中国水仙R2R3-MYB基因NtMYB5的克隆和功能研究.pdf

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中国水仙R2R3-MYB基因NtMYB5的克隆和功能研究.pdf

<p>园艺学报， 2018， 45 (7)： 1327 1337. Acta Horticulturae Sinica   doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0889； http： /www. ahs. ac. cn                                                 1327 收稿日期： 2018 03 20；修回日期： 2018 06 15 基金项目：福建农林大学科技创新基金项目（ KFA17352A）；福建省自然科学基金项目（ 2016J01109）；福建农林大学国际科技合作与交流项目（ Kxb16013A）  * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： lhzenghotmail.com， lhzengfafu.edu.cn）  中国水仙 R2R3-MYB 基因 NtMYB5 的克隆和功能研究  吴嘉诚，王桂青，Muhammad Anwar，曾黎辉*（福建农林大学园艺学院，福州  350002）  摘  要：为研究中国水仙（ Narcissus tazetta var. chinensis）中类黄酮代谢途径的调控网络，从其转录组中筛选出 1 条 R2R3-MYB 基因并从花瓣 cDNA 中克隆其编码区全长序列，命名为 NtMYB5。 NtMYB5开放阅读框为 681 bp，编码 226 个氨基酸。蛋白多重序列比对分析发现 NtMYB5 含有 R2 和 R3 结构域以及 1 个 pdLNLD/ELxiG/S氨基酸基序；系统进化树分析表明， NtMYB5 与花青素合成抑制因子亲缘关系最近；通过对 NtMYB5 在中国水仙中的表达检测发现，其表达量在花器官中较高，且随花开放逐渐上升；在烟草瞬时表达中， NtMYB5 显著抑制花青素合成促进因子 StMYB 的效果；转 NtMYB5 烟草花瓣颜色变浅， qPCR检测表明 NtMYB5 抑制类黄酮代谢途径大部分结构基因表达。 NtMYB5 为中国水仙中花青素合成抑制因子。  关键词：中国水仙； R2R3-MYB；花青素合成抑制因子；结构基因表达  中图分类号： S 682.2+1       文献标志码： A        文章编号： 0513-353X（ 2018） 07-1327-11 Cloning and Functional Analysis of R2R3-MYB Gene NtMYB5 in Narcissus tazetta var. chinensis WU Jiacheng， WANG Guiqing， Muhammad Anwar， and ZENG Lihui*（ College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China）  Abstract： A R2R3-MYB-like gene， named NtMYB5， was selected from transcriptome of Narcissus tazetta var. chinensis and was cloned in order to study its function in flavonoid metabolic pathway. Multiple alignments showed that NtMYB5 contained R2-domain and R3-domain. A pdLNLD/ELxiG/Smotif was also found near the C-terminal. Phylogenetic tree analysis indicated that NtMYB5 was closely related to negative regulators of anthocyain biosynthesis. The expression level of NtMYB5 was higher in perianth and corona，and increased during the process of flowering. The accumulation of anthocyanin activated by StMYB was suppressed by NtMYB5 in the transient expression of tobacco. Transgenic tobacco plants were obtained and the flower colour of transgenic plants became lighter. The results of quantitative real-time PCR indicated that most structural genes involved in the anthocyanin pathway were down-regulated by NtMYB5. This study suggests that NtMYB5 is a repressor of anthocyanin biosynthesis in Chinese narcissus. Keywords： Narcissus tazetta var. chinensis； R2R3-MYB； repressor gene of anthocyain biosynthesis；expression of structural genes Wu Jiacheng， Wang Guiqing， Muhammad Anwar， Zeng Lihui. Cloning and functional analysis of R2R3-MYB gene NtMYB5 in Narcissus tazetta var. chinensis. 