桃ABA8''-羟化酶基因PpeCYP707As在拟南芥中过表达的功能分析.pdf

p园艺学报， 2018， 45 2 239– 249. Acta Horticulturae Sinica nbsp; doi 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0350； http //www. ahs. ac. cn nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 239 收稿日期 2017– 08– 02； 修回日期 2018– 01– 22 基金项目 国家自然科学基金项目（ 31372050） ；山东农业大学科技创新团队设施园艺优势团队项目（ SYL2017YSTD07） nbsp;* 通信作者 nbsp;Author for correspondence（ E-mail ； ； Tel 0538-8249659） nbsp;桃 ABA 8’–羟化酶基因 PpeCYP707As在拟南芥中过表达的功能分析 nbsp;高真真，徐功勋，王东岭，刘 nbsp;利，陈修德，李 nbsp;玲，付喜玲*，高东升*（山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，山东泰安 nbsp;271018） nbsp;摘 nbsp;要 以 8 年生‘中油 4 号’油桃为试材，对休眠期的枝条进行 ABA 和 GA 处理发现， ABA 延迟芽体萌动， GA 促进萌芽和提前开花，在桃芽萌发中 ABA 和 GA 起拮抗作用。利用转基因技术在拟南芥中过表达桃 ABA 分解代谢关键酶 ABA 8’–羟化酶基因 PpeCYP707A1、 PpeCYP707A2 和 PpeCYP707A3，获得纯合株系， RT-PCR 结果表明，目的基因在过表达株系中的表达量分别达到对照的 23.86 倍、 7.37 倍、3.23 倍；过表达株系生长缓慢，抽薹、开花延迟，其中过表达 PPECYP707A1 株系生长最慢，开花最晚；过表达株系种子萌发和幼苗生长对 ABA 不敏感，受伤害程度小； 10 ℃低温处理试验证明，过表达株系相对生长速率高于野生型，推测低温条件下，过表达 CYP707As 正调控拟南芥的生长发育。 nbsp;关键词 桃；拟南芥； CYP707A； ABA；过表达；功能分析 nbsp;中图分类号 S 662.1 nbsp; nbsp; nbsp; 文献标志码 A nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;文章编号 0513-353X（ 2018） 02-0239-11 Functional Analysis of Peach PpeCYP707As Gene in Arabidopsis thaliana Overexpressing Plants GAO Zhenzhen， XU Gongxun， WANG Dongling， LIU Li， CHEN Xiude， LI Ling， FU Xiling*， and GAO Dongsheng*（ College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University， State Key Laboratory of Crop Biology， Tai’an， Shandong 271018， China） nbsp;Abstract We used eight-year-old‘ Zhongyoutao 4’ nectarine as the material and then treated dormant peach branches with hormone. The results showed that ABA delayed bud germination， GA promoted germination and precocious flowering， ABA and GA had the adverse effect on the germination of peach buds. We obtained at least 3 homozygous lines with overexpression of ABA 8’-hydroxylase gene which were key enzyme in ABA catabolism in peach such as PpeCYP707A1， PpeCYP707A2， PpeCYP707A3 in Arabidopsis thaliana by transgenic technique. The results of RT-PCR showed that the expression of target gene in overexpression lines reached 23.86 times， 7.37 times and 3.23 times， respectively. The