 5 GSVIVT01017855001 242 26 337.5 4.46 1 661 C1154H1820N312O374S94 011 VvPP2C18 19 GSVIVT01014860001 433 47 731.8 5.02 1 919 C2090H3298N574O662S2113 337 VvPP2C19 11 GSVIVT01015338001 1 084 120 188.4 5.09 4 300 C5296H8311N1465O1652S3914 665 VvPP2C20 18 GSVIVT01009670001 286 30 635.8 4.95 1 880 C1338H2082N376O438S66 748 VvPP2C21 4 GSVIVT01035977001 358 39 280.1 5.01 1 717 C1704H2676N480O545S2116 175 VvPP2C22 4 GSVIVT01035778001 381 41 845.0 5.21 1 664 C1824H2862N524O571S1810 019 VvPP2C23 8 GSVIVT01034176001 613 68 445.1 5.95 1 885 C3019H4712N846O926S242 649 VvPP2C24 6 GSVIVT01024976001 629 70 525.1 5.62 2 146 C3089H4866N880O970S213 070 VvPP2C25 4 GSVIVT01019004001 332 35 160.0 5.05 2 213 C1534H2395N433O496S1013 995 VvPP2C26 7 GSVIVT01022296001 388 42 433.5 6.43 1 580 C1870H2987N521O566S197 131 VvPP2C27 18 GSVIVT01013399001 360 39 346.9 5.84 1 757 C1713H2730N488O526S244 656 何红红，路志浩，马宗桓，梁国平，马丽娟，万 nbsp; 鹏，毛 nbsp; 娟 . 葡萄 PP2C 家族基因的鉴定与表达分析 . 园艺学报， 2018， 45 7 1237– 1250. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;1241 染色体上紧密连锁，而且为旁系同源基因，自展值为 90。 VvPP2C 成员编码氨基酸数在 181 1 084之间， 即使是同一亚族中不同基因编码氨基酸数也存在很大差异； 理论等电点 （ pI） 分布在 4.46 8.98之间，其中编码碱性氨基酸序列有 7 个，分别是 VvPP2C05、 VvPP2C09、 VvPP2C10、 VvPP2C11、VvPP2C13、 VvPP2C14、 VvPP2C15，且 VvPP2C10、 VvPP2C11、 VvPP2C13、 VvPP2C14 均属于家族中的 D 亚族。 nbsp;2.2 nbsp;葡萄 PP2C 家族基因多序列比对及其进化分析 nbsp;葡萄 PP2C 家族基因在 N 端保守性差，但是在 C 端具有较强的保守性，含有共同的结构亚域，推测其在功能上具有相似性。为进一步了解其进化特性，对拟南芥和葡萄 PP2C 家族基因（ AtPP2C和 VvPP2C）采用邻接法（ Neighbor-Joining， NJ）构建系统发育树，通过构建聚类树将其分为 12 个亚族（ A L） ，其中 nbsp;B亚族和 J 亚族只含有 AtPP2C 基因，其余 10 个亚族（ A、 C I、 K、 L）都含有 AtPP2C 和 VvPP2C 基因（图 1） 。可以得知，葡萄与拟南芥基因家族并不趋向于分别类聚。 nbsp;图 1 nbsp;拟南芥和葡萄 PP2C 基因进化树 nbsp;Fig. 1 nbsp;The unrooted phylogenetic tree of PP2C gene in Arabidopsis and grape Genome-wide identification and expression analysis of the PP2C gene family in Vitis vinifera. He Honghong， Lu Zhihao， Ma Zonghuan， Liang Guoping， Ma Lijuan， Wan Peng， Mao Juan. 1242 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 7 1237– 1250. 2.3 nbsp;葡萄 PP2C 家族基因结构分析 nbsp;葡萄 PP2C 家族基因序列长度分布在 2 645 14 665 bp 之间。除 VvPP2C03 和 VvPP2C19 外，其余包含外显子 3 10 个；而且除 L 亚族外，其余亚族中包含外显子数相近，差值不超过 4 个。尤其是 E 亚族中的 3 个成员，均包含 6 个外显子。但是，即使在相同亚族内，氨基酸序列上外显子的分布位置相差较大，序列长度各异，保守性差，无明显规律（图 2） 。推测每个亚族之间，在潜在的功能上会有一定的差异。 nbsp;图 2 nbsp;葡萄 PP2C 家族基因结构 nbsp;Fig. 2 nbsp;Structures of PP2C gene family in grape 2.4 nbsp;葡萄 PP2C 家族基因 motif 序列分析 nbsp;在葡萄 PP2C 家族基因中共找到了 15 个 motif（表 3）。 