基于ITS序列的中国樱桃、欧洲甜樱桃和毛樱桃种内遗传多样性及种间关系分析.pdf
<p>园艺学报， 2018， 45 (1)： 126 138. Acta Horticulturae Sinica 126 doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0317； http： /www. ahs. ac. cn 收稿日期 ： 2017 08 03； 修回日期 ： 2017 12 28 基金项目 ： 国家自然科学基金项目（ 31672114） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： wangxrsicau.edu.cn） 基于 ITS 序列的中国樱桃、欧洲甜樱桃和毛樱桃种内遗传多样性及种间关系分析 王 浩1，黄智林1，陈 涛2，张 静2，王 燕2，陈 清1，汤浩茹1,2，王小蓉1,2,*（1四川农业大学园艺学院，成都 611130；2四川农业大学果蔬研究所，成都 611130） 摘 要： 对中国樱桃 Cerasus pseudocerasus（ Lindl.） G. D on（地方种质 35 份，野生资源 35 份） ，欧洲甜樱桃 C. avium（ L.） Moench（ 18 份）和毛樱桃 C. tomentosa（ Thunb.） Wall.（ 7 份）共 95 份材料的核糖体内转录间隔区（ ITS， internal transcribed spacer）序列进行了测定和分析，以期从 ITS 的 DNA序列变异角度揭示种内遗传多样性及种间遗传关系。结果表明： （ 1） 96 条 ITS 序列比对后长度为 712 bp，G + C 含量为 58.1%，检测到 71 个变异位点（ 9.97%） ，共定义了 37 个单倍型；中国樱桃、欧洲甜樱桃和毛樱桃的单倍型多样性和核酸多样性分别为 0.840 和 0.00466、 0.928 和 0.00396、 0.905 和 0.00564，中国樱桃中栽培种质遗传多样性明显低于其野生资源； （ 2）种间遗传关系显示，中国樱桃与欧洲甜樱桃之间的遗传距离较近（ 0.019） ，而与毛樱桃遗传距离较远（ 0.048） ； （ 3）邻接聚类和单倍型网络分析显示 3 个种分别聚为 3 个分支，种间具有较大的遗传分化。同时，选择 3 个种的代表单倍型进行其 ITS 序列的二级结构预测分析， 3 个种之间 ITS1 区、 ITS2 区的二级结构差异较大，最小自由能差异显著，进一步揭示了 3 个种间的遗传关系较远。综合分析认为， 3 个樱桃种内均具有较高的遗传多样性，种间具有较大的遗传分化，遗传关系较远，其中毛樱桃与中国樱桃和欧洲甜樱桃的遗传关系均较远。 关键词： 中国樱桃；欧洲甜樱桃；毛樱桃； ITS 序列；单倍型；遗传多样性；种间关系 中图分类号： S 662.5 文献标志码： A 文章编号： 0513-353X（ 2018） 01-0126-13 Genetic Diversity and Relationship Analysis Among Cerasus pseudocerasus，C. avium， and C. tomentosa Based on Internal Transcribed Spacer（ ITS）Sequences WANG Hao1， HUANG Zhilin1， CHEN Tao2， ZHANG Jing2， WANG Yan2， CHEN Qing1， TANG Haoru1,2，and WANG Xiaorong1,2,*（1College of Horticulture， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China；2Institute of Pomology and Olericulture， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China） Abstract： In this study， we sampled a total of 95 samples， including 35 landraces and 35 wild individuals of Chinese cherry from 6 populations across 35 counties of 8 provinces in China， 18 cultivars of European sweet cherry from 10 countries in the world， as well as 7 semi-wild Nanking cherry resources 王 浩，黄智林，陈 涛，张 静，王 燕，陈 清，汤浩茹，王小蓉 . 基于 ITS 序列的中国樱桃、欧洲甜樱桃和毛樱桃种内遗传多样性及种间关系分析 . 园艺学报， 2018， 45 (1)： 126 138. 127 from 7 counties of 5 provinces in China. Based on internal transcribed spacer（ ITS） sequences， we tried to study the genetic diversity within species and interspecific relationship among them. The final ITS dataset contained 712 aligned nucleotides， with 58.1% of G + C content， of which 71（ 9.97%） were variable sites. The ITS sequences defined 37 haplotypes. The haplotype diversity（ Hd） and nucleic acid diversity（ ）of C. pseudocerasus， C. avium， and C. tomentosa were（ 0.840， 0.00466） ， （ 0.928， 0.00396） and（ 0.905，0.00564） ， respectively. Within C. pseudocerasus， the genetic diversity of germplasm（ Hd= 0.726， = 0.00224） was significantly lower than that of wild resource（ Hd= 0.914， = 