1328                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1327 1337. 中国水仙（ Narcissus tazetta var. chinensis）花色以黄白色为主，其原因主要是缺乏花青素（曾黎辉  等， 2015）。花青素属多酚类化合物（朱丽和钱前， 2017），在自然状态下的花青素具有吸光性并表现出红色、紫色和蓝色等。花青素在植物体内主要以糖苷形式存在（ Allan et al.， 2008）。类黄酮合成代谢途径有原花青素途径、黄酮醇途径和花青素途径等分支；类黄酮普遍存在于植物当中，具有抗氧化，抗菌等作用（邢文和金晓玲， 2015）。  MYB 基因在植物体内广泛地参与各种植物次生代谢调控，包括花青素代谢途径。 MYB 转录因子是一类 DNA 结合蛋白，由高度保守的 MYB 结构域构成，每个结构域由一系列高度保守的氨基酸序列及间隔序列拼接而成。这些氨基酸可以使 MYB 蛋白折叠成螺旋螺旋转角螺旋（ helix-helix-turn-helix， HHTH）结构（ Zhao et al.， 2013）。 MYB 与 WD40 以及 bHLH 组成三元复合体结合到花青素苷合成酶等结构基因的启动子上，调控结构基因的表达，进而调控花青素苷合成和积累，其中 R2R3 类 MYB 蛋白在这一调控模式中起着重要作用（赵佳  等， 2015）。目前已知的促进花青素合成的 R2R3-MYB 因子有葡萄中的 VvMYB1（赵佳  等， 2015），苹果中的 MdMYB10a（ Lu et al.， 2017a），草莓中的 FaMYB10（ Lin-Wang et al.， 2014），甜樱桃中的 PaMYB10（ Jin et al.，2016）以及拟南芥中的 AtMYB75、 AtMYB90、 AtMYB113 等（史倩倩  等， 2015）。  MYB 家族蛋白中还包含另一类抑制花青素合成的 R2R3-MYB 因子，其在蛋白 C末端存在pdLNLD/ELxiG/S抑制基序，如金鱼草中的 AmMYB308（ Tamagnone et al.， 1998）和最早被发现的R2R3-MYB 抑制子，草莓中的 FaMYB1（ Aharoni et al.， 2001），其通过竞争占据 MBW 复合体中其他 MYB 蛋白的结合位点，以此抑制花青素合成相关基因的转录（ Paolocci et al.， 2011）。除此之外还有棉花中的 GhMYBL2（ Lu et al.， 2017b）以及拟南芥中的 AtMYB3、 AtMYB4、 AtMYB7、 AtMYB32等，它们可能通过与靶基因结合来抑制其转录（杨琳  等， 2014）。单子叶植物中花青素合成抑制因子的研究较少。玉米中分离得到的 ZmMYB31 和 ZmMYB42 可抑制木质素合成（ Agarwal et al.， 2016）。  本试验中从中国水仙中克隆 1 个 R2R3-MYB 转录因子，命名为 NtMYB5。序列比对发现 NtMYB5具有明显的 R2R3-MYB 结构域，进化树分析其功能可能为花青素合成抑制因子；通过荧光定量 PCR检测 NtMYB5 在水仙中的表达以及利用烟草瞬时表达和稳定转化进一步验证了该基因的功能。  1  材料与方法  1.1  材料与基因的克隆、测序  试验于 2015 年 9 月至 2017 年 11 月在福建农林大学园艺学院遗传育种实验室进行。  中国水仙品种为产自福建漳州的金盏银台。选用新鲜刚开放的水仙花瓣作为材料，液氮研磨，使用北京百泰克多糖多酚总 RNA 提取试剂盒提取水仙 RNA，使用 Thermo 公司的 Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 合成 cDNA。 cDNA 稀释后置于 20 保存备用。  前期从水仙转录组中获得 1 个 MYB 基因，根据其序列设计两个编码区两端特异性引物（表 1，引物 1），由铂尚生物公司合成。  以漳州水仙 cDNA 为模板，使用 Trans Taq DNA Polymerase High Fidelity 进行 PCR 扩增。设置梯度 PCR 反应程序，反应条件为 94 预变性 5 min， 94 变性 1 min， 60 55 退火 30 s， 72 延伸 1 min，反应 35 个循环， 72 延伸 7 min， 4 保存。 PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，将目的条带产物胶回收，用全式金 pEASY-T1 Simple Cloning Kit 进行连接，转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，经涂板、挑菌、菌液 PCR 验证后，将条带大小正确的样品送往铂尚生物公司进行测序。  