Arabidopsis of overexpression lines showed slow growth， delayed bolting even flowering， which PPECYP707A1 slowest growth and flowering the latest. Relative conductivity and active oxygen analysis showed that seed germination and seedling growth of transgenic Arabidopsis were not sensitive to ABA and the damage Gao Zhenzhen， Xu Gongxun， Wang Dongling， Liu Li， Chen Xiude， Li Ling， Fu Xiling， Gao Dongsheng. Functional analysis of peach PpeCYP707As gene in Arabidopsis thaliana overexpressing plants. 240 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 2 239– 249. degree was lower compared to wild type. Low temperature（ 10 ℃） treatment results showed that the relative growth rate of transgenic Arabidopsis with overexpressing PpeCYP707As was higher than that of wild type. It is speculated that the overexpression of CYP707As gene may positively regulate the growth and development of Arabidopsis under low temperature condition. Keywords peach； Arabidopsis thaliana； CYP707A； ABA； overexpression； functional analysis 休眠是果树在应对外界不良环境时产生的一种自我保护机制，表现为分生组织可见的暂时停长（ Rohde amp; Bhalerao， 2007） 。自然休眠由休眠结构（比如芽、种子）内部的生理因素控制，只有经历低温满足其需冷量之后芽才能萌发，进而开花结果，所以自然休眠是设施果树熟期调控的限制因子，研究调控休眠维持及休眠解除的因素及其分子机制意义重大。 nbsp;影响自然休眠的环境因素主要有光周期、低温和激素等。脱落酸（ ABA）是植物重要的逆境激素，一方面参与植物对低温、干旱、高盐等胁迫的应答（ Leng et al.， 2014） ，同时参与调控叶片脱落、胚胎发育、种子的休眠与萌发等过程（ Lechat et al.， 2012） 。近年来的研究证明， ABA 在休眠（芽休眠和种子休眠） 及休眠解除中发挥重要作用， ABA 能够诱导芽休眠并抑制萌发。 在油桃 （ Wang et al.， 2016）花芽休眠诱导期 ABA 含量逐渐升高，随着休眠解除 ABA 含量逐渐降低。杨树（ Rohde et al.， 2002）顶芽休眠解除过程中 ABA 含量也逐渐降低。也有证据表明赤霉素（ GA）可以解除种子休眠促进萌发（ Huang et al.， 2016） ，并在樱桃（ Duan et al.， 2004）芽休眠解除上得到证实。研究发现在唐菖蒲球茎（ Wu et al.， 2015）休眠解除过程中 ABA 含量逐渐降低， GA 含量逐渐升高，ABA/GA 逐渐降低。 nbsp;ABA 合成、分解的动态变化共同调控植物内源 ABA 水平，在芽休眠进程中 ABA 含量的变化反映了 ABA 合成与分解的关系，在芽解除休眠的过程中 ABA 的分解代谢起主导作用（ Zheng et al.，2015） 。在不同物种中， ABA 分解的主要途径是转变为无活性的红花菜豆酸（ Phaseic acid， PA）和二氢红花菜豆酸（ Dihydro-phaseic acid， DPA） ，这一过程是解除休眠的关键（ Saito et al.， 2004） 。研究证实 ABA 8’–羟化酶催化 ABA 转变为 PA（ Nambara amp; Marion-Poll， 2005） ，而 AtCYP707A 是拟南芥 ABA 8’–羟化酶的编码基因。生化分析表明，在体外 CYP707A 蛋白能将 ABA 转化成 PA（ Nambara amp; Marion-Poll， 2005） 。拟南芥 AtCYP707A 家族基因有 4 个成员，其中 AtCYP707A2 被认为是在种子吸胀时分解 ABA 的关键基因，在吸胀 6 h 后该基因转录水平开始增加， ABA 含量降低，相应地 PA 含量升高（ Tetsuo et al.