生防菌解淀粉芽胞杆菌Ht-q6可湿性粉剂的研制及对番茄病害的田间防效.pdf

34(5)738-745 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2018 年 10 月 收稿日期： 2018-02-26 基金项目：山西农业大学博士科研启动基金（ 2013YJ10） ；山西省重点研发项目（ 201703D221010-2） 作者简介： 李磊，硕士研究生， E-mails： qstlilei126.com； *通信作者，博士，副教授， E-mails： sxndwmq1973163.com。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.05.0013 生防菌解淀粉芽胞杆菌 Ht-q6可湿性粉剂的研制及 对番茄病害的田间防效 李 磊，许 敏，王美琴*（山西农业大学农学院，太谷 030801） 摘要： 为了研制一种高效、安全及无污染的生防菌剂，本文以核桃内生生防菌解淀粉芽胞杆菌 Ht-q6 为材料，通过室内筛选和田间试验，确定了生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂的最佳助剂配方及对番茄叶霉病和灰霉病的田间防效。结果表明，可湿性粉剂的最佳配方为载体硅藻土（ 85%） 、润湿剂十二烷基苯磺酸钠（ 6%） 、分散剂木质素磺酸钠（ 6%） 、稳定剂 KH2PO4（ 1.0%） 、紫外保护剂抗坏血酸（ 1.0%） 。该粉剂芽胞含量 2.28× 1010cfu/g、杂菌率 0.5%、 pH 5.8、细度 93.5%、干燥减量 2.5%、润湿时间 45 s、悬浮率 85.6%，符合国家标准值，质量合格。同时采用喷雾法测定了不同浓度菌剂对大棚中番茄病害的防治效果，结果表明，稀释 200× （制剂用量 225 g/667m2）的可湿性粉剂对番茄灰霉病和叶霉病的防效分别为 77.1%和 74.3%，与对照药剂 75%百菌清的防效相比，叶霉病防效差异不显著而灰霉病防效差异显著。该菌剂的研制在生产实践中为番茄病害提供一条生防途径。 关 键 词： 解淀粉芽胞杆菌；可湿性粉剂；番茄病害；田间防效 中图分类号： S476 文献标识码： A 文章编号： 1005-9261(2018)05-0738-08 Preparation of Biocontrol Agent Bacillus amyloliquefaciens Ht-q6 Wettable Powder and the Field Control against Tomato Diseases LI Lei, XU Min, WANG Meiqin*(College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China) Abstract: In order to develop biocontrol agent with high efficiency, safety and non-pollution, with the endophytic strain Ht-q6 from walnut as material, the optimal formula of biocontrol bacterium Ht-q6 wettable powder (WP) were screened and its field efficacy on tomato leaf mold and gray mold were determined. The results showed that the best formulation of WP was diatomite (85%) as filler, DBS (6%) as wetting agent, sodium lignosulphonate (6%) as dispersing agent, KH2PO4(1.0%) as stabilizer and acide ascorbique (1.0%) as UV protective. The spore content of the powder was 2.28× 1010cfu/g, the rate of bacteria was 0.5%, the pH value was 5.8, the fineness was 93.5%, the drying loss was 2.5%, wetting time was 45 s, and the suspension rate was 85.6%, which was in line with national standards and quality standards. Field trials with different concentrations of fungicides against tomato gray mold and leaf mold diseases demonstrated that the control effects