酸黄瓜渐渗系‘IL77’抗蔓枯病主效QTL定位及候选基因鉴定.pdf

园艺学报， 2018， 45 11 2141– 2152. Acta Horticulturae Sinica doi 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0269； http //www. ahs. ac. cn 2141 收稿日期 2018– 07– 16； 修回日期 2018– 10– 22 基金项目 国家重点研发计划项目（ 2016YFD0100204-25， 2016YFD0101705-5） ；国家自然科学基金重点项目（ 31430075） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail ） 黄瓜 / 酸黄瓜渐渗系‘ IL77’抗蔓枯病主效 QTL定位及候选基因鉴定 张 旭，徐 建，李 季，娄群峰，陈劲枫*（南京农业大学园艺学院，作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095） 摘 要 以黄瓜 /酸黄瓜渐渗系‘ IL77’为抗病亲本，栽培种‘ 8419’为感病亲本，通过亲本及 F2︰6群体筛选，构建了包含 137 对 SSR 标记和 6 对 InDel 标记的遗传图谱，结合 2017 年春、秋两季 F2︰6群体表型统计结果对抗蔓枯病主效 QTL 进行定位；同时构建极端混池并进行 QTL-seq，最终将抗病基因定位到 1 号染色体 24.6 27.1 Mb 范围内；通过与参考基因组 9930 比对发现该区段存在 13 个基因在外显子区域发生非同义突变，其中 Csa1G654870 参与 RNAi 抗性反应，可能与抗蔓枯病过程相关。通过 qRT-PCR验证发现，接种前后 Csa1G654870 在抗病亲本‘ IL77’中表达量明显高于感病亲本‘ 8419’ ，由此进一步推断 Csa1G654870 是抗蔓枯病基因。 关键词 黄瓜；渐渗系；蔓枯病；遗传图谱；混池测序；抗病基因 中图分类号 S 642.2 文献标志码 A 文章编号 0513-353X（ 2018） 11-2141-12 QTL Mapping and Identification of Candidate Gene for Resistance to Gummy Stem Blight in Cucumis sativus/hystrix Introgression Line‘ IL77’ ZHANG Xu， XU Jian， LI Ji， LOU Qunfeng， and CHEN Jinfeng*（ College of Horticulture， State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China） Abstract In this study， a linkage map containing 137 pairs of SSR markers and 6 pairs of InDel markers was constructed using recombinant inbred lines F2︰6derived from a cross between parental lines‘ IL77’ （ resistant line from the cross of C. hystrix C. sativus） and‘ 8419’ （ susceptible line） . Genetic analysis indicated that the resistance to gummy stem blight（ GSB） in‘ IL77’ was quantitative. Both mapping and BSA-seq analysis were used to detect quantitative trait loci（ QTLs） conferring GSB resistance in cucumber leaves. The results showed that the GSB resistance genes were located in the 24.6– 27.1 Mb region of chromosome 1. There were 13 candidate genes with exonic nonsynonymous SNP mutation predicted as GSB-resistance related genes in this region. Moreover， bioinatics