， 2004） 。这一结论在大麦（ Millar et al.， 2006）中得到验证。在拟南芥 AtCYP707A2 突变体中，其发芽率（ 10）明显低于野生型（ 70） ， ABA 含量高达野生型的6 倍，种子若不经低温处理，需要更长的时间来打破休眠（ Millar et al.， 2006） 。 nbsp;目前已在水稻 （ Seung amp; Dongsu， 2006） 、 蚕豆 （ Yang amp; Zeevaart， 2006） 、 马铃薯 （ Destefanobeltrn et al.， 2006） 、大麦（ Millar et al.， 2006）中克隆到 CYP707A 的同源基因。对于 CYP707A 的研究主要在逆境胁迫、植物脱水、再水合作用、种子休眠上（ Benech-Arnold et al.， 2013） 。但 CYP707A 参与花芽休眠调控的设想还未得到证实。在桃中，利用 SSH 技术筛选的调控芽休眠的基因也参与种子休眠，揭示芽休眠与种子休眠可能存在共同的调控机制（ Leida et al.， 2012） 。 CYP707A 在休眠中的作用机制尚不明确。 nbsp;本实验室前期对桃 CYP707As 基因进行了生物信息学分析、组织特异性表达、激素诱导、原核表达诱导蛋白等一系列研究，发现桃 CYP707A2 与拟南芥 CYP707A2 亲缘关系最近， CYP707As 基因在成熟组织中表达量比幼嫩组织高，且 CYP707A2 能被 ABA、 GA 诱导上调（ Wang et al.， 2016） 。高真真，徐功勋，王东岭，刘 nbsp; 利，陈修德，李 nbsp; 玲，付喜玲，高东升 . 桃 ABA 8’–羟化酶基因 PpeCYP707As 在拟南芥中过表达的功能分析 . 园艺学报， 2018， 45 2 239– 249. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 241 本研究中以 ABA 介导芽休眠与种子休眠为切入点，从桃中克隆了 3 个 CYP707As 基因，转化拟南芥进行表达分析及表型鉴定， 并研究 ABA 对种子和幼苗、 低温对幼苗等的影响， 旨在揭示桃 CYP707A家族基因在休眠中与 ABA 的关系，为进一步研究其在休眠解除中的作用奠定基础。 nbsp;1 nbsp;材料与方法 nbsp;1.1 nbsp;桃树材料及处理 试验材料为栽种于山东农业大学南校区试验基地的 8 年生油桃（ Prunus persica var. nectariana）‘中油 4 号’生长健壮、长势一致的 9 株树，选取生长良好的一年生枝条 90 个，分为 3 组，即 3个处理，每个处理 30 枝，分为 3 个重复， 1 个重复 10 枝。分别用 3 种处理溶液喷施枝条表面 （ 1）对照，清水 nbsp; 0.5 Trtion 100； （ 2） ABA 处理， 1 mmol L-1 ABA 0.5 Trtion 100； （ 3） GA 处理，1 mmol L-1GA3 0.5 Trtion 100。于 2016 年 12 月 10 日起每 7 d 喷 1 次，共 3 次。选择傍晚进行，喷施后套黑色塑料袋。 ABA、 GA 购自索莱宝公司。 nbsp;拟南芥幼苗在光照培养箱中培养，昼 22 /℃夜 20 ℃，光照 12 h。 nbsp;ABA 处理拟南芥种子和幼苗将拟南芥种子消毒后种在分别含有 3 和 5 μmol L-1ABA 的 MS培养基上，观察种子的萌发情况。选取生长 14 d 的拟南芥幼苗用 1 mmol L-1 ABA 0.5 Trtion 100溶液喷施灌溉，用黑色塑料袋罩住防止 ABA 见光分解，处理 3 d 后，选取野生型及转基因拟南芥叶片，称取 3 份，每份 1 g，用于相对电导率测定，选取野生型及转基因拟南芥叶片各 10 片，用于活性氧分子测定。 nbsp;低温处理拟南芥幼苗 选取生长 28 d 的野生型和转基因拟南芥后代幼苗， 在光照培养箱中培养，温度为 10 ℃（模拟进入休眠诱导的秋季温度）处理 10 d，用于相对生长速率测定。 nbsp; 1.2 nbsp;PpeCYP707As 转化拟南芥 nbsp; nbsp;转基因所用材料为本实验室保存的哥伦比亚野生型（ Columbia 型）拟南芥种子。利用 Thermo公司的 Phusion 高保真酶对 PpeCYP707A1、 PpeCYP707A2 和 PpeCYP707A3 这 3 个基因进行 PCR 扩增（引物见表 1） 。利用 TaKaRa 公司的 PMD-19simple 载体进行连接反应，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞。 选择测序正确的克隆， 提取细菌中的质粒 DNA， 根据预先设计的酶切位点 （ PpeCYP707A1BamHⅠ和 SalⅠ； PpeCYP707A2 XbaⅠ和 SacⅠ； PpeCYP707A3 BamHⅠ和 SacⅠ）分别双酶切pMD19-simple 及 PBI121 载体序列。