葡萄病毒A实时荧光定量RT-PCR检测技术的建立及应用.pdf

p园艺学报， 2018， 45 11 2243– 2253. Acta Horticulturae Sinica nbsp; doi 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0124； http //www. ahs. ac. cn nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 2243 收稿日期 2018– 05– 02； 修回日期 2018– 11– 09 基金项目 国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（ CARS-29-bc-1） nbsp;* 通信作者 nbsp;Author for correspondence（ E-mail ） nbsp;葡萄病毒 A 实时荧光定量 RT-PCR 检测技术的建立及应用 nbsp;任 nbsp;芳，董雅凤*，张尊平，范旭东，胡国君 （中国农业科学院果树研究所，国家落叶果树脱毒中心，辽宁兴城 nbsp;125100） nbsp;摘 nbsp;要 根据文献报道和 GenBank 已登录序列设计引物建立了葡萄病毒 A（ Grapevine virus A， GVA）SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量 RT-PCR 检测技术体系。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好线性关系，扩增效率为 99.2，决定系数为 0.999，可特异性检测 GVA，灵敏度高（达常规 RT-PCR 的100 倍） ，重复性好。对不同季节、不同品种以及不同部位葡萄样品（嫩叶、嫩叶柄、老叶、老叶柄、卷须和休眠枝条）中 GVA 的检出率普遍高于常规 RT-PCR。不同季节间比较，对秋、冬季样品检测效果最好，除嫩叶外其余部位检出率均达 100，春夏季检出率为 10 100。不同部位间比较，老叶柄和休眠枝条检测效果最好， 检出率均达 100， 其次为老叶 （ 80 100） ， 其余部位样品检出率为 10 100。在大量田间样品检测中，休眠枝条样品检测结果与常规 RT-PCR 一致，而秋季老叶柄样品检出率明显高于常规 RT-PCR。 nbsp;关键词 葡萄；葡萄病毒 A；检测；实时荧光定量 RT-PCR；常规 RT-PCR 中图分类号 S 663.1 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;文献标志码 A nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 文章编号 0513-353X（ 2018） 11-2243-11 Development and Application of a Quantitative RT-PCR Approach for Detection of Grapevine virus A REN Fang， DONG Yafeng*， ZHANG Zunping， FAN Xudong， and HU Guojun*（ National Center for Eliminating Viruses from Deciduous Fruit Trees， Research Institute of Pomology， Chinese Academy of Agriculture Sciences， Xingcheng， Liaoning 125100， China） nbsp;Abstract To develop a rapid and highly sensitive for Grapevine virus A（ GVA） detection，a SYBR GreenⅠ real time fluorescence quantitative RT-PCR （ RT-qPCR） was established， and an excellent linear correlation（ R2 0.999） and a high amplification efficiency（ E 99.2） were obtained from standard curve of cDNA. The RT-qPCR could be used to detect GVA specifically， and the sensitivity was 100-fold higher than conventional RT-PCR. Reproducibility test revealed that the coefficients of variation in the intra- and extra- assay were 0.16– 0.31 and 2.91， respectively，indicating a good reproducibility. The