analysis and qRT-PCR results provided strong evidence that Csa1G654870 was closely related to GSB resistance process. Keywords cucumber； introgression line； gummy stem blight； linkage map； BSA-seq； resistance gene 瓜类蔓枯病由瓜类黑腐球壳菌 Didymella bryoniae（ Auersw.） Rehm 引起，至少危害葫芦科 12 个 Zhang Xu， Xu Jian， Li Ji， Lou Qunfeng， Chen Jinfeng. QTL mapping and identification of candidate gene for resistance to gummy stem blight in Cucumis sativus/hystrix introgression line‘ IL77’ . 2142 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 11 2141– 2152. 属 23 种作物（ Keinath， 2011） 。蔓枯病（ Gummy stem blight， GSB）发病部位一般为叶片和茎部，受伤部位更易感病（ Stamand Wehner， 1995） ，引起幼苗猝倒，加速茎和叶柄溃烂，最终影响作物产量和品质（ Basim et al.， 2016） 。由于葫芦科作物普遍缺乏稳定抗性，蔓枯病给作物生产带来了巨大损失（ dos Santos et al.， 2013） 。 不同作物遗传特性及抗性存在差异（ Keinath， 2014） 。在甜瓜中已发现稳定抗源 PI140471 含抗性基因 Gsb-1（ Frantz Jahn， 2004）以及抗源 PI420145 含抗性基因 Gsb-6（ Wolukau et al.， 2009） ，并由此开发了一系列分子标记，为甜瓜抗蔓枯病分子育种奠定了良好基础，其他葫芦科作物通过选取抗性砧木进行嫁接在一定程度上增强了抗性（ Ito et al.， 2009） 。而黄瓜由于遗传基础狭窄（ Horejsi Staub， 1999） ，目前还没有发掘到主效抗病基因。种间杂交扩大了黄瓜的变异来源（ Chen et al.，1997） ， 通过 C. hystrix C. sativus， 对 F2的 52 个渐渗系和 8 个栽培种进行筛选， 用 SSR 标记进行 QTL定位，发现了渐渗系 HH1-8-1-2 的 2 个数量性状位点分别在 4 号和 6 号染色体上，跨度分别为 3.569和 1.299 Mb（ Lou et al.， 2013） 。以黄瓜品种‘ PI183967’和‘ 931’分别为抗感亲本，通过构建 RIL F9（ 160 株）及包含 405 个 SSR 标记的遗传图谱，将控制幼苗蔓枯病抗性的候选基因定位到 5 号染色体上，并鉴定出该区段 7 个 NBS-LRR 类基因，但缺少进一步分析及验证过程（ Liu et al.， 2017） 。 集群分离分析法（ Bulk Segregant Analysis， BSA）主要是通过选择表型差异显著的亲本构建分离群体（或家系群体） ，并从分离群体中选择目标性状极端的单株构建 DNA 混池（ DNA pools）进行候选基因定位。 QTL-seq 已广泛应用于水稻耐盐性状 （ Takagi et al.， 2015） ， 黄瓜早花性状 （ Lu et al.，2014） ，赤拟谷盗抗磷性状（ Jagadeesan et al.， 2013）候选基因的发掘，以及矮生梨育种（李炜 等，2015） 、葡萄白腐病（徐炎 等， 2003）抗性育种相关分子标记的开发。本研究以黄瓜 /酸黄瓜渐渗系‘ IL77’和栽培种‘ 8419’分别作为蔓枯病抗病、感病亲本，接种蔓枯病菌后通过构建遗传图谱进行 QTL 定位， 并结合 BSA 测序开发 InDel 标记并缩小定位区间， 最终在 1 号染色体上获得主效 QTL并得到 1 个候选基因 Csa1G654870。通过基因注释及 qRT-PCR 验证，推断其为抗蔓枯病候选基因。 1 材料与方法 1.1 材料和群体构建 试验材料有抗病亲本黄瓜 /酸黄瓜渐渗系‘ IL77’ （野生种 C. hystrix 与普通栽培黄瓜‘ CC3’种间杂交后代）、感病亲本普通栽培黄瓜‘ 8419’（由南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室黄瓜研究室保存）及其杂交后代 RIL 群体 F2︰6。