of WP with the dilution of 200× (dosage: 225 g/667 m2) on both diseases were remarkable, with the efficacies of 77.1% and 74.3%, respectively. The control effect of WP with the dilution of 200× on leaf mold is not significantly different from the control, while that on gray mold is significantly different. The preparation of this bacterium is an effective way to prevent tomato disease in practice. Key words: Bacillus amyloliquefaciens; wettable powder; tomato diseases; field efficiency 第 5 期 李磊等：生防菌解淀粉芽胞杆菌 Ht-q6 可湿性粉剂的研制及对番茄病害的田间防效 739 近年来设施番茄种植给人们的生活带来了极大的便利，但小环境气候特点非常有利于病害的发生，造成了果实品质和产量的下降，其中叶霉病和灰霉病是番茄上常见的 2 种病害，给番茄生产造成极大的影响1。使用化学药剂是目前主要的防治手段，防效显著，但造成的 3R（抗药性、再猖獗和农药残留）问题已经引起人们的高度重视，所以开发研制新型生物菌剂来替换或减少化学农药的使用成为农药界研究的热点2。植物内生菌以其与环境相容性好、对人畜和天敌安全、容易在植物体内定殖等优点成为较好的生防菌资源。其中芽胞杆菌属、假单孢菌属、固氮菌属、土壤杆菌属及链霉菌属等是目前国内外研究具有良好防效的生防菌类别3。尤其芽胞杆菌，因其多内生芽胞、抗逆性强、繁殖快、易定殖、产生一些细菌素或毒素等特性，可用来防治多种植物病害4,5，其中枯草芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、多粘类芽胞杆菌等研究报道的较多6,7，主要集中在室内菌株的筛选、抑菌机理、抑菌物质的提取、分离鉴定以及田间小区试验等8-12。国内外已经登记并商品化用于生产中的芽胞杆菌菌剂相对较少，美国有 3 株枯草芽胞杆菌和 1 株解淀粉芽胞杆菌，商品名分别为 Subtilex、 Kodiak、 Serenade 和 Bio Yield，应用到生产中效果较好13,14。国内对于芽胞杆菌也有广泛的研究，现已登记的微生物杀菌剂剂型种类繁多，有 80 亿芽胞 /mL 地衣芽胞杆菌水剂（商品名为爽又多）， 10 亿芽胞 /g 枯草芽胞杆菌可湿性粉剂（商品名为百抗）， 0.1 亿芽胞 /g 多粘类芽胞杆菌细粒剂（商品名为康地蕾得）等15。可湿性粉剂相比于粉剂颗粒，直径更细、更易湿润、有效成分含量也较高；与水分散粒剂和缓释剂相比，又具有低成本优势；较传统颗粒剂相比，可防治土传和叶部病害，范围广。在已登记微生物杀菌剂剂型中，可湿性粉剂占最大比例 82%， 6%水剂次之，可见可湿性粉剂的优势地位16。 本试验应用的菌株 Ht-q6 是一株具有广谱抑菌活性的核桃内生细菌， 经鉴定为解淀粉芽胞杆菌 Bacillus amyloliquefaciens，该菌株的专利号： 201410469787.6； 16S rDNA 序列 NCBI 登陆号： KM015259.1。已对其在植物体内的定殖、抑菌效果及代谢产物活性成分等进行了研究，证实了该菌株具有生防潜能17。本文通过对载体及助剂的悬浮率、湿润时间、芽胞含量等多因子的测定，确定了最佳配方，研制出了生防菌Ht-q6 可湿性粉剂，并测定了对番茄叶霉病与灰霉病的田间防效。 1 材料与方法 1.1 供试材料 供试菌株 Ht-q6 由山西农业大学植物病理实验室提供。固体 NA 培养基：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨 5 g，琼脂粉 15 g，葡萄糖 10 g，蒸馏水 1000 mL， pH 7.0 7.2；优化的发酵培养液： 1%玉米粉， 0.5%牛肉浸膏，0.02% MgSO4·7H2O， 0.01% KCl， 0.2% NaH2PO4·2H2O， 0.4% Na2HPO4·2H2O， 100 mL 蒸馏水， pH 6.0 7.0。6 种载体：白炭黑，硅藻土，轻质碳酸钙，膨润土，高岭土，滑石粉。 6 种分散剂：三聚磷酸钠，木质素磺酸钠，羧甲基纤维素钠（ CMC-Na），聚乙二醇（ PEG8000），达润 DY6，达润 D06。 4 种润湿剂：十二烷基苯磺酸钠（ DBS），吐温- 80，达润 D317，达润 DCM-82。 4 种稳定剂：碳酸钙，磷酸钾，磷酸二氢钾，羧甲基纤维素钠（ CMC-Na）。 4 种保护剂：抗坏血酸，羧甲基纤维素（ CMC），糊精，荧光增白剂（ FWA）。