0.00681） . Interspecific genetic relationship analysis showed close relationship（ 0.019） between Chinese cherry and sweet cherry， while they revealed further relationship with Nanking cherry. Both Neighbor-Joining reconstruction and haplotype network showed three distinct branches with obvious genetic differentiation among the three species. In addition， there were significant differences in the secondary structure of the ITS1 and ITS2 regions and t-detection of the minimum free energy. Based on above results， there were high genetic diversity and obvious genetic differentiation among three cherry cultivated species. Close relationship was detected between Chinese cherry and European sweet cherry， while far distance between Nanking cherry with them. Keywords： Cerasus pseudocerasus； C. avium； C. tomentosa； ITS sequence； haplotype； genetic diversity； interspecific relationship 中国樱桃 Cerasus pseudocerasus（ Lindl.） G. Do n、欧洲甜樱桃 C. avium（ L.） Moench和毛樱桃 C. tomentosa（ Thunb.） Wall.隶属蔷薇科（ Rosaceae）李亚科（ Prunoideae）樱属（ Cerasus Mill.）（俞德浚， 1986） 。中国樱桃和毛樱桃起源于中国，其中中国樱桃在中国已有近 3 000 年的栽培历史（俞德浚， 1979；刘长江和刘美洲， 1993） ；欧洲甜樱桃的野生祖先 Mazzard被认为起源于亚洲西部和欧洲东南部（ Harlan， 1971； Mariette et al.， 1997； Hanelt et al.， 2001） ， 4 000 5 000 年前开始栽培驯化（ Janick， 2005； Meyer & Purugganan， 2013） ，现在世界各地广泛栽培。在这 3 个樱桃栽培种中，中国樱桃果实甜酸适度，风味浓郁，可溶性固形物含量 11.0% 34.0%，多数超过 20%，但果实较小，不耐储运（黄晓姣 等， 2013；陈 涛 等， 2016） ；而毛樱桃主要是野生和半野生分布（游泳 等， 1991） ；欧洲甜樱桃果实较大（ 4.0 15.0 g） ，较耐储运（蔡宇良 等， 2005；吕秀兰 等， 2005；贾海慧 等， 2007） ，在生产上很受欢迎（韩礼星 等， 2008） 。研究资源遗传多样性和遗传关系对于樱桃良种选育和产业发展意义重大，培育优缺点互补的品种是育种学家们进一步努力的方向。 对栽培樱桃遗传多样性与种间遗传关系的研究已有报道，如 RAPD（ Cai et al.， 2007） 、 ISSR（ Li et al.， 2009；宋常美 等， 2011； Najafzadeh et al.， 2014） 、 RFLP（曹东伟 等， 2007）和 SRAP（路娟 等， 2009； Abedian et al.， 2012）等分子标记或 DNA 序列（ China Plant BOL Group， 2011； Bai et al.， 2014； Chen et al.， 2015）有较多应用。但这些研究只涉及到樱属中某单一种或种内某一类群的遗传多样性，使用的标记类型较单一，所揭示的多态性位点有限，且不同分子标记的适用性也不尽相同。目前基于 ITS 序列对于中国樱桃、欧洲甜樱桃及毛樱桃 3 个种全面系统的遗传多样性及遗传关系还未见报道。 本研究中选择具代表性的中国樱桃、 欧洲甜樱桃和毛樱桃进行 ITS 序列测定和分析， 以期从 ITS的 DNA 序列变异角度揭示种内的遗传多样性及 3 个种间的遗传关系，探讨其在樱属种间关系研究中的应用价值，为樱桃资源的有效保护、核心种质构建和育种利用以及 ITS 在樱属植物资源鉴定利用提供参考依据。 Wang Hao， Huang Zhilin， Chen Tao， Zhang Jing， Wang Yan， Chen Qing， Tang Haoru， Wang Xiaorong. Genetic diversity and relationship analysis among Cerasus pseudocerasus， C. avium， and C. tomentosa based on internal transcribed spacer（ ITS） sequences. 128 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 126 138. 1 材料与方法 1.1 材料 2009 2015 年，在对中国樱桃资源全面调查、收集和评价基础上，选取中国樱桃栽培品种（种质） 35 份 8 省， 35 个县（市）和野生种质 35 份 6 个群体， 35 个个体、欧洲甜樱桃 18 个品种（来自 10 个国家，均采自中国农业科学院郑州果树研究所） 、毛樱桃 7 份 5 省， 7 个县（地区） ，半野生栽培，共 95 份材料（表 1） ，采集幼嫩叶片，变色硅胶干燥后密封袋封存备用。 1.2 基因组 DNA 提取、 PCR 扩增及测序 采用改良 CTAB 法（ Chen et al.， 2013）提取基因组 DNA。选取 ITS 通用引物 ITS5（ 5-GGAAGTAAAAGCGTAACAAGG-3）和 ITS4（ 5-TCCTCCGCTATATGATATGC-3） （ Vijayan et al.， 2009） 进行目的片段 PCR 扩增。 