选取本实验室前期分离纯化的强致病力 A1 蔓枯病菌菌种为接种病菌，用 PDA 试管保存于 4 ℃冰箱备用。 1.2 幼苗接种与病级统计 将保存在 4 ℃冰箱的蔓枯病菌转移到 PDA 培养基上活化培养， 25 ℃暗培养 7 d 后进行 4 d 紫外灯光照处理（ 12 h 紫外灯 /12 h 黑暗），诱导分生孢子产生。用无菌水配制孢子悬浮液，并用乳酸调整孢子悬浮液至 pH 3.5 4.0，用血球计数板统计孢子浓度。用于接种的孢子浓度为 1 106分生孢子 /毫升，接种前加入 2.5 g L-1的吐温 80 作为表面活性剂。 分别于 2017 年春季和秋季在南京农业大学牌楼基地和白马基地进行接种试验。在幼苗 3 4 片真叶时人工喷雾接种，喷洒至叶面滴水为止。接种后覆盖棚膜 3 d 遮光密闭，保证棚内相对湿度 92 95，昼夜温度 25 ℃ /21 ℃。接种 3 d 后揭开棚膜，保证幼苗正常生长所需光照、温度和水分条件。张 旭，徐 建，李 季，娄群峰，陈劲枫 . 黄瓜 /酸黄瓜渐渗系‘ IL77’抗蔓枯病主效 QTL 定位及候选基因鉴定 . 园艺学报， 2018， 45 11 2141– 2152. 2143 接种 10 d 后参照 Zhang 等（ 2013）的方法进行病级统计。 1.3 总 RNA 提取和极端混池测序 2017 年春季对接种 0、 2、 4 和 6 d 后的抗、感亲本‘ IL77’和‘ 8419’进行叶部取样，利用 Total RNA Kit（ TaKaRa， Japan）提取叶片总 RNA 用于相关抗病基因的定量验证，提取步骤参考试剂盒说明。根据 Murray 和 Thompson（ 1980）的 CTAB 法并做改良，提取亲本‘ IL77’、 ‘ 8419’及 RIL群体 F2︰6新鲜叶片的 DNA，用于遗传图谱构建及极端混池测序分析。以标准浓度 DNA 为对照，取2 μL DNA 溶液于琼脂糖凝胶（ 1EB）检测浓度。 根据 2017 年春季病级统计数据，挑选接种 10 d 后病级最高和最低的黄瓜苗各 20 株对叶部取样并提取 DNA。将提取的 DNA 分别等量混合作为抗病池和感病池进行 BSA-seq，亲本池选择‘ IL77’进行重测序。对测序结果的原始图像数据利用软件 bcf2fastq（ version 2.17.1.14）进行图像碱基识别（ Base calling），进行初步质量分析；使用二代测序数据质量统计软件 cutadapt（ version 1.9.1）对测序原始数据（ Pass Filter Data）去除接头以及低质量序列等；利用 Dragen 比对软件将 clean data 比对到参考基因组 9930 上进行统计比对； 基于比对结果， 使用 Samtools（ version 1.1） 软件， 以及 GATK的 Unified Genotyper 模块进行 SNV（单碱基突变） /InDel（插入或缺失突变）的检测，检测参考基因组每个位点是否存在 SNV 或者 InDel 突变。 1.4 遗传连锁图谱构建 SSR 引物序列来源于‘ 9930’和‘ Gy14’黄瓜基因组测序信息。 经双亲重测序利用 SAMTOOLS 检测长度小于 50 bp 小片段的插入与缺失，并用 Premier 5.0 软件设计 InDel 引物（由擎科生物技术有限公司合成）。选择均匀分布于 7 条染色体上的 1 335 对 SSR 引物及 31 对 InDel 引物对亲本‘ IL77’和‘ 8419’进行多态性分析，获得的多态性引物用于 117 株 RIL 群体 F2︰6单株的基因型鉴定。 PCR反应总体系为 10 μL 2 Taq Master Mix（含有 Taq 酶、 dNTPs、 MgCl2、 buffer） 5 μL，正、反向引物各 1 μL， DNA 1 μL， ddH2O 2 μL。聚丙烯酰胺凝胶电泳后显色统计。银染方法 400 mL 蒸馏水 0.8 g AgN03，可染 6 块 102 孔的胶，银染 7 min；蒸馏水清洗约 1 min； 6 g NaOH 400 mL ddH2O 4 mL HCHO，显色 3 min；与母本‘ IL77’带型一致的记为 A，与父本‘ 8419’带型一致的记为 B，杂合带型记为 H，模糊或缺失的条带用 X 表示。采用 QTL loci Mapping 软件 MAP 功能作图。 1.5 主效 QTL 定位 根据温室接种表型，利用 Microsoft Excel 97-2003 统计并处理病级数据，获得两季病情指数分布图用于遗传分析，其中病情指数用于 QTL 检测。病情指数 Σ（病级 该病级株数） /（最高病级 调查总株数） 100。 利用 QTL loci Mapping 软件 BIP 功能，采用复合区间作图法（ CIM）检测抗蔓枯病主效 QTL位点。