分离酶切片段，回收目的基因和载体，利用 T4连接酶连接目的基因与 PBI121 载体， 成功构建 PBI121-PpeCYP707A1、 PBI121-PpeCYP707A2、 PBI121-PpeCYP707A3 表达载体。 nbsp;将分别含有 3 个基因正义表达载体的农杆菌菌液用花序侵染法侵染野生型拟南芥，将收获的种子用 nbsp;50 mg L-1的卡那霉素（ Kan）进行筛选。选择那些能够正常生长且没有黄化的幼苗，利用 PCR及 RT-PCR 检测筛选阳性植株。并选择在拟南芥中目的基因表达量高的植株作为候选植株 T1 代， T2代种子开始出现分离。选择 T3 代不出现分离的种子即为纯合株系，依次命名为 35S PPECYP707A1、35S PPECYP707A2、 35S PPECYP707A3。最终获得至少 nbsp;3 株纯合株系，并观察表型，记录结果。 nbsp;1.3 nbsp;总 RNA 的提取和 RT-PCR 将拟南芥种子消毒后播种在 MS 培养基上，选取生长 14 d 的拟南芥幼苗，整株取样后立即放入Gao Zhenzhen， Xu Gongxun， Wang Dongling， Liu Li， Chen Xiude， Li Ling， Fu Xiling， Gao Dongsheng. Functional analysis of peach PpeCYP707As gene in Arabidopsis thaliana overexpressing plants. 242 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 2 239– 249. 液氮冷冻，用于 RT-PCR 检测。拟南芥幼苗整株取样，称取 3 g，分为 3 份，每份 1 g 作为 1 次生物学重复。液氮研磨后采用 TIANGEN（天根）试剂盒提取总 RNA，用反转录试剂盒 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（ Perfect Real Time， TaKaRa）进行反转录获得 cDNA，采用软件DNAMAN 设计荧光定量特异性引物（表 1） ，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用 SYBRPremix Ex TaqTM（ Tli RNaseH Plμs）试剂盒（宝生物）进行荧光定量 PCR 反应。反应体系为 SYBRPremix Ex Taq（ 2） 12.5 μL，正 、反 向 引 物 各 1 μL， cDNA 1 μL，加去离子水至 25 μL。试验设计 3 次技术性重复。荧光定量 PCR 反应条件为 95 ℃预变性 30 s， 95 ℃变性 5 s， 60 ℃退火30 s， 35 40 次循环，反应结束后得到荧光值变化曲线和熔解曲线，最终采用 2-ΔΔCt法进行数据分析。 nbsp; 表 1 nbsp;克隆基因和 RT-PCR 所用引物 nbsp;Table 1 nbsp;Primers used for quantitative RT-PCR analysis and cloning genes 桃基因名称 nbsp;Nectarine gene name 引物序列（ 5′– 3′） nbsp;Primer sequence 用途 nbsp; Use CYP707A1 F CACGGATCCATGGAAATCAGCAGTATTTTATACTCCATGC 克隆基因 Clone R GCCGTCGACTTATGTTTTAGGAGATAATCTGATGGGC nbsp;CYP707A2 F CGCGGATCCATGCAACTTTTCTGCTCATCATTACTAACAC nbsp;GTCGAGCTCTCAACTCACAATCTTGCTCCTTGGG nbsp;CYP707A3 F CGCGCTCTAGAATGGAGATTGTTTCTAGTTTGATACACATATTGC nbsp;R CACGAGCTCTTATTCTTCCCAAAATCTGACTGGTAATCC nbsp;CYP707A1 F ACAGACCAACAGATTGCTGACAAC 荧光定量 qRT-PCR CCTTCATCATCACCCTCCTCTTCTT CYP707A2 F TCGGCAACAATAGGGACTTTGAAATG R CCATCACTCTTCCTTCTCTTCGCTAT CYP707A3 F TCACCAAGGAGACTACCACAATAGC CAAGGAAGCCAACATCAAAGGAGAAC actin F GTTATTCTTCATCGGCGTCTTCG R CTTCACCATTCCAGTTCCATTGTC 1.4 nbsp;相对电导率的测定 nbsp;将拟南芥叶片用自来水冲洗后再用蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸净表面水分，放入装有 10 mL 去离子水的试管中，真空抽气 20 min 直至叶片完全沉入水底，室温放置 1 h 并摇匀，用电导仪测定浸提液电导率（ R1） ，然后沸水浴加热 10 min，冷却至室温后摇匀，再次测定浸提液电导率（ R2） ，相对电导率（ ） R1/R2，试验设置 3 个重复，取平均值。 