RT-qPCR could be used to detect a wide range of sample types， and the detection rates of samples from different seasons， cultivars and positions（ young leaves，young petioles， old leaves， old petioles， tendrils and dormant branches） were generally higher than Ren Fang， Dong Yafeng， Zhang Zunping， Fan Xudong， Hu Guojun. Development and application of a quantitative RT-PCR approach for detection of Grapevine virus A. 2244 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 11 2243– 2253. conventional RT-PCR. Comparison of the detection rates of samples in different seasons showed that samples in autumn and winter were best for detection， and except for young leaves， the detection rates of all samples in these two seasons were all 100. The detection rates of samples in spring and summer were 10 to 100. Comparison of the detection rates of samples in different positions showed that samples of old petioles and dormant branches were best for detection， for which the detection rates were all 100. The detection rate for old leaves was 80 to 100， and for samples from other positions was from 10 to 100. In detection of field samples， the results of dormant branches were most consistent with conventional RT-PCR， but the detection rate of old tendrils in autumn by RT-qPCR was obviously higher than that by conventional RT-PCR. Keywords grapevine； Grapevine virus A； detection； real-time fluorescent quantitative RT-PCR；conventional RT-PCR 葡萄皱木复合病（ Rugose wood complex， RW）是葡萄上的一类重要病害，发生普遍，可造成葡萄嫁接成活率下降、春季萌芽延迟、生长减弱甚至衰退死亡等（ Martelli， 1993） 。葡萄皱木复合病主要由线性病毒科（ Flexiviridae）葡萄病毒属（ Vitivirus）病毒引起，其中葡萄病毒 A（ Grapevine virus A， GVA） 是主要病原之一 （ Martelli et al.， 1997） ， 其还与南非葡萄西拉衰退病有关 （ Goszczynski et al.， 2008） 。目前 GVA 已在南非（ Goszczynski amp; Jooste， 2003） 、意大利（ Murolo et al.， 2008） 、法国（ Hommay et al.， 2008） 、澳大利亚、美国（ Goszczynski amp; Habili， 2012）以及中国（任芳 nbsp;等，2012；王建辉 nbsp;等， 2013）等普遍发生，危害趋势不断加重。 nbsp;目前葡萄病毒检测常用的 ELISA 血清学检测方法简单快速，但灵敏度略低于分子检测方法，且GVA 抗血清需从国外进口，本实验室制备了 GVA 多克隆抗体，但尚只能对少数样品检测成功（任芳 nbsp;等， 2014） ； RT-PCR 是另一广泛应用的方法，但其在灵敏度和检测范围上还存在一定不足。实时荧光定量 RT-PCR（ Real-time fluorescent quantitative RT-PCR， RT-qPCR）具有特异性强、灵敏度高等优点，在多种果树病毒检测中灵敏度普遍达常规 RT-PCR 的 100 倍以上（ Beuve et al.