步长 1 cM，在 α 0.01 水平，以 Permutation 检验法重复检验 1 000 次，将 LOD 阈值设定为2.0 来确定 QTL 在染色体上的位置及数目。 QTL 命名规则性状的英文缩写 染色体编号 QTL编号，如染色体上只有 1 个 QTL 可不进行染色体编号。 对于混池测序数据，基于基因分型结果，选择亲本（含有极端性状）作为参考，以 1 Mb 大小为窗口， 1 kb 为步长分析计算两个子代在亲本间标记位点的 SNP-index，并对 SNP-index 在染色体上的分布进行作图，通过两个子代 SNP-index 作差计算 ∆（ SNP-index），进行 1 000 次置换检验，选取 95置信水平作为筛选的阈值，置信水平线以上的窗口作为候选区间。 Zhang Xu， Xu Jian， Li Ji， Lou Qunfeng， Chen Jinfeng. QTL mapping and identification of candidate gene for resistance to gummy stem blight in Cucumis sativus/hystrix introgression line‘ IL77’ . 2144 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 11 2141– 2152. 1.6 qRT-PCR 验证 根据基因定位及注释结果， 推测位于 1 号染色体定位区段内的 Csa1G654870 与蔓枯病抗性相关，并对其在抗病、 感病品种中的表达模式进行了分析。 用 Primer5.0 进行特异引物设计， 引物序列如下正向引物 5′-ATTGTTTCTGCTGTGGCTCTT-3′；反向引物 5′-TTCTTCTTTGACTGGGTTTGC-3′。 使用 TaKaRa SYBRPremix Ex TaqTM PCR 试剂盒进行 qRT-PCR。本试验所用 PCR 仪器型号为ABl7500。对每个样本和内部参照进行扩增，重复 3 次。通过比较 Ct 的方法进行基因表达水平的相对定量分析，为消除样品间模板量的差异， ∆Ct 是看家基因的归一化， ∆∆Ct 是基准品的归一化。 2 结果与分析 2.1 表型统计与遗传分析 2017 年春季和秋季分别在牌楼和白马基地温室进行接种鉴定（图 1，图 2）， RIL 群体病情指数分布如图 3 所示。 2017 年春季 RIL 群体病情指数分布更为集中，极少有极抗或极感株型，病情指数大多分布在 30 60 之间，而秋季病级分布较为均匀。两季表型数据都呈现连续分布，符合数量性状的遗传特征，可以用于 QTL 检测。 图 1 田间（牌楼基地）自然状态抗病亲本 ‘ IL77’ （ a） 、 感病亲本 ‘ 8419’ （ b）及其接种 7 d 后（ c、 d）生长状况 Fig. 1 Growth of resistant line‘ L77’ （ a） ， susceptible line‘ 8419’ （ b） under natural environment and their perance in 7 d after inoculation（ c， d） 图 2 根据叶片发病面积对黄瓜蔓枯病划分病级 Fig. 2 Disease rating scale of each seedling corresponding to the symptom of leaves 张 旭，徐 建，李 季，娄群峰，陈劲枫 . 黄瓜 /酸黄瓜渐渗系‘ IL77’抗蔓枯病主效 QTL 定位及候选基因鉴定 . 园艺学报， 2018， 45 11 2141– 2152. 2145 图 3 RIL 群体接种后的枯萎病病情指数分布 Fig. 3 Frequency distribution of disease index of GSB in RIL population 2.2 连锁图谱构建 利用 1 335 对 SSR 引物对 ‘ IL77’和 ‘ 8419’进行双亲多态引物筛选，获得 250 对多态引物，多态率为 18.7。将 250 对亲本多态性引物用于 10 个 RIL F2︰6单株多态性检测，共得到 137 对 SSR引物用于后续群体图谱构建。 最终利用 118 株 RIL 群体构建了含有 137 对 SSR 引物的遗传图谱 （图 4） 。 