吴嘉诚，王桂青， Muhammad Anwar，曾黎辉 . 中国水仙 R2R3-MYB 基因 NtMYB5 的克隆和功能研究 . 园艺学报， 2018， 45 (7)： 1327 1337.                                                                                   1329 1.2  实时定量 PCR 检测 NtMYB5 在水仙不同部位表达  分别提取水仙鳞茎盘、鳞片、叶片、花苞时期、始花期、和盛花期花瓣与副冠的 RNA。用 TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（ Perfect Real Time）逆转录，模板稀释 10 倍。使用Primer5 设计定量引物，反应体系参考 TaKaRa SYBR®Premix Ex TaqTM推荐体系。每个样品重复 3次，每个荧光定量 PCR 结束时获得相对应的循环数值，采用 2-Ct法处理试验数据，得出不同样品间该基因的表达差异。用 SPSS19.0 软件 Duncans 法进行定量结果的显著性差异分析。  1.3  植物表达载体构建  用 Hind 和 EcoR将载体上原有的目的条带切下，获得线性化载体。设计两条用于连接的引物（表 1，引物 2）。以 pEASY-T1 质粒为模板扩增获得目的条带，使用 TaKaRa 公司的 In-Fusion HD Cloning kits 将 NtMYB5 编码区序列连接到线性化的 pSAK277 载体上。反应体系为 1 L 5× In-Fusion HD Enzyme Premix、 1 L Linearized Vector、 0.5 L Purified PCR Fragment、 2.5 L dH2O， 50 孵育15 min。将构建好的表达载体通过电转化法转化至农杆菌 GV3101，培养 12 h 后挑取阳性克隆，菌液 PCR 验证条带大小，同时提质粒，用 Hind 和 EcoR双酶切验证。载体构建流程如图 1。  图 1  NtMYB5 表达载体构建流程图 Fig. 1  Construction flow chart of NtMYB5 expression vector Wu Jiacheng， Wang Guiqing， Muhammad Anwar， Zeng Lihui. Cloning and functional analysis of R2R3-MYB gene NtMYB5 in Narcissus tazetta var. chinensis. 1330                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1327 1337. 1.4  NtMYB5 烟草瞬时表达及定量分析  将普通烟草（ Nicotiana tabacum L.）种子播种于土中，待其生长出 4 片真叶后用于瞬时表达试验。将甘肃农业大学刘玉汇博士赠送的 pSAK277-StMYB（ StMYB 为从马铃薯中克隆得到的花青素合成激活因子）、 pSAK277-StbHLH 表达载体（ Liu et al.， 2016）以及对照质粒 pCAMBIA1301（含有GUS 基因）转入农杆菌 GV3101 中分别培养。挑取农杆菌菌落于 YEB 培养基中，培养 pSAK277- NtMYB5、 pSAK277-StMYB、 pSAK277-StbHLH 的培养基添加利福平 100 mg · L-1和盐酸壮观霉素 100 mg · L-1，摇菌至 OD600值为 0.8 1.0。将菌液分装于 50 mL 离心管中，并以 4 000 r · min-1离心 5 min。用悬浮缓冲液（ 10 mmol · L-1MES， 150 mol · L-1AS， 10 mmol · L-1MgCl2）重悬，静置 3 h。用注射器将单个基因（ StMYB、 NtMYB5）悬浮液或几个基因组合 NtMYB5 + StMYB、 NtMYB5 + StMYB + StbHLH、 StMYB + pCAMBIA1301 按 1 1 混合注射烟草叶片。重复 3 次。  分别提取烟草叶片注射 StMYB 和 NtMYB5 + StMYB 部位的 RNA，以没有注射的叶片部位的 RNA为对照，逆转录成 cDNA 后，通过实时荧光定量检测类黄酮代谢途径中 PA L （ phenylalanine ammonia-lyase）、 4CL（ 4-coumarate:CoA lig-ase）、 CHS（ chalcone synthase）、 CHI（ chalcone isomerase）、F3H（ flavonoid 3-hydrox-ylase）、 F3'H（ flavonoid 3-hydroxylase）、 ANS（ anthocyanidin sythase）、 ANR（ anthocyanidin reductase）、 UFGT（ Glucose-flavonoid 3-o-glucosyltransferase）、 LAR（ Leucoantho- cyanidin reductase）、 DFR（ dihydroflavonol 4-reductase）、 FLS（ flavonol synthase）等结构基因的表达情况。各结构基因定量 PCR 引物见表 1。  