， 2007；Loconsole et al.， 2010；秦子禹 nbsp;等， 2015； Chen et al.， 2016；周俊 nbsp;等， 2016）。目前国际上已建立葡萄卷叶伴随病毒、皱木复合相关病毒、扇叶病毒、斑点病毒等主要葡萄病毒的 RT-qPCR 方法（ Beuve et al.， 2007； Osman amp; Rowhani， 2008； Poojari et al.， 2016； Bruisson et al.， 2017）。国内目前仅报道了葡萄扇叶病毒（周俊 nbsp;等， 2016）、葡萄卷叶伴随病毒– 3（乾义柯 nbsp;等， 2017）和葡萄斑点病毒（卓娜 nbsp;等， 2011）等少数几种葡萄病毒的 RT-qPCR 检测方法，多种葡萄病毒的 RT-qPCR检测还未见报道。 nbsp;本研究中建立了一种 GVA SYBR GreenⅠ染料法 RT-qPCR 检测技术，并对不同季节和不同部位田间葡萄样品进行检测验证和比较，以期为 GVA 的高效、准确检测提供一种可靠的技术手段，为检测样品的取样时间及部位提供选择依据，并为进一步分析病毒浓度变化规律提供基础。 nbsp;1 nbsp;材料与方法 nbsp;1.1 nbsp;材料及试剂 nbsp;2016 2017 年从辽宁省兴城市中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心毒源保存圃采集葡萄嫩叶（枝条顶端嫩梢从上往下第 2、 3 片叶）、嫩叶柄、老叶（枝条基部自下往上第 2、 3任 nbsp; 芳，董雅凤，张尊平，范旭东，胡国君 . 葡萄病毒 A 实时荧光定量 RT-PCR 检测技术的建立及应用 . 园艺学报， 2018， 45 11 2243– 2253. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;2245 片叶）、老叶柄、卷须和一年生休眠枝条等样品备用。 nbsp;10 PCR Buffer、 dNTPs、 Taq 酶、 DNA Marker DL2000、反转录试剂盒 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 和 Escherichia coli DH5α 感受态购自大连宝生物公司（ TaKaRa）； M-MLV 逆转录酶购自 Promega 公司； 2 SYBR Green qPCR Mix、 pTOPO-TA Vector、胶回收试剂盒购自北京艾德莱生物有限公司；实时荧光定量 RT-PCR 管购自美国 Bio-Rad 公司；实时荧光定量 PCR 仪为美国 BIO-RAD CFX ConnectTMReal-Time System。 nbsp;1.2 nbsp;引物设计及克隆鉴定 nbsp;根据 GenBank 已登录序列和本实验室获得的 GVA 辽宁分离物序列（任芳 nbsp;等， 2012），利用软件 Primer premier 5.0 及 Oligo 7.0 设计引物，并参考文献报道（ Osman amp; Rowhani， 2008）部分 GVA引物略作修改，设计和合成 4 对 GVA 特异性引物 QA1F/1R、 QA2F/2R、 QA3F/3R 和 QA4F/2R（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 nbsp;表 1 nbsp;GVA 实时荧光定量 RT-PCR 引物序列 nbsp;Table 1 nbsp;Sequences of GVA primers used in RT-qPCR detection 引物名称 nbsp;Primer name 目标基因 nbsp;Target gene 引物 /探针序列（ 5′– 3′） nbsp;Primer/Probe sequence 产物大小 /bp Product size 参考文献 nbsp;Reference QA1F/1R CP F CGACCGAAATATGTACCTGAATACTC 111 Osman amp; Rowhani， 2008 R TTGCTAGCTTTAGGACCTACTATATCTACCT nbsp;本研究 nbsp;This study QA2F/2R CP F CGACCGAACTATGTACCTGAATACTC 100 Osman amp; Rowhani， 2008 R AGGACCTACTATATCTACCTC nbsp;本研究 nbsp;This study QA3F/3R CP F CGACCGAAATATGTACCTGAACACTC 111 本研究 nbsp;This study R TTGCTAGCTTTAGGTCCTACTATATCTACCT nbsp;本研究 nbsp;This study QA4F/2R CP F CGACCGGAATATGTACCTGAATACTC 100 本研究 nbsp;This study R AGGACCTACTATATCTACCTC nbsp;本研究 nbsp;This study 取葡萄相应部位样品 50 mg， 采用吸附柱法 （ MacKenzie et al.