图 4 基于 ‘ IL77’ ‘ 8419’ 杂交产生的 RIL F2︰ 6群体构建的遗传连锁图谱 Fig. 4 Linkage map based on RIL F2︰ 6population derived from a cross between‘ IL77’ ‘ 8419’ Zhang Xu， Xu Jian， Li Ji， Lou Qunfeng， Chen Jinfeng. QTL mapping and identification of candidate gene for resistance to gummy stem blight in Cucumis sativus/hystrix introgression line‘ IL77’ . 2146 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 11 2141– 2152. 表 1 遗传图谱数据统计 Table 1 Statistics of linkage map 染色体 Chromosome 标记数 Marker numbers总长度 /cM Total length 标记平均间距 /cM Mean marker intervalChr1 16 121.38 7.59 Chr2 11 172.90 15.72 Chr3 16 122.82 7.68 Chr4 22 121.46 5.52 Chr5 17 176.68 10.39 Chr6 35 481.91 13.77 Chr7 18 171.46 9.53 总计 Total 135 1 368.61 由于 SSR 引物来源于黄瓜基因组测序， 因此构建的 7 个连锁群分别与黄瓜的 7 条染色体相对应。遗传图谱数据如表 1 所示，连锁图谱总长度为 1 368.61 cM， 标记间平均间距为 10.1 cM。最长的连锁群在 6 号染色体，最短的在 1号染色体，每个连锁群标记数在 11 35 之间。 2.3 抗蔓枯病主效 QTL 定位 2017 年春、秋两季对幼苗接种蔓枯病菌后的表型统计，以 LOD 2.0 为阈值，检测到 1 个抗蔓枯病主效 QTL 位点（表 2）。 2017 春、秋两季主效 QTL 位点都在 Chr1 上，且都位于 SSR22637 UW083739 之间， LOD 值分别为 2.533 和2.308，可解释表型变异率分别为 12.11和 11.29，遗传距离为 7 cM，物理位置 22.8 27.5 Mb 之间。 表 2 利用 RIL F2 6群体在 2017 年春秋两季检测到的 QTL Table 2 QTL loci detected in RIL F2 6in 2017 spring and 2017 autumn 性状名 Trait name 染色体 Chr 位置 /cM Position 数量性状位点QTL 标记范围 Marker interval LOD 值 LOD score 可解释表型 变异率 / PVE 加性效应 Add 春季 Spring 1 89.00 Gsb1 SSR22637 UW083739 2.308 11.29 –5.63 秋季 Autumn 1 89.00 Gsb1 SSR22637 UW083739 2.533 12.11 –4.60 2.4 BSA-seq 鉴定出 1 个抗蔓枯病主效位点 对亲本 IL77 重测序以及对由子代 F2︰6构建的抗病、感病混池进行 Illumina Hi-seq 高通量测序，测序数据情况如表 3 所示。通过对原始数据进行预处理，对低质量数据进行过滤并去除污染及接头序列，最终在亲本池‘ IL77’产生 67 995 804 条片段，抗病池（ R pool）产生 71 156 550 条片段，感病混池（ S pool）产生 92 604 704 条片段，每条片段由 150 个碱基构成。通过与 9930 参考基因组比对，比对上参考基因组的片段比例都在 90以上，覆盖度都在 95以上，表明参考基因组的选择合理。 表 3 过滤后的数据统计表 Table 3 Statistics of clean data 样本 Sample 待测片段 Clean reads 片段长度 /bp Length 准确度 Q30/ 与参考基因组相同片段 Mapped reads 相同片段占比 / Mapped ratio 覆盖度 / Coverage IL77 67 995 804 150 94.09 64 358 659 94.65 96.74 抗病池 R pool 71 156 550 150 94.16 66 736 647 93.79 97.23 感病池 S pool 92 604 704 150 94.14 86 912 525 93.85 97.27 基于基因分型的结果，通过筛选亲本纯合的 SNP 位点，并以抗病亲本‘ IL77’基因组作为参考，以 1 Mb 大小为窗口， 1 kb 为步长分析计算得到抗病池和感病池在亲本间标记位点的 SNP-index（即SNP 的频率，完全与亲本相同的 SNP-index 为 0，完全与其不同的 SNP-index 为 1）。