表 1  烟草荧光定量 PCR 所用引物  Table 1  Primers used for qPCR 名称  Name 上游引物序列（ 5 3）  Forward primer sequence 下游引物序列（ 5 3）  Reverse primer sequence 退火温度 /Annealing1 ATGGGCAGAACTCCTTGTTG CACTATCTAATTACATGTGGATTGG 55 2 TGGATCCAAAGAATTCATGGGCAGAACTCCTTGTTG TACTCTCGAGAAGCTTCACTATCTAATTACATGTGGATTGG 55 3 AGAAGACGGATTCGGTAGAAGATG TGGAGAAGAAGAACAAGGAAGACC 60 DFR AACCAACAGTCAGGGGAATG TTGGGCATCGAGAGTTCCAG 58 ANS TGGCGTTGAAGCTCATACTG GGAATTAGGCACACACTTTGC 59 4CL TCATTGACGAGGATGACGAG TGGGATGGTTGAGAAGAAGG 60 CHI GAAATCCTCCGATCCAGTGA CAACGTTGACAACATCAGGC 58 F3H ACAGGGTGAAGTGGTCCAAG CCTTGGTTAAGGCCTCCTTC 58 F3H TCCAAGAATACTGGCCCAAG CTCACAACTCTCGGATGCAA 58 FLS GTCCACAACGTTGCATGGTG CACAACTTCTCGCAGCCTC 59 LAR TCAAGGTCCTTTACGCCATC ACGAACCTGCTTCTCTTTGG 59 ANR CATTTGACTTTCCCAAACGC ATTGGGCTTTTGAGTTGTGC 60 ACTIN AATGATCGGAATGGAAGCTG TGGTACCACCACTGAGGACA 58 CHS GTACAACTAGTGGTGTAGACA CCAACTTCACGAAGGTGAC 58 PAL CAAGAACGGTGGTGCTCTTC CCAGAACCAACTGCAGTACC 58 UFGT CAATGTTTGGGATGGTGTCA TTCCTCCTCTGCCTCTTTCA 58 1.5  NtMYB5 烟草稳定转化及定量分析  在无菌操作台内，将生长 50 d 的普通烟草组培苗切成 2 cm × 2 cm 大小的切片，置于预培养基（固体 MS 培养基） 3 d；将 OD600值为 0.5 已转化 NtMYB5 的农杆菌菌液用于侵染烟草叶切片 8 min，后放回预培养基上，避光培养 3 d。用 300 mg · L-1羧苄青霉素的无菌水清洗烟草切片，置于选择培养基（固体 MS 培养基， 100 mg · L-1卡那霉素， 300 mg · L-1羧苄青霉素， 1 mg · L-16-BA， 0.1 mg · L-1NAA）。将选择培养基中长至 2 cm 左右的小芽转入生根培养基中（固体 MS 培养基加 0.5 mg · L-1NAA）；烟草苗高度达到组培瓶盖时进行炼苗后移入盆中。  待烟草开花后，观察烟草花的花色变化，提取烟草花瓣 RNA，进行定量分析。  吴嘉诚，王桂青， Muhammad Anwar，曾黎辉 . 中国水仙 R2R3-MYB 基因 NtMYB5 的克隆和功能研究 . 园艺学报， 2018， 45 (7)： 1327 1337.                                                                                   1331 2  结果与分析  2.1  NtMYB5 基因克隆与序列分析  克隆出的 NtMYB5 基因 ORF 全长为 681 bp，编码 226 个氨基酸。通过 NCBI 上的保守结构域分析发现该条序列存在明显的 R2 和 R3 结构域，属于 R2R3-MYB 基因，同时 NtMYB5 还存在pdLNLD/ELxiG/S抑制基序（图 2）。  图 2  NtMYB5 与同源蛋白的多重序列比对 At：拟南芥； Am：金鱼草； Ph：矮牵牛； Vv：葡萄； Fa：草莓。  Fig. 2  Multiple alignment of the NtMYB5 with other MYB proteins At： Arabidopsis thaliana； Am： Antirrhinum majus； Ph： Petunia hybrida； Vv： Vitis vinifera； Fa： Fragaria × ananassa. 通过与其它 MYB 因子构建进化树分析，花青素合成激活因子（ anthocyanin activator）聚为一类；花青素合成抑制因子分成 3 类，其中 CPC/TRY-like 抑制因子与其它基因关系较远，另外两类为MYB4-like 和 FaMYB1-like。 NtMYB5 与 VvMYB4 等花青素合成抑制因子聚在一起，属于抑制因子中MYB4-like 分支（图 3）。  Wu Jiacheng， Wang Guiqing， Muhammad Anwar， Zeng Lihui. Cloning and functional analysis of R2R3-MYB gene NtMYB5 in Narcissus tazetta var. chinensis. 