采用 25 L 反应体系， 包括 10× PCR Buffer10 mmol · L-1Tris-HCl（ pH 8.0） 、 50 mmol · L-1KCl、 1.5 mmol · L-1EDTA4.0 L、 MgCl2（ 25 mmol · L-1） 2.4 L， dNTP mix（ 10 mmol · L-1） 2.8 L，正、反引物各 3.5 pmol · L-1， 1.5 U Taq DNA 聚合酶（北京天根）以及 30 50 ng DNA 模板。扩增反应程序为 94 预变性 4 min， 94 变性 45 s， 53复性 90 s， 72 延伸70 s，共 32 个循环，最后 72 延伸 10 min。扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后送至深圳华大基因公司进行双向测序，比对后的序列提交至 GenBank 并获得登录号（ KY749248-KY749337） 。 1.3 数据处理和分析 采用 Lasergene 7.0 软件包的 SeqMan 对正反向序列进行拼接（ Burland， 2000） ，参照 Chromas序列峰图对误读位点进行人工校正。对拼接好的序列采用 MEGA 6.0（ Lewis et al.， 2013）进行比对，统计序列长度、碱基组成；采用 Kimura 2-parameter 模型计算单倍型之间的遗传距离，构建 NJ（ Neighbor-Joining）系统发育树，同时以自展法（ bootstrap）进行检验， 1 000 次重复。种间遗传分化系数（ Fst）利用 Arlequin 3.0 软件包（ Excoffier et al.， 2005）进行计算，并进行 1 000 次随机抽样的显著性检验。利用 DnaSP 5.1（ Librado， 2009）软件计算单倍型个数（ H） 、单倍型多样性（ Hd） 、核苷酸多样性（ ）等遗传多样性指标。 采用 Network 4.2.0.1（ Forster et al.， 2004）的 Median-joining（ MJ）算法（ Bandelt et al.， 1999）对单倍型数据进行网状支系分析并作图， 并用溯祖理论来推测分析单倍型间的亲缘关系。 利用 Vienna RNA server（ Hofacker， 2003）网络工具对 ITS 单倍型进行二级结构预测，改善和提高系统发育分析的可靠性（ Caetano-Anollés， 2002） 。 2 结果与分析 2.1 ITS 序列特征及遗传多样性分析 中国樱桃 ITS 序列长度范围为 702 703 bp，欧洲甜樱桃为 704 705 bp，毛樱桃为 709 bp（表1） 。所有扩增序列比对后长度为 712 bp，共检测到 71 个变异位点（表 2） ，占总位点的 9.97%， ITS1区存在 40 个， 5.8S 区 3 个， ITS2 区 28 个，其中 54 个为简约信息位点；含插入 /缺失 10 处，长度变异较小（表 1） 。 3 个樱桃种 ITS 区域的 G + C 含量在 57.86% 59.77%之间，其中毛樱桃（ 59.77%）最高，中国樱桃（ 57.86%）最低（表 3） 。 王 浩，黄智林，陈 涛，张 静，王 燕，陈 清，汤浩茹，王小蓉 . 基于 ITS 序列的中国樱桃、欧洲甜樱桃和毛樱桃种内遗传多样性及种间关系分析 . 园艺学报， 2018， 45 (1)： 126 138. 129 表 1 供试材料、来源及其遗传特性 Table 1 Sampling location used in this study and genetic characteristics 樱桃 Cerasus 来源 Origin 采样地 Location 品种 /编号 Cultivar/Code 单倍型 Haplotype 序列长度 /bp Length 中国樱桃（栽培）C. pseudocerasus （ Landrace） 四川 Sichuan 雅安 Yaan 名山 Mingshan 荥经 Yingjing 石棉 Shimian 汉源 Hanyuan 丹棱 Danleng 西昌 Xichang 蒲江 Pujiang 简阳 Jianyang 峨眉 Emei 青川 Qingchuan 北川 Beichuan 雅安红樱桃 Yaan Hongyingtao M64 YJ65 S138 HY153 Mei85 X101， D104， X109 紫樱桃 Ziyingtao 白花樱桃 Baihua Yingtao EM130 QX541 BT517，白樱桃 BaiYingtao H1 H2 H1 H3 H2 H2 H2， H4， H5 H1 H3 H2 H2 H1， H2 702 702 702 703 702 702 702 702 703 702 702 702 重庆 Chongqing 涪陵 Fuling 巴南 Banan F2559 黑珍珠 Heizhenzhu H1 H1 702 702 陕西 Shaanxi 商南 Shangnan 汉中 Hanzhong 佛坪 Foping 西乡 Xixiang SX410 HZ301 小籽红樱桃 Xiaozi Hongyingtao 西乡红樱桃 Xixiang Hongyingtao H2 H1 H6 H6 702 702 702 702 安徽 Anhui 太和 Taihe 米儿红 Mierhong H2 702 贵州 Guizhou 贵阳 Guiyang 毕节 Bijie 大叶红樱桃 Daye Hongyingtao 玛瑙红 Ma'naohong H7 H8 702 703 河南 Henan 洛阳 Luoyang 郑州 Zhengzhou 郑州 Zhengzhou 洛阳古樱 Luoyang Guying 燥樱桃 Zaoyingtao 笨樱桃 Benyingtao H2 H1 H2 702 702 702 甘肃 Gansu 天水 Tianshui 天水 Tianshui 大平叶 1 Dapingye 1 大平叶 2 Dapingye 2 H1 H2 702 702 山东 Shandong 临朐 Linqu 五莲 Wulian 诸城 Zhucheng 安丘 Anqiu 昌邑 Changyi 昌乐 Changle 小红樱 Xiaohongying 红樱桃 Hongyingtao 黄樱桃 Huangyingtao 红樱桃 Hongyingtao 樱珠 Yingzhu 红樱桃 Hongyingtao H2 H1 H1 H8 H2 H2 702 702 702 703 702 702 中国樱桃（野生） C. pseudocerasus （ Wild） 四川 Sichuan 西昌 Xichang, 青川 Qingchuan 石棉 Shimian 雅安 Yaan 北川 Beichuan 西昌群体 Xichang（ 5） 青川群体 Qingchuan（ 5） 石棉群体 Shimian（ 5） 雅安群体 Yaan（ 5） 北川群体 Beichuan（ 11） H9， H10 H1， H2， H8， H12 H1， H2， H13， H14 H1， H8， H15， H16， H17 H1， H2， H8， H15， H18， H19， H20， H21 702 703 702 703 702 703 702 703 702 703 贵州 Guizhou 贵阳 Guiyang 贵阳群体 Guiyang（ 4） H2， H7， H11 702 703 欧洲甜樱桃 C. avium 美国 USA * 滨库 Bing 美早 Tieton H22 H22 704 704 加拿大 Canada * 先锋 Van 拉宾斯 Lanpins 斯坦勒 Stella H24 H24 H25 704 704 704 乌克兰 Ukraine * 维卡 Vega 早大果 KpynHonnoAHa H29 H26 705 705 德国 Germany * 斯卡奈德斯 Scheiders 雷佶娜 Regina H30 H25 705 704 欧洲 Europe * 那翁 Napoleon 马扎德 Mazzard H32 H22 705 704 日本 Japan * 佐藤锦 Satonishiki 丰锦 Yutakanihiki H25 H27 704 704 捷克 Czech * 柯迪亚 Kordia H22 705 法国 France * 勃兰特 BID.Burlat H28 704 意大利 Italy * 莫莉 Bigarreau Moreau H31 704 匈牙利 Hungary * Mnchebergi korai H31 704 苏联 Soviet Union * 大紫 Black Tartarian H23 704 Wang Hao， Huang Zhilin， Chen Tao， Zhang Jing， Wang Yan， Chen Qing， Tang Haoru， Wang Xiaorong. Genetic diversity and relationship analysis among Cerasus pseudocerasus， C. avium， and C. tomentosa based on internal transcribed spacer（ ITS） sequences. 130 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 126 138. 续表 1 樱桃 Cerasus 来源 Origin 采样地 Location 品种 /编号 Cultivar/Code 单倍型 Haplotype 序列长度 /bp Length毛樱桃 河南 Henan 郑州 Zhengzhou 郑州毛樱桃 Zhengzhou Maoyingtao H34 709 C. tomentosa 新疆 Xinjiang 大西沟 Daxigou 新疆毛樱桃 Xinjiang Maoyingtao H35 709 甘肃 Gansu 定西 Dingxi 天水 Tianshui 平凉 Pingliang 定西毛樱桃 Dingxi Maoyingtao 天水毛樱桃 Tianshui Maoyingtao 平凉毛樱桃 Pingliang Maoyingtao H37 H33 H37 709 709 709 山东 Shandong 昌邑 Changyi 山东毛樱桃 Shandong Maoyingtao H34 709 四川 Sichuan 泸定 Luding 泸定毛樱桃 Luding Maoyingtao H36 709 注： * 是指采集于中国农业科学院郑州果树研究所。括号内数字表示样品数量。 Note： * Represents samples collected from Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Science（ CAAS） . The numbers in bracket represent the number of samples. 表 2 樱桃 37 个单倍型的 ITS 序列差异位点 Table 2 Variable sites of the aligned ITS sequences in the 37 haplotypes in three cherry species 单倍型 Haplo- type 变异位点 Polymorpmorphic site ITS1 61 62 67 69 79 81 88 95 96 97 99 100 104 128 130 134 135 136 137 142 144 148 149 151 157 159 163 185 189 203 208 225 230 233 245 H1 C C A T C C T T C T G A A G G T C G T T C A A A T T T T T C T G C G C H2 . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H3 . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . H4 . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H5 . . . . G . . . . . . . . . . G . . . . . . . C . . . C . . . A A . . H6 . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H7 . . . . G . . . . . . . . . . G . A . . . . . C . . . C . . . . A . . H8 . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H9 . . . . G . . . . . . . . . . G . . . . . . . C . . . C . . . A A . . H10 . . . . G . . . . . . . . . . G . . . . . . . C . . . C . . . A A . . H11 . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . C . . . . . . . H12 . . . . G . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . H13 . . . . G . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . H14 . . . . G . . . . . . . . . . G . . . . . . . C . . . C . . . A A . . H15 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H16 . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H17 . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H18 . . T . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . H19 . . . . G . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H20 . . . . G . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . H21 A G . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H22 . . . . G G . . . . . . . A . G . A . . . . . C . . . C . T . . . . . H23 . . . C G G G . . . . . . A . G . . . . . . . C . . . C . T . . . . . H24 . . . . G G . . . . . . . A . G . A . . . . . C . . . C . T . . . A . H25 . . . . G G . . . . . . . A . G . A . . . . . C . . . C . T . . . . . H26 . . . . G G G . . . . . . A . G . . . . . . . C . . . C . T . . . . . H27 . . . . G G G . . . . . . A . G . A . . . . . C . . . C . T . . . . . H28 . . . . G G G . . . . . . A . G . . . . . . . C . . . C . T . . . . G H29 . . . C G G . . . . . . . A . G . A . . . . . C . . . C . T . . . . . H30 . . . C G G . . . . . . . A . G . A . . . . . C . . . C . T . . . . . H31 . . . C G G . . . . . . . A . G . A . . . . . C . . . C . T . . . . . H32 . . . . G G . . . . . . . A . G . A . . . . . C . . . C . T . . . . . H33 . . . . G . C C . G C T T . . G . . C C . G G C A C G C . T C . . . . H34 . . . . G . C C . G C T T . T G . . C C . G G C A C G C . T C . . . . H35 . . . . G . C C . G C T T . T G . . . C . G G C A C G C . T C . . . . H36 . . . . G . C C T G C C T . . G . . . C G G G C A C G C . T C . . . . H37 . . . . G . C C . G C T T . T G . . C C . G G C A C G C . T C . . . . 单倍型 Haplo- 变异位点 Polymorpmorphic site ITS1 5.8S ITS2 type 246 247 251 253 254 280 293 342 436 447 448 455 463 475 478 498 501 502 503 509 525 535 538 540 541 554 579 592 605 607 615 623 626 637 641 642H1 G C C G C C C T A C A A C G T A C T C C A C C A C A G G C G T G T T A T H2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . H4 T T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A H5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . H7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 王 浩，黄智林，陈 涛，张 静，王 燕，陈 清，汤浩茹，王小蓉 . 基于 ITS 序列的中国樱桃、欧洲甜樱桃和毛樱桃种内遗传多样性及种间关系分析 . 园艺学报， 2018， 45 (1)： 126 138. 131 续表 2 单倍型 Haplo- type 变异位点 Polymorpmorphic site ITS1 5.8S ITS2 246 247 251 253 254 280 293 342 436 447 448 455 463 475 478 498 501 502 503 509 525 535 538 540 541 554 579 592 605 607 615 623 626 637 641 642H8 T T . . . . . .</p>
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