仪器设备： SW-CJ-2FD 超净工作台（上海博迅实业有限公司）、 GI54DWS 高压灭菌锅（厦门致微仪器有限公司）、 ZWYR-211C 振荡培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司）、 GR-240 热空气消毒箱（上海博迅实业有限公司）、 CF-180C 不锈钢粉碎机（广州晨雕机械设备有限公司）。 1.2 生防菌 Ht-q6 发酵液的制备 用接种环挑取保存的生防菌 Ht-q6，通过平板划线将其接种于 NA 平板上进行活化培养， 24 h 后将活化菌株接种到优化的培养液中，培养液以 75 mL/250 mL 装瓶，接种量 1%，置于摇床上， 30 、 180 r/min振荡培养 48 h，得到的悬浊液即为发酵液。 1.3 生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂质量检测方法 可湿性粉剂的各项指标按照中华人民共和国国家标准进行检测，其中湿润时间依据国家标准GB/T5451-2001（ 6）进行；悬浮率测定步骤依据国家标准 GB/T14825-2006（ 4.4）进行；细度测定步骤依据国家标准 GB/T16150-1995（ 2.2）进行； pH 测定步骤依据国家标准 GB/T1601-1993（ 6）进行；稳定性测定步骤依据国家标准 GB/T19136-2003（ 2.2）进行；干燥减量测定步骤依据国家标准 GB/T 30361-2013 进行。 740 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 杂菌率的测定：取待测样品 10 g，加入 90 mL 无菌水的锥形瓶中摇匀溶解，即成 101稀释液；再用移液枪吸取 1 mL 稀释液加入装有 9 mL 无菌水的试管中摇匀，即成 102稀释液；以此方法连续稀释，制成104、 105、 106、 107系列梯度稀释液，每平板取 100 L 均匀涂布，每个梯度 3 次重复，以无菌水为对照，于 25 恒温培养箱中培养 48 h，挑取平板上目标菌菌落在 30 300 倍的稀释梯度进行计数，同时计算目标菌以外杂菌数，杂菌率（ %）（杂菌数 /解淀粉芽胞杆菌 Ht-q6 菌数）× 100。 可湿性粉剂的芽胞存活率的测定依据中华人民共和国农业部标准 NY/T2293.1-2012（ 5.3），采用平板菌落计数法，具体计算方法参考刘盼西等18的方法。 载体最大吸附量测定：分别称取 6 份 100 g 载体，发酵液边倒边用玻璃棒搅拌，直至搅拌均匀、不凝结成块，放置不会析出液体，记录发酵液用量 v，并计算最大吸附量 H，即 H= v/0.1（ kg/L）。 1.4 生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂载体及助剂的筛选 1.4.1 可湿性粉剂载体筛选及母粉制备 参考 1.3 湿润时间、悬浮率、芽胞含量测定方法，综合考虑筛选出悬浮率高、湿润时间短、芽胞含量高、吸附量大、价格便宜的载体；并将发酵液与最佳载体充分混合，烘干粉碎，制成母粉。 1.4.2 助剂的筛选 参考 1.3 测定各种湿润剂、分散剂及稳定剂（ 2%）添加到母粉中后湿润时间、悬浮率及对芽胞含量的影响。其中湿润时间越短，悬浮率越高的助剂对可湿性粉剂的性能较好，同时考虑对芽胞含量的影响，进行数据分析，并设不加助剂的母粉为对照，综合考虑筛选出最佳润湿剂、分散剂和稳定剂。 紫外保护剂：将抗坏血酸，羧甲基纤维素，糊精，荧光增白剂以 10%添加量与母粉混合、烘干、粉碎，在 254 nm 紫外灯下距离 40 cm 处照射 6、 12、 24 h 后平板涂布法计算芽胞存活率，并设不加保护剂的母粉为对照，同时考虑添加保护剂后对粉剂悬浮率及湿润时间的影响，综合考虑筛选出最佳保护剂。 1.4.3 润湿剂和分散剂配比及用量筛选 将筛选出的最佳润湿剂和分散剂分别按 1:9、 2:8、 3:7、 4:6、 5:5、6:4、 7:3、 8:2、 9:1 的比例，以 10%的添加量与母粉混合、烘干和粉碎，筛选出润湿时间短、悬浮率高的配比。将筛选出的最佳润湿剂和分散剂以最佳配比混合后，再按照 2%、 4%、 6%、 8%、 10%、 12%、 14%、16%的添加量与母粉混合、烘干和粉碎，筛选出润湿时间短、悬浮率高的用量。 1.5 生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂安全性评价 对番茄植株的安全性测定：以培育 50 d 的健康番茄植株（品种为鑫农 1 号）为材料，挑选植株上部新叶与茎秆，用 75%酒精表面消毒后用无菌水冲洗干净，自然晾干后，用灭菌的接种针针刺扎破番茄叶片与茎秆表皮，用移液枪取生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂 10 倍稀释液 20 L 滴加在伤口处进行接种，置于室温下培育 3 d。根部用无菌水冲洗干净后用灭菌刀片划长 2 mm 伤口，后浸于 10 倍制剂稀释液中 1 min，再移栽至无菌土的育苗钵中常规管理 7 d。每个处理 5 株番茄植株， 3 次重复，以无菌水为对照。