1332                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1327 1337. 图 3  NtMYB5 与调控花青素 MYB 因子的系统进化树分析  Fig. 3  Phylogenetic tree of NtMYB5 and other anthocyanin related MYB transcrpit factors 2.2  NtMYB5 组织特异性表达  如图 4 所示， NtMYB5 在水仙叶片、鳞茎盘和鳞片中表达量都较低，在花瓣和副冠中表达量较高。  图 4  NtMYB5 在水仙中的表达  1：花苞期； 2：始花期； 3：盛花期。不同小写字母表示差异显著（ P < 0.05）。  Fig. 4  Expression analysis of NtMYB5 gene in Chinese narcissus 1： Budding stage； 2： Early flowering stage； 3： Full-bloom stage.  Different small letters indicate significant difference（ P < 0.05） . 吴嘉诚，王桂青， Muhammad Anwar，曾黎辉 . 中国水仙 R2R3-MYB 基因 NtMYB5 的克隆和功能研究 . 园艺学报， 2018， 45 (7)： 1327 1337.                                                                                   1333 在花瓣中，随着花的开放， NtMYB5 表达量呈明显上升趋势，在盛花期的表达量是花苞期的近 25 倍；在副冠中 NtMYB5 的表达量从花苞期开始就维持一个较高水平，在始花期有所下降，盛花期又开始升高。  2.3  NtMYB5 烟草瞬时表达结果  如图 5 所示，烟草叶片单独注射花青素激活因子 StMYB 的部位 5 d 后明显呈现深红色，单独注射 NtMYB5 部位无反应，呈现绿色； NtMYB + StMYB 混合注射部位呈现浅红色；注射 NtMYB5 + StMYB + StbHLH 的 3 个基因的混合物的部分呈现红色；对照带有 GUS 基因的 pCAMBIA1301 + StMYB 混合注射没有抑制 StMYB 的作用，与单独注射 StMYB 的差别不大；注射悬浮缓冲液部位无反应，呈现绿色。  上述结果说明 NtMYB5 对花青素合成有抑制作用。  图 5  NtMYB5 烟草瞬时表达 Fig. 5  Transient expression analysis of NtMYB5 in tobacco 2.4  烟草瞬时表达的定量检测  如图 6 所示，烟草中类黄酮生物合成途径中的结构基因 PA L、 4CL、 CHS、 CHI、 F3H、 F3H、DFR、 LAR、 ANS、 ANR 和 UFGT 的表达量，与野生型（ Wild type）相比，可见都被 StMYB 诱导显著上调，而 FLS 的表达量下调；在 StMYB + NtMYB5 混合注射的叶片中， PA L、 CHS、 CHI、 F3H、F3H、 ANS、 UFGT 的表达量相比于单独注射 StMYB 出现显著下降，而 FLS 上升， ANR 和 4CL 变化不明显。  NtMYB5 对大部分类黄酮代谢途径中的结构基因表达有明显的抑制作用。  Wu Jiacheng， Wang Guiqing， Muhammad Anwar， Zeng Lihui. Cloning and functional analysis of R2R3-MYB gene NtMYB5 in Narcissus tazetta var. chinensis. 1334                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1327 1337. 图 6  烟草叶片中类黄酮代谢途径结构基因瞬时表达的定量检测  不同小写字母表示差异显著（ P < 0.05）。  Fig. 6  Transient expression of flavonoid metabolic pathway structural genes in tabacco leaf Different small letters indicate significant difference（ P < 0.05） . 2.5  NtMYB5 转基因烟草表型及基因表达定量分析  将带有 35S 启动子的 pSAK277-NtMYB5 转化烟草，经 PCR 检测后获得 9 株转基因植株。 NtMYB5转基因烟草的花色比对照烟草变浅（图 7）。  图 7  NtMYB5 转基因（ L1、 L2、 L3）与野生型（ WT）烟草花瓣颜色的变化 Fig. 7  Changes in the color of NtMYB5 transgenic（ L1， L2， L3） and wild type（ WT） tobacco petals 吴嘉诚，王桂青， Muhammad Anwar，曾黎辉 . 中国水仙 R2R3-MYB 基因 NtMYB5 的克隆和功能研究 . 园艺学报， 2018， 45 (7)： 1327 1337.                                                                                   