通过两个子代张 旭，徐 建，李 季，娄群峰，陈劲枫 . 黄瓜 /酸黄瓜渐渗系‘ IL77’抗蔓枯病主效 QTL 定位及候选基因鉴定 . 园艺学报， 2018， 45 11 2141– 2152. 2147 SNP-index 作差 ∆（ SNP-index） SNP index（极端性状 B）– SNP index（极端性状 A），进行 1 000次置换检验。选取 95置信水平作为筛选的阈值，折线即为以窗口形式展现的△（ SNP-index）分布，置信水平线以上的窗口为候选区间，最终将目标区域定位到 Chr1 23.3 27.1 Mb 之间（图 5）。 图 5 通过 QTL-seq 得到不同染色体上（ Chr1 Chr7）抗感池之间 ∆SNP-index 分布图 Fig. 5 ∆SNP-index graph was calculated by combining the ination of SNP-index in R-pool and S-pool from QTL-seq 2.5 开发 InDel 标记缩小定位区间 基于双亲重测序结果，利用 Primer 5.0 软件在 SSR22637 UW083739 之间继续设计 31 对 InDel标记加密遗传连锁图谱，最终得到 6 对 InDel 标记在双亲及 RIL F2︰6群体具有多态性（表 4），同时将 2017 年春、秋两季主效 QTL 区间都定位到 InDel12 SSR22637 之间，遗传距离为 8 cM， LOD值分别为 2.1 和 2.2，可解释表型变异率分别为 10.1和 10.8，物理位置在 Chr1 上 24.6 27.5 Mb之间（图 6）。结合 QTL-seq 定位结果，最终定位区间为 Chr1 上 24.6 27.1 Mb 之间，将主效 QTL缩小到 2.5 Mb 之间。 Zhang Xu， Xu Jian， Li Ji， Lou Qunfeng， Chen Jinfeng. QTL mapping and identification of candidate gene for resistance to gummy stem blight in Cucumis sativus/hystrix introgression line‘ IL77’ . 2148 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 11 2141– 2152. 表 4 黄瓜 1 号染色体上 SSR22637 UW083739 之间的多态性 InDel 标记信息 Table 4 Ination of InDel markers between SSR22637– UW083739 in Chr 1 标记 Marker 位置 /碱基 /bp Position 引物序列（ 5→ 3） Primer sequence InDel 7 23 457 126 F CCATCCTCATCCTCTATCAA； R CTCTCCAATTGTAATCGCTC InDel 9 23 948 898 F AAAGATGGAACTTGTTCGTG； R AGCCACATACTTCAGATGCT InDel 10 24 177 884 F GGCAACATAACATAATTCCG； R GGCAAGTAGAGACAAAATGC InDel 12 24 635 328 F CGAAATGGTCTCTCTAGGTG； R ATTATCCCGTTAGTCGATCC InDel 26 27 861 935 F TCGATACACTGATACGACACA； R CACATGTATATCGTGGCAAG InDel 29 28 540 709 F GCAATGTGATTCGATCTCTAC； R TGGTTTATGGACTAACCGAG 图 6 2017 年春、秋两季主效 QTL 定位到 InDel12 SSR22637 之间 Fig. 6 QTLs detected in both 2017 spring and autumn were located between markers InDel12– SSR22637 2.6 黄瓜抗蔓枯病候选基因筛选与鉴定 结合传统遗传图谱 QTL 定位与 QTL-seq，将抗蔓枯病基因定位到 1 号染色体 24.6 27.1 Mb 范围内，与参考基因组 9930 测序数据比对后发现，该区段共有 143 个基因完成注释。根据 SNP 发生突变的区域将这些基因分为 5 个类型非编码区域突变、基因上游区域突变、基因下游区域突变、外显子区域突变、内含子区域突变类型。