， 1997） 进行总 RNA 提取， – 80 ℃保存备用。 采用两种方法反转录 （ 1） 普通反转录体系 25.0 L 将 5.0 L 总 RNA 与 1.0 L 0.1 g L-1随机引物和 9.0 L 水混合， 95 ℃变性 5 min 后立即置于冰中冷却 2 min；加入 5.0 L 5 MLV-RT buffer、 1.25 L 10 mmol L-1dNTPs、 0.5 L 200 U L-1M-MLV 和 3.25 L DEPC 水， 经 37 ℃ nbsp;10 min、42 ℃ nbsp;50 min、 70 ℃ nbsp;5 min 合成 cDNA； （ 2）去除基因组 DNA 反转录（ PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser， Takara） 取 5 gDNA Eraser buffer 2.0 μL， gDNA Eraser 1.0 μL，总 RNA 1.0 μL混匀， 42.0 ℃ nbsp;2 min； 加入以下混合液 PrimeScript RT Enzyme MixⅠ nbsp;1.0 μL， RT Primer Mix 1.0 μL，5 PrimeScript buffer 2 4.0 μL， RNase Free dH2O 4.0 μL； 37 ℃ nbsp;15 min， 85 ℃ nbsp;5 s，– 20 ℃保存备用。 nbsp;分别采用常规 RT-PCR 和 RT-qPCR 对 4 对引物进行扩增和筛选。以普通反转录合成的 cDNA为模板进行常规 RT-PCR 扩增，反应体系 25 L，反应条件 94 ℃ nbsp;5 min， 94 ℃ nbsp;30 s， 55 ℃ nbsp;20 s，72 ℃ nbsp;20 s， 35 个循环后， 72 ℃延伸 7 min。 PCR 扩增产物用 1琼脂糖凝胶电泳检测。相同模板同时用于 RT-qPCR 扩增，反应体系 25 μL，含 2 SYBR GreenⅠ qPCR Mix 12.5 μL， 10 μmol L-1正、反向引物各 0.5 μL， DNase/RNase Free dH2O 10.5 μL 和 cDNA 1 μL。反应条件 95 ℃预变性 3 min，Ren Fang， Dong Yafeng， Zhang Zunping， Fan Xudong， Hu Guojun. Development and application of a quantitative RT-PCR approach for detection of Grapevine virus A. 2246 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 11 2243– 2253. 95 ℃ nbsp;15 s， 60 ℃ 15 s， 72 ℃ nbsp;20 s， 40 个循环，在延伸步骤记录荧光信号。 RT-qPCR 扩增产物的熔解曲线分析温度范围为 60 95 ℃，其中每 5 s 增加温度 0.5 ℃，以鉴别引物二聚体和非特异性扩增。以扩增曲线 Cq 值（扩增产物荧光信号达到设定的阈值所经过的扩增循环次数） lt; 30 且熔解曲线为单一峰判定为阳性。以去除基因组 DNA 反转录合成的 cDNA 10 倍梯度稀释为模板进行RT-qPCR 扩增，构建标准曲线，每个梯度设置 3 个重复。 nbsp;PCR 扩增产物胶回收纯化后与 pTOPO-TA Vector 连接，并转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，挑取白色菌落进行菌液培养， PCR 鉴定筛选阳性克隆，将阳性克隆送北京诺赛基因组研究中心进行测序。采用 NCBI BLAST 方法比较所得序列与 GenBank 已登录分离物的同源性。 nbsp;1.3 nbsp;实时荧光定量 RT-PCR 反应体系优化及验证 nbsp;1.3.1 nbsp;反应体系优化 以去除基因组 DNA 反转录合成的 cDNA 1 10-1稀释作为模板，用不同退火温度（ 50.0、 50.8、52.4、 54.7、 57.6、 60.0、 61.3 和 62.0 ℃）进行 RT-qPCR 扩增，根据 Cq 值和扩增效果选择确定最佳退火温度；在最佳退火温度下，分别采用不同引物浓度（ 100、 200、 300、 400 和 500 nmol L-1）进行 RT-qPCR 扩增，根据 Cq 值和扩增效果选择确定最佳引物浓度。 nbsp;1.3.2 nbsp;特异性检测 从本实验室毒源保存圃采集分别感染了 GVA、葡萄病毒 B（ Grapevine virus B， GVB） 、葡萄病毒 E（ Grapevine virus E， GVE） 、 萄卷叶伴随病毒 GLRaV-1、 GLRaV-2、 GLRaV-3、 GLRaV-4、 GLRaV-7、葡萄斑点病毒（ Grapevine fleck virus， GFKV）和沙地葡萄茎痘病毒（ Grapevine rupestris stem pitting associated virus， GRSPaV）的葡萄样品，提取总 RNA，采用普通反转录合成 cDNA，用于 RT-qPCR特异性检测，以健康无毒植株样品作阴性对照。 