nbsp;1.5 nbsp;活性氧分子的测定 nbsp;将拟南芥叶片用蒸馏水冲洗干净，置于试管中，加 10 mL 氮蓝四唑（ NBT）染色溶液，用铝箔纸包裹试管，在室温下保持过夜。从试管中排出染色溶液，去除叶绿素以正确观察染色。将叶片浸没在无水乙醇中并在沸水浴中加热 10 min，用 60甘油饱和的纸巾转移叶片， NBT 与内源性活性氧分子反应显现蓝色，观察染色叶片并拍照。 nbsp;高真真，徐功勋，王东岭，刘 nbsp; 利，陈修德，李 nbsp; 玲，付喜玲，高东升 . 桃 ABA 8’–羟化酶基因 PpeCYP707As 在拟南芥中过表达的功能分析 . 园艺学报， 2018， 45 2 239– 249. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 243 1.6 nbsp;相对生长速率的测定 nbsp;选取拟南芥幼苗进行低温 （ 10 ℃） 处理， 处理前测量从地表到植株生长点的高度作为株高 （ W1） 。处理 10 d 后再次测量株高（ W2） ，计算相对生长速率（ RGR） 。设置 3 个重复，取平均值。 RGR （ lnW1– lnW2） /（ t1– t2） ，式中， t1、 t2分别为两次株高测定的时间， W1、 W2分别为 t1和 t2时的株高， ln 为自然对数。 nbsp;2 nbsp;结果与分析 nbsp;2.1 nbsp;ABA 和 GA 处理的桃芽萌发情况 nbsp;用 ABA 和 GA 处理休眠期桃枝条。从图 1 中可以看出，处理 10 d 后对照（清水）芽体开始微微萌动， ABA 处理的芽体最小，无萌动迹象，而 GA 处理的芽体最饱满，已形成小花苞；处理 15 d后对照形成花苞且花蕊（雌蕊和雄蕊）伸出花瓣，而此时 ABA 处理的芽体才刚刚萌动形成小花苞，GA 处理的已全部开花。由此可知， GA 处理能够明显促进桃芽萌发，而 ABA 则明显抑制桃芽萌发，在桃芽萌发上 GA 与 ABA 起到拮抗作用。 nbsp;图 1 nbsp;ABA 和 GA 处理对桃芽萌发的影响 nbsp;Fig. 1 nbsp;Effects of ABA and GA treatments on peach for bud germination 2.2 nbsp;转基因拟南芥的 RT-PCR 鉴定 nbsp;本试验中共获得 4 个 35S PPECYP707A1、 7 个 35S PPECYP707A2、 6 个 35S PPECYP707A3拟南芥过量表达株系。从每个转基因后代群体均挑选 3 个株系，作为 3 个重复，并进行后续的功能分析。以转基因 T3 代纯合植株为材料，提取 RNA 进行 RT-PCR，在 3 个目的基因的过表达株系中PpeCYP707A1、 PpeCYP707A2、 PpeCYP707A3 的表达量分别达到了对照的 23.86 倍、 7.37 倍、 3.23倍（图 2） ，表明 3 个目的基因都得到了有效的过表达。 nbsp;Gao Zhenzhen， Xu Gongxun， Wang Dongling， Liu Li， Chen Xiude， Li Ling， Fu Xiling， Gao Dongsheng. Functional analysis of peach PpeCYP707As gene in Arabidopsis thaliana overexpressing plants. 244 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 2 239– 249. 图 2 nbsp;PpeCYP707As 在野生型（ WT）和 35S PPECYP707A1、 35S PPECYP707A2、 35S PPECYP707A3 株系中的表达分析 nbsp;Fig. 2 nbsp;Expression analysis of PpeCYP707As in wild type（ WT） and 35S PPECYP707A1， nbsp;35S PPECYP707A2， 35S PPECYP707A3 lines 2.3 nbsp;转基因拟南芥的表型 nbsp; nbsp;选择 T3 代不出现分离比的种子播种，观察幼苗表型。从图 3 可以明显看出，与野生型相比，转基因拟南芥 35S PPECYP707A1、 35S PPECYP707A2、 35S PPECYP707A3 生长缓慢，长势较弱，其中 35S PPECYP707A1 生长最弱，且叶片椭圆，叶片数 9 12，而 28 d 的野生型生长旺盛，叶片数 18 21，叶面积明显较大，叶片狭长。野生型 32 d 时主茎上已长出白色花苞，而转基因株系均未抽薹。 