外显子区域突变类型基因共有 23 个，其中发生同义突变的基因有 10个， 发生非同义突变的基因有 13个 （表 5） 。 通过对这 13个基因进行注释， 发现 Csa1G654870与抗病相关。 Csa1G654870 物理位置在 Chr1 上 26 154 333 26 178 614 bp 之间， 非同义突变发生在该基因转录本第 15 个外显子区域，第 1 831 位的碱基由 C 变成 A，相应氨基酸序列则由 R 突变为 S。Csa1G654870 参与合成核糖核酸酶类似蛋白，包含解旋酶 C 端、 Dicer 蛋白、解旋酶 ATP 结合域等结构。利用 TAIR 数据库，将 Csa1G654870 比对到拟南芥，发现与其序列相似度较高的 AT3G03300同样编码 Dicer 类蛋白 。 根据基因注释 AT3G03300 在芜菁皱缩病毒侵染过程中替代 DCL4 产生ta-siRNAs，并与 DCL1 合成的 miRNA 产生拮抗作用来调控抗病毒的沉默响应。 DCL1、 DCL4 作为一类保守的 dsRNA 特异性核糖核酸内切酶，在调控 RNA 降解、转录后基因表达以及抗病毒侵染等方面发挥着重要作用，因此推断 Csa1G654870 是抗蔓枯病候选基因。 张 旭，徐 建，李 季，娄群峰，陈劲枫 . 黄瓜 /酸黄瓜渐渗系‘ IL77’抗蔓枯病主效 QTL 定位及候选基因鉴定 . 园艺学报， 2018， 45 11 2141– 2152. 2149 表 5 黄瓜 1 号染色体 24624071– 27113178 bp 范围内 13 个基因在外显子区域发生非同义突变 Table 5 Nonsynonymous mutation in exon region was found in 13 genes in cucumber Chr1 24624071– 27113178 bp 突变位点 /碱基 Loci 参考基因组碱基 Ref 突变后的碱基 Obs 突变类型 Type 突变基因 Gene 24624071 G A exonic Csa1G627420 25463284 T C exonic Csa1G637440 25463448 G exonic Csa1G637440 25618945 T C exonic Csa1G642550 25634201 A G exonic Csa1G643050 25771921 T exonic Csa1G651140 25919122 G C exonic Csa1G652240 26023658 exonic Csa1G652810 26093142 A C exonic Csa1G653340 26167150 C A exonic Csa1G654870 26242932 T G exonic Csa1G655940 26755565 A exonic Csa1G662780 27069156 T A exonic Csa1G665940 27069162 exonic Csa1G665940 27113178 A C exonic Csa1G666990 2.7 qRT-PCR 验证 对接种蔓枯病菌 0、 2、 4 和 6 d 后的抗、感品种‘ IL77’和‘ 8419’叶片进行取样保存，对Csa1G654870 进行定量分析。分析结果表明，接种前（ 0 d） Csa1G654870 基因在两品种中表达量存在显著差异，接种后在‘ IL77’中表达量持续上调，接种 4 d 后达到最大，然后急剧下降；而在感病品种‘ 8419’中，其表达量相对于抗性品种一直处于较低的水平（图 7）。 图 7 抗病候选基因 Csa1G654870 在抗病品种‘ IL77’和感病品种‘ 8419’接种蔓枯病菌后的表达差异 Fig. 7 Expression differences of resistant candidate gene Csa1G654870 in resistant variety‘ IL77’ and susceptible variety‘ 8419’ after inoculation 3 讨论 遗传连锁图谱通常用于数量性状位点定位，从而获得与目的性状连锁的基因组片段，开展基因的图位克隆等工作（段蒙蒙 等， 2014；葛海燕 等， 2015；欧承刚 等， 2017）。还可以通过图谱比较， 提供基因组进化信息， 进而探索物种的遗传演化过程。 随着黄瓜基因组测序工作的完成， 以 SSR标记为主的高密度遗传图谱已将标记间平均距离缩短到 0.51 cM（ Zhang et al.， 2012），而简化基因Zhang Xu， Xu Jian， Li Ji， Lou Qunfeng， Chen Jinfeng. QTL