nbsp;1.3.3 nbsp;灵敏度比较 以普通反转录合成的 cDNA 10 倍梯度稀释（ 1 10-9）为模板，进行常规 RT-PCR 和 RT-qPCR检测，比较检测灵敏度。 nbsp;1.3.4 nbsp;重复性试验 从同一 GVA 带毒植株同一枝条上分别取 3 份样品作为生物学重复，以相同方法同时提取总RNA，以去除基因组 DNA 反转录合成的 cDNA 1 10-2稀释为模板进行 RT-qPCR 扩增，每份样品 3次重复。分别计算每份样品组内重复以及 3 份样品组间重复的平均 Cq 值和 Cq 值标准差（ SD）和变异系数（ CV， 标准差 /平均 Cq 值 nbsp; 100） 。 nbsp;1.4 nbsp;田间样品检测 nbsp;1.4.1 nbsp;不同季节和不同部位葡萄样品检测 选择前期经 ELISA 或常规 RT-PCR 检测 GVA 为阳性的 10 株田间葡萄植株， 分别在 5 月 （春） 、7 月（夏）、 9 月（秋）采集植株上部嫩叶、上部嫩叶柄、下部老叶、下部老叶柄和卷须 5 个部位样品， 11 月（冬）采集休眠枝条，同时采集健康无毒植株样品作阴性对照。所有样品采用普通反转录合成 cDNA，用于常规 RT-PCR 和 RT-qPCR，比较检测效果。 nbsp;1.4.2 nbsp;大量田间葡萄样品检测 根据不同季节和不同部位葡萄样品的检测效果， 2016 2017 年采集大量田间葡萄样品相应部位，分别采用常规 RT-PCR 和 RT-qPCR 检测 GVA，比较检测效果。 nbsp;任 nbsp; 芳，董雅凤，张尊平，范旭东，胡国君 . 葡萄病毒 A 实时荧光定量 RT-PCR 检测技术的建立及应用 . 园艺学报， 2018， 45 11 2243– 2253. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;2247 2 nbsp;结果与分析 nbsp;2.1 nbsp;引物设计与筛选 nbsp;选择前期经 ELISA 或常规 RT-PCR 检测 GVA 为阳性的 5 个葡萄样品，以健康无毒的葡萄样品作为阴性对照，分别进行常规 RT-PCR 和 RT-qPCR 扩增。 4 对引物均在 5 个阳性样品中扩增到目的条带，阴性对照和水对照没有条带，但引物 QA3F/3R 有 1 个样品，引物 QA4F/2R 所有样品的目的条带较弱，引物 QA1F/1R 和 QA2F/2R 所有目的条带明亮且均为单一目的条带，扩增效果较好（图1）。 nbsp;4 对引物 5 个阳性样品 RT-qPCR 扩增曲线 Cq 值均小于 30， 熔解曲线均为单一峰， 判定为阳性。但引物 QA4F/2R 扩增阴性对照和水对照也有明显扩增曲线且熔解曲线有峰， 表明该引物有非特异性扩增，因此只选择引物 QA1F/1R、 QA2F/2R 和 QA3F/3R 进行标准曲线构建。 nbsp;3 对引物在 1 10-5稀释梯度范围内扩增曲线呈梯度分布， QA1F/1R 扩增效率（ E）为 112.5，决定系数（ R2） 0.990，扩增效率过高，标准曲线相关性略差； QA2F/2R 的扩增效率为 99.2， R2 0.999，均达到统计分析要求； QA3F/3R 的扩增效率为 103.7， R2 0.981，决定系数过低，标准曲线相关性较差。 nbsp; 综合 RT-PCR、 RT-qPCR 扩增以及标准曲线分析结果， 选择扩增效果和相关性均最好的 QA2F/2R作为 GVA RT-qPCR 检测引物。 nbsp;图 1 nbsp;GVA 引物 QA1F/1R 和 QA2F/2R RT-PCR 扩增结果比较 nbsp;M DL2000； W清水对照； 1 5 GVA 阳性的葡萄样品； CK-阴性对照。 nbsp;Fig. 1 nbsp;Comparison of RT-PCR amplification of GVA primers QA1F/1R and QA2F/2R nbsp;M DL2000； W Water control； nbsp;1– 5 GVA positive grapevine samples； CK- Negative control. 2.2 nbsp;克隆鉴定 nbsp;采用引物 QA2F/2R 对‘秋蜜’葡萄进行 RT-PCR 扩增，扩增产物经克隆测序共获得 6 个克隆序列，其中 5 个克隆序列完全一致，经 NCBI BLAST 比对，与 GenBank 已登录 GVA 序列相似性较高，达 94 99，表明扩增片段正确，为 GVA 目的片段（图 2）。 nbsp;Ren Fang， Dong Yafeng， Zhang Zunping， Fan Xudong， Hu Guojun. Development and application of a quantitative RT-PCR approach for detection of Grapevine virus A. 2248 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 11 2243– 2253. 