nbsp;图 3 nbsp;野生型和转基因拟南芥后代的表型 nbsp;Fig. 3 nbsp;The phenotype of wild type and transgenic Arabidopsis nbsp;2.4 nbsp;转基因拟南芥种子对 ABA 的敏感性 nbsp;将转基因拟南芥 T3 代种子分别种在含有 3 μmol L-1ABA 和 5 μmol L-1ABA 的 MS Kan 培养基上，野生型种在含有 3 μmol L-1ABA 和 5 μmol L-1ABA 的 MS 培养基上，检测拟南芥种子对 ABA 的敏感性。在 3 μmol L-1ABA 处理（图 4， a）中，野生型没有萌发，而转基因株系高真真，徐功勋，王东岭，刘 nbsp; 利，陈修德，李 nbsp; 玲，付喜玲，高东升 . 桃 ABA 8’–羟化酶基因 PpeCYP707As 在拟南芥中过表达的功能分析 . 园艺学报， 2018， 45 2 239– 249. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 245 35S PPECYP707A1、 35S PPECYP707A2、 35S PPECYP707A3 的萌发率均在 85以上，说明其对 3 μmol L-1ABA 不敏感而野生型对 3 μmol L-1ABA 极其敏感；在 5 μmol L-1ABA 处理（图 4，b）中，野生型依然没有萌发，而转基因株系分别萌发了 5 粒、 3 粒、 7 粒，萌发率降低至 10以下，说明其对高浓度 ABA 敏感。 nbsp;图 4 nbsp;野生型和转基因拟南芥种子对 ABA 的敏感性 nbsp;Fig. 4 nbsp;Sensitivity to ABA of wild type and transgenic Arabidopsis seeds 2.5 nbsp;ABA 处理下转基因拟南芥的电导率、活性氧分子测定 nbsp;拟南芥幼苗经 1 mmol L-1 ABA 处理 3 d 后（图 5） ，野生型植株茎基部的叶片已经变黄萎蔫，而 3 个转基因株系植株叶片全部呈现绿色，没有受到 1 mmol L-1ABA 的伤害。 nbsp;图 5 nbsp;1 mmol L-1ABA 处理 3 d 的野生型和 35S PPECYP707A1、 35S PPECYP707A2、 35S PPECYP707A3 植株和叶片生长情况 nbsp;Fig. 5 nbsp;The wild type and 35S PPECYP707A1， 35S PPECYP707A2， 35S PPECYP707A3 plant and leaf growth nbsp;under 1 mmol L-1 ABA treatment for 3 days Gao Zhenzhen， Xu Gongxun， Wang Dongling， Liu Li， Chen Xiude， Li Ling， Fu Xiling， Gao Dongsheng. Functional analysis of peach PpeCYP707As gene in Arabidopsis thaliana overexpressing plants. 246 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp;Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 2 239– 249. 表 2 nbsp;在 1 mmol L-1ABA 处理下野生型和转基因 nbsp;拟南芥的电导率 nbsp;Table 2 nbsp;Conductivity of wild type and transgenic Arabidopsis thaliana under 1 mmol L-1 ABA treatment 材料 Material 相对电导率 Relative conductivity 野生型 nbsp;Wild type 0.76 a 35S PPECYP707A1 0.40 bc 35S PPECYP707A2 0.32 c 35S PPECYP707A3 0.49 b 选取 1 mmol L-1 ABA 处理 3 d 的野生型及转基因拟南芥叶片，测定其相对电导率如表2 所示，与野生型（ 0.76 ）相比， 35S PPECYP707A1 （ 0.40 ） 、 35SPPECYP707A2（ 0.32） 、 35SPPECYP707A3（ 0.49）的相对电导率均明显降低，且差异显著，表明转基因植株叶片受伤害程度明显减轻，能抵抗 1 mmol L-1 ABA 的伤害。 nbsp;选取经 1 mmol L-1 ABA 处理 3 d 的野生型及转基因拟南芥叶片， 用 nbsp;NBT 溶液染色后检测植株内活性氧分子积累情况如图 6 所示，有活性氧积累的部位已被染成蓝色，证明在 ABA 处理下叶片细胞受到伤害，而染色深浅和面积大小反映了受害程度的大小。野生型的叶柄、叶缘及叶面均有被染成蓝色的部分，而转基因植株 35SPPECYP707A1、 35SPPECYP707A2、 35SPPECYP707A3 只有少量的叶片叶柄或叶缘有斑点状蓝色痕迹，与叶片的相对电导率的数据结果一致，均能反映转基因植株的叶片受伤害程度比野生型小。 