nbsp;如图 3 所示，除 VvPP2C07 外，其余 26 个 VvPP2C 均包含 motif1、 motif2、 motif8。 motif12、motif13、 motif15 主要分布于 C 亚族中的 VvPP2C04 和 VvPP2C24 上。 motif3、 motif7、 motif9 主要分布于 C 和 D 亚族中的部分成员。 motif5、 motif6 除 K 亚族外，其他亚族的 VvPP2C 中均有分布。motif10 仅分布于 D 亚族。 motif14 主要分布于 A、 G、 H 亚族。分析发现 C 亚族包含的 motif 最多，K 亚族包含的 motif 最少。 nbsp;何红红，路志浩，马宗桓，梁国平，马丽娟，万 nbsp; 鹏，毛 nbsp; 娟 . 葡萄 PP2C 家族基因的鉴定与表达分析 . 园艺学报， 2018， 45 7 1237– 1250. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;1243 表 3 nbsp;葡萄 nbsp;PP2C 蛋白氨基酸保守序列 nbsp;Table 3 nbsp;Conserved motifs of PP2C proteins in grape 保守基序编号 nbsp;Conserved motif 长度 /bp Length 氨基酸保守序列 nbsp;Amino acid conserved sequence motif1 29 RLSPEDEFLILASDGLWDVLSNZEAVDIV motif2 1 VVJICGRTLYVANVGDSRAVL motif3 50 PRGDPAQHLVEEALFRAAKKRGMDYHELLKIPRGDRRHYHDDITVIVISL motif4 21 EPDGTFFGVYDGHGGPDAADFmotif5 KGGLAVSRAIGDGYLKQPKVN motif6 21 GVAIQLSVDHKPNCEEERERI motif7 41 HSDVLDVJSKALRATEESFLSJVDKQVMERPZJASVGSCVL motif8 11 PDDITVVVVDI motif9 21 FRIDYVGTSPYJSCEPSLYVH motif10 29 LLWYKDLGQHVNGDFSMAVIQANNLLEDQ motif11 21 KNLQAAQGKKGEDRVLMVVSE motif12 50 CFTGEGGARRRQDISVLISDPLDEGLGHSFCYIRPDQSRLSSSKVHSEET motif13 41 WDDKHESNPRKKGKNSKNKYKGAAKKWEENQRRWKCEWDRE motif14 41 LPFIVEDEEWPQAJPRALVAAFVKTDIAFQEASSTSGTSAT motif15 50 TSFTSIPLQPIPRNWMNSGPIPGSPLEKSSTDQFQRSYSHGGFAFRPRSR 图 3 nbsp;葡萄 PP2C 家族 motif（ 1 15）分析 nbsp;Fig. 3 nbsp;Motif analysis of PP2C gene family in grape 2.5 nbsp;葡萄 PP2C 家族基因亚细胞定位预测和蛋白质二级结构分析 nbsp;葡萄 PP2C 基因家族集中在细胞质、叶绿体和细胞核中表达（表 4） 。在线粒体、液泡、内质网、细胞膜和细胞基质中有少量表达，在细胞骨架和过氧化物酶体中均不表达，只有 VvPP2C12 在高尔基体中表达。推测，其表达部位的不同可能与其执行的功能有关。 nbsp;Genome-wide identification and expression analysis of the PP2C gene family in Vitis vinifera. He Honghong， Lu Zhihao， Ma Zonghuan， Liang Guoping， Ma Lijuan， Wan Peng， Mao Juan. 1244 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 7 1237– 1250. 二级结构分析表明葡萄 PP2C 家族基因编码的 27 个蛋白的二级结构主要以 α–螺旋和不规则卷曲为主（表 5）。 nbsp;表 4 nbsp;葡萄 nbsp;PP2C 基因亚细胞定位预测 nbsp;Table 4 nbsp;Subcellular location prediction of PP2C gene in grape 基因 nbsp;Gene 细胞质 nbsp;Cytoplasm nbsp;叶绿体 nbsp;Chloroplast nbsp;细胞核 nbsp;Nucleus nbsp;线粒体 nbsp;Mitochondria nbsp;过氧化物酶体 nbsp;Peroxisome nbsp;细胞骨架 nbsp;Cytoskeleton nbsp;VvPP2C01 nbsp;10.5 nbsp;2.5 nbsp;VvPP2C02 5 2 5 nbsp; nbsp;VvPP2C03 2 9 2 nbsp; nbsp;VvPP2C04 1 2 9 1 nbsp;Vv/p