图 2 nbsp;GVA 不同分离物核苷酸序列比较 nbsp;QM1 QM6本研究获得 GVA 序列；其余为 GenBank 已登录 GVA 序列。 nbsp;Fig. 2 nbsp;Sequence alignment of various GVA isolates QM1– QM6 GVA sequences obtained in this study； The others are GVA sequences logined in GenBank. 2.3 nbsp;实时荧光定量 RT-PCR 反应体系优化 nbsp;退火温度梯度 50.0 62.0 ℃的 RT-qPCR 扩增 Cq 值为 23.26 24.04，不同温度间 Cq 值差异较小，仅 0.78，不到一个循环周期，其中退火温度 60.0 ℃时 Cq 值最小，为 23.26。 54.7 ℃时相对荧光强度最强，其次为 60.0 ℃，熔解曲线为单一峰，因此选择 60.0 ℃作为最终退火温度。随着引物浓度升高， Cq 值逐渐减小，相对荧光强度逐渐增加，到达最高浓度（ 500 nmol L-1）时， Cq 值最低，为 22.19，但相对荧光强度不再增强，与 300 nmol L-1的相对荧光强度接近；在扩增阴性对照和水对照时， 100 和 200 nmol L-1引物浓度没有明显扩增曲线，熔解曲线也没有扩增峰，但 300、 400和 500 nmol L-1浓度时具有与阳性样品相近的杂峰。因此，为避免非特异扩增，选择扩增效果较好、相对较低的引物浓度 200 nmol L-1作为最终引物浓度。 nbsp;2.4 nbsp;实时荧光定量 RT-PCR 反应体系验证 nbsp;2.4.1 nbsp;特异性检测 用本研究建立的 RT-qPCR 方法检测分别感染了 GVA、 GVB、 GVE、 GFLV、 GLRaV-1、 GLRaV-2、任 nbsp; 芳，董雅凤，张尊平，范旭东，胡国君 . 葡萄病毒 A 实时荧光定量 RT-PCR 检测技术的建立及应用 . 园艺学报， 2018， 45 11 2243– 2253. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;2249 GLRaV-3、 GLRaV-4、 GLRaV-7、 GFKV 和 GRSPaV 等病毒的葡萄样品以及阴性对照葡萄样品，只有感染 GVA 样品有扩增曲线， Cq 值为 21.59，其余样品均没有明显扩增曲线，与阴性对照扩增结果相近（图 3） ，表明该 RT-qPCR 方法可特异性检测 GVA。 nbsp;图 3 nbsp;RT-qPCR 特异性检测 nbsp;Fig. 3 nbsp;The specificity test of RT-qPCR 2.4.2 nbsp;灵敏度比较 常规 RT-PCR 能检测到 1 10-2稀释梯度的 GVA 阳性葡萄样品 cDNA（图 4） 。 RT-qPCR 检测各稀释梯度模板扩增曲线呈梯度分布，检测 1 10-4稀释梯度时 Cq 值仍小于 30（图 5） ，为阳性，表明本研究中 RT-qPCR 检测灵敏度可达常规 RT-PCR 的 100 倍。 nbsp;图 4 nbsp;不同稀释梯度葡萄样品常规 RT-PCR 检测灵敏度 nbsp;Fig. 4 nbsp;Sensitivity of RT-PCR detection of grapevine samples at different diluted gradient 图 5 nbsp;不同稀释梯度葡萄样品 RT-qPCR 检测灵敏度 nbsp;Fig. 5 nbsp;Sensitivity of RT-qPCR detection of grapevine samples at different diluted gradient 2.4.3 nbsp;重复性试验 根据 RT-qPCR 扩增 Cq 值数据进行统计学分析，同一枝条上 3 份样品组内重复的变异系数最大Ren Fang， Dong Yafeng， Zhang Zunping， Fan Xudong， Hu Guojun. Development and application of a quantitative RT-PCR approach for detection of Grapevine virus A. 2250 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 11 2243– 2253. 为 0.31，组间重复变异系数为 2.91（表 2） ，表明该方法具有较好的重复性，检测稳定性好。 