nbsp;图 6 nbsp;1 mmol L-1ABA 处理下野生型和转基因拟南芥经 NBT 溶液染色情况 nbsp;Fig. 6 nbsp;The staining result of wild type and transgenic Arabidopsis thaliana by NBT solution under 1 mmol L-1 ABA treatment 2.6 nbsp;低温处理对转基因拟南芥的影响 nbsp;拟南芥幼苗经低温处理 10 d 后的表型如图 7 所示，转基因株系 35SPPECYP707A1、 35S 图 7 nbsp;低温（ 10 ℃）处理下野生型和转基因拟南芥的表型 nbsp;Fig. 7 nbsp;The phenotype of wild type and transgenic Arabidopsis at low temperature（ 10 ℃） nbsp;高真真，徐功勋，王东岭，刘 nbsp; 利，陈修德，李 nbsp; 玲，付喜玲，高东升 . 桃 ABA 8’–羟化酶基因 PpeCYP707As 在拟南芥中过表达的功能分析 . 园艺学报， 2018， 45 2 239– 249. nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 247 表 3 nbsp;低温（ 10 ℃）处理下野生型和转基因拟南芥的 nbsp;相对生长速率 nbsp;Table 3 nbsp;Relative growth rate of wide type and transgenic Arabidopsis at low temperature（ 10 ℃） nbsp;材料 nbsp; Material 相对生长速率 nbsp;Relative growth rate 野生型 nbsp;Wild type 0.009 35SPPECYP707A1 0.020 35SPPECYP707A2 0.030 35SPPECYP707A3 0.021 PPECYP707A2 、 35SPPECYP707A3 的长势均不如野生型旺盛，株高均低于野生型。35SPPECYP707A1 株高最低；就节间距而言，低温处理后野生型、 35SPPECYP707A2 、35SPPECYP707A3 的节间距与未经低温处理的野生型相比明显缩短（由于 35SPPECYP707A1 节间距缩短，株高仅为 1 cm 左右，所以未进行比较） ，同时这也是生长缓慢的直接表现。其中野生型低温处理前后的节间距变化差异最明显；与植株长势、株高等结果完全不同的是， 35S PPECYP707A1 （ 0.020） 、 35SPPECYP707A2（ 0.030） 、 35SPPECYP707A3（ 0.021）的相对生长速率均比野生型（ 0.009 ）高，其中35SPPECYP707A2 为野生型的 3.3 倍之多（表3） ，表明在低温条件下， 3 个转基因植株株系均比野生型生长速度快。 nbsp; 3 nbsp;讨论 nbsp;在番茄中过表达 SlCYP707A1 后植株长势较弱、矮小，叶表面积小，叶片卷曲，且 ABA 含量降低（ Nitsch et al.， 2009） 。本研究中拟南芥过表达株系 35SPPECYP707A1、 35SPPECYP707A2、35SPPECYP707A3 均表现植株矮小，叶表面积小，并且抽薹、开花延迟，其中 35SPPECYP707A2开花（ 56 d）时间比野生型（ 32 d）植株晚 24 d。 nbsp;研究证实拟南芥中 CYP707A1 主要在种子成熟中期至成熟期表达，是种子发育期控制 ABA 分解的主效基因， CYP707A2 在种子晚熟期至发芽期间表达，干燥种子得以解除休眠，而 CYP707A1和 CYP707A3 均参与了种子萌发后芽的生长（ Masanori et al.， 2006） 。另一研究结果显示，在拟南芥中过表达大豆 GmCYP707A1 可降低对 ABA 的敏感性，起到 ABA 8’–羟化酶的功能（ Zheng et al.，2012） 。而本研究中对种子萌发试验的结果表明，在室温下经过后熟（即休眠解除）的拟南芥种子，在 3 和 5 μmol L-1ABA 处理下，野生型种子萌发率均表现为 0，对 ABA 表现极其敏感，证明 ABA能有效维持种子休眠，而过表达株系 35SPPECYP707A1、 35SPPECYP707A2、 35SPPECYP707A3的种子在 3 μmol L-1ABA 处理下萌芽率均超过 85，而 在 5 μmol L-1ABA 处理下萌发率显著降低到 10 以下，表明 3 μmol L-1ABA 对过表达株系种子几乎无影响，而 5 μmol L-1ABA 才能降低萌发率，使种子对其高度敏感。总之，与野生型种子相比，过表达株系种子能有效抵抗低浓度 ABA处理，提高种子萌发率，说明在拟南芥种子中过表达桃 PPECYP707As/p