1335 通过实时荧光定量 PCR 检测发现转基因烟草花瓣中类黄酮途径结构基因 PA L、 4CL、 CHS、 CHI、FLS、 DFR、 LAR、 ANS、 ANR、 UFGT 被显著下调； F3H、 F3H 的表达量变化不显著（图 8）。  图 8  NtMYB5 转基因烟草花瓣中类黄酮代谢途径结构基因的表达  不同小写字母表示差异显著（ P < 0.05）。  Fig. 8  Expression analysis of flavonoid biosynthesis structural genes in petals of transgenic tobacco plants Different small letters indicate significant difference（ P < 0.05） . 3  讨论  依据 C末端的不同，拟南芥 MYB 基因家族系统进化树分类可将其分成 22 个亚群（ Stracke et al.， 2001）。 NtMYB5 同拟南芥的第 4 家族中的 AtMYB3、 AtMYB4、 AtMYB7、 AtMYB32 有较高的亲缘性（ Jin et al.， 2000），属于 MYB4-like 类的 R2R3-MYB 基因。这类 MYB 基因为花青素合成抑制因子，在其蛋白 C末端都有 1 个抑制区域 pdLNLD/ELxiG/S，该蛋白可能通过直接与靶基因结合而抑制靶基因的转录（杨琳  等， 2014）。从序列分析中可以看到 NtMYB5 的 C末端也有抑制区域，表明 NtMYB5 的功能可能与 MYB4-like 因子类似。  NtMYB5 在水仙中的表达分析表明，其主要在花瓣与副冠中表达，可能与花瓣及副冠中的花青素等类黄酮代谢有关。 NtMYB5 表达水平在水仙花器官不同发育阶段呈现明显的变化，随着花开放，NtMYB5 的表达呈现上升趋势。有报道，水仙中的 CHS、 CHI 和 F3H 在开花的 3 个时期均有表达，在花苞期表达最高，且随着花开放表达量下降（杨琳  等， 2014）。 NtMYB5 表达量在未开放的水仙花瓣中表达量最低，随着花开放，表达量上升，可能与 NtCHS、 NtCHI 和 NtF3H 的表达量降低有关。  Wu Jiacheng， Wang Guiqing， Muhammad Anwar， Zeng Lihui. Cloning and functional analysis of R2R3-MYB gene NtMYB5 in Narcissus tazetta var. chinensis. 1336                                                                    Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (7)： 1327 1337. 瞬时表达技术是一种获得目的基因短暂高水平表达的技术，比稳定转化的实验周期短，但因未将外源基因整合到宿主植物染色体中，不能产生转基因后代（赵文婷  等， 2013）。通过瞬时表达试验可以直观地看到花青素激活因子 StMYB 诱导烟草叶片生成的花青素被 NtMYB5 抑制。 qPCR 结果进一步证明 NtMYB5 抑制 StMYB 的机制是通过抑制 PA L、 CHS、 CHI、 F3H、 F3H、 DFR、 LAR、 ANS和 UFGT 等花青素合成结构基因的表达。 FLS 是黄酮醇分支的结构基因，表达被 StMYB 抑制， NtMYB5加入后， FLS 表达量有所上调。 Davies 等（ 2003）通过反义 RNA 技术抑制 FLS 基因表达，导致矮牵牛花中花青素合成量上调；类黄酮代谢途径 FLS 和 DFR 有着相同的催化反应底物，因此二者存在竞争关系（ Lepiniec et al.， 2006）。由此推测可能是 NtMYB5 对花青素合成相关基因表达的抑制一定程度上减少了对黄酮醇合成的竞争，从而上调了 FLS 的表达量。  R2R3-MYB、 bHLH 和 WD40 蛋白是参与调节花青素合成的主要转录因子，大多数的植物花青素的合成是通过 MYB-bHLH 复合物或三者相互作用形成 MYB-bHLH-WD40 复合物（即 MBW 复合物）进行调节的（ Gonzalez et al.， 2008）。在 NtMYB5 + StMYB 混合液中添加 StbHLH，再注射烟草叶片并没有明显减少 NtMYB5 的抑制作用，说明 NtMYB5 抑制花青素合成结构基因的表达不是因为与 StMYB 争夺 bHLH 因子，而是可能直接与靶基因结合进行抑制，与 AtMYB4 类因子的作用机制相似。  NtMYB5 转基因烟草花瓣颜色变浅，进一步验证了 NtMYB5 抑制花青素合成的功能。类黄酮代谢途径结构基因的定量分析结果显示， NtMYB5 抑制了 PA L、 CHS、 CHI、 DFR、 UFGT 和 ANS 这 6个基因的表达，使得转基因烟草花瓣中花青素积累被抑制。与瞬时表达有所不同的是，烟草花瓣中FLS 和 ANR 基因的表达也受到抑制，说明 NtMYB5 有可能在花中同时抑制了黄酮醇和原花青素的积累，这个推论还有待进一步验证。  References Agarwal T， Grotewold E， Doseff A I， Gray J. 2016. 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