nbsp;表 2 nbsp;重复性试验结果 nbsp;Table 2 nbsp;The result of reproducibility 重复类型 nbsp;Repeat type 重复组编号 nbsp;Number of repeat group Cq 平均值 nbsp;Mean Cq value 标准差 nbsp;SD 变异系数 / CV 组内重复 Reproducibility test of intra-assay 1 26.99 0.05 0.19 2 25.71 0.08 0.31 3 25.63 0.04 0.16 组间重复 Reproducibility test of extra-assay 26.11 0.76 2.91 2.5 nbsp;田间样品检测 nbsp;2.5.1 nbsp;不同季节和不同部位葡萄样品检测 从 10 株感染 GVA 的葡萄上分别采集春、夏、秋 3 个季节的嫩叶、嫩叶柄、老叶、老叶柄和卷须 5 个部位样品以及冬季休眠枝条，共 160 个样品，分别采用常规 RT-PCR 和 RT-qPCR 进行 GVA检测。结果（表 3）表明， RT-qPCR 对各季节和部位样品的检出率普遍高于常规 RT-PCR。不同季节比较， RT-qPCR 冬季检出率 100，比常规 RT-PCR 高 10，秋季仅嫩叶检出率略低（ 50） ，其余 4 个部位检出率均达 100，比常规 RT-PCR 高 10 80，春夏季检出率 10 100，比常规RT-PCR 高 10 40。不同部位比较，枝条和老叶柄样品检测效果最好， RT-qPCR 检测春、夏、 nbsp;表 3 nbsp;不同季节和不同部位葡萄样品常规 RT-PCR 和 qRT-PCR 检测结果 nbsp;Table 3 nbsp;RT-PCR and qRT-PCR detection of samples collected from different seasons and different positions of grapevine 方法 nbsp; 品种 nbsp;Cultivar 春 Spring nbsp;夏 Summer nbsp;秋 Autumn 冬季枝条Dormant branch of winter A B C D E nbsp;A B C D E nbsp;A B C D E RT-PCR 巨玫瑰 Jumeigui - nbsp;- - - nbsp;- - nbsp; 红双味 -1 Hongshuangwei-1 - - nbsp;- nbsp; - - nbsp; 库特赛塔 Kutesaıta nbsp;- - nbsp; nbsp; 红茧 Hongjian - - - - - nbsp;- - - - - nbsp;- - - - - nbsp; 红双味 -2 Hongshuangwei-2 - - nbsp;- - - nbsp; - nbsp; 黑拉查基 Heılachajı - - - - - nbsp;- - - - - nbsp;- - - - - nbsp;- 大宝 Taiho - - nbsp;- - nbsp;- - nbsp; 乌兹别克玫瑰 nbsp;Muscat Uzbekistan nbsp;- - - - - - - - - 宁夏蛇龙珠 Ningxia nbsp;Cabernet Gernischet - - - - - - - - - 秋蜜 Qiumi - - nbsp;- - - nbsp; nbsp; 检出率 / Detection rate 10 50 70 80 40 nbsp;0 30 60 80 30 nbsp;40 70 60 80 20 nbsp;90 RT-qPCR 巨玫瑰 Jumeigui - nbsp;- - - nbsp; nbsp; 红双味 Hongshuangwei - nbsp;- nbsp;- nbsp; 库特赛塔 Kutesaıta - nbsp;- nbsp; nbsp; 红茧 Hongjian - - - nbsp;- - nbsp; nbsp; 红双味 Hongshuangwei - - nbsp;- - - nbsp;- nbsp; 黑拉查基 Heılachajı - - - nbsp;- - nbsp; nbsp; 大宝 Taiho - - - nbsp;- - - nbsp;- nbsp; 乌兹别克玫瑰 nbsp;Muscat Uzbekistan nbsp;- - 宁夏蛇龙珠 Ningxia nbsp;Cabernet Gernischet - - - - 秋蜜 Qiumi - - nbsp;- - - - nbsp;- nbsp; 检出率 / Detection rate 20 40 80 100 60 nbsp;10 70 80 100 40 nbsp;50 100 100 100 100 nbsp;100 注 A嫩叶； B嫩叶柄； C老叶； D老叶柄； E卷须。 nbsp;Note A Young leaf； B Young petiole； C Old leaf； D Old petiole； E Tendril. 任 nbsp; 芳，董雅凤，张尊平，范旭东，胡国君 . 葡萄病毒 A 实时荧光定量 RT-PCR 检测技术的建立及应用 . 园艺学报， 2018， 45 11 2243– 2253. nbsp; nbsp; nbsp;/p