分别观察植株茎、叶与根是否出现萎蔫、变色、腐烂、坏死和畸形等症状。 1.6 生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂毒理学测定 依据国家安全标准 GB/T 15670-1995，以初成年大鼠和家兔为材料，测试了生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂急性经口毒性、急性经皮毒性及急性皮肤刺激，检测机构：山西农业大学动物科学院。 1.7 生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂对番茄病害的田间防效试验 试验地选择为山西晋中太谷县水秀乡里修村农户的番茄大棚，番茄品种为鑫农 1 号，定植于 2016 年 12月 16 日。试验采用田间随机区组设计，每小区面积为 10 m2，番茄 32 株。试验开始于 2017 年 3 月 5 日，正处在番茄幼果期，病害发生初期。试验共设 5 个处理，其中菌株 Ht-q6 可湿性粉剂稀释 200 倍（制剂用量 225 g/667 m2兑水量 45 L）、 400 倍（制剂用量 112.5 g/667 m2兑水量 45 L）、 600 倍（制剂用量 75 g/667 m2兑水量 45 L）为试验组， 75%百菌清可湿性粉剂（制剂用量 150 g/667 m2 兑水量 45 L） 500 倍稀释液为对照药剂，清水处理为空白对照，每处理 4 次重复。使用电动喷雾器（海燕 3WBD-16，背负式电动喷雾器，工作压力为 1.0 1.2 MPa，喷孔直径 1.3 mm），每 7 d 施药 1 次，共施药 3 次，最后 1 次施药 7 d 后调查，即 3 月 26 日。调查方法参考农药田间药效试验准则中“杀菌剂防治蔬菜灰霉病和番茄叶霉病药效试验准则”有关内容19，每小区采用五点取样，每点调查 3 株，叶霉病每株调查上、中、下 3 个侧枝全部叶片，灰霉病调查每株全部果实。并根据病害 分级标准记录发病情况。以小区为整体计算病情指数，按照 第 5 期 李磊等：生防菌解淀粉芽胞杆菌 Ht-q6 可湿性粉剂的研制及对番茄病害的田间防效 741 下列公式计算病情指数和防治效果。 番茄灰霉病果的分级标准， 0 级：无病斑； 1 级：残留花瓣发病或柱头发病； 3 级：萼片腐烂或柱头发病蔓延至果脐部； 5 级：果脐部有浸润斑无霉层； 7 级：果脐部有浸润斑有霉层但未扩张到其他部位； 9 级：果脐部有浸润斑有霉层并已扩张到其他部位。 番茄叶霉病病叶的分级标准， 0 级：无病斑； 1 级：病斑面积占整个叶面积的 5%以下； 3 级：病斑面积占整个叶面积的 6% 10%； 5 级：病斑面积占整个叶面积的 11% 20%； 7 级：病斑面积占整个叶面积的 21% 50%； 9 级：病斑面积占整个叶面积的 51%以上。 病情指数（各级病叶 /果数×该病级值） /（调查总叶 /果数×最高病级值）× 100。防治效果（ %）（对照病情指数处理病情指数）/对照病情指数× 100。 2 结果与分析 2.1 生防菌 Ht-q6 发酵液的制备 发酵培养液以 75 mL/250 mL 装瓶，接种量 1%，置于摇床上， 30 、 180 r/min 速度振荡 48 h，菌体与芽胞总含量达到最大，为 3.57× 1010 cfu/mL，芽胞占比 56.58%，随后，菌体与芽胞含量开始趋于稳定（图 1）。 00.51.01.52.02.53.03.54.024 30 36 42 48 54 60 66 720102030405060708090100菌体与芽胞总量 The amount of bacteria and spores芽胞含量 Spores content芽胞百分比 Percentage of spores发酵时间 Fermentation time (h)数量Amount (×1010cfu/mL)百分比Percentage(%)图 1 不同发酵时间生防菌 Ht-q6 菌体与芽胞的含量 Fig. 1 The content of Ht-q6 bacteria and spores of biocontrol bacteria during different fermentation time 2.2 生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂载体及助剂的筛选结果 2.2.1 载体的筛选 测试的 6 种载体，白炭黑和硅藻土的悬浮率较好而且差异不显著，分别为 53.4%和52.7%，硅藻土和高岭土的润湿时间分别为 72 和 75 s， 14 d 后芽胞存活率差异不显著，白炭黑的吸附能力最大，其次为硅藻土（表 1）。因硅藻土与其他载体相比在悬浮率和润湿时间上与其他处理差异显著，所以选择硅藻土为最佳载体。 2.2.2 润湿剂和分散剂的筛选 在母粉中加入润湿剂后，十二烷基苯磺酸钠的悬浮率、润湿时间和芽胞存活率分别为 65.6%、 28 s 和 89.5%，与其他处理相比差异显著（表 2）。加入分散剂后，悬浮率相对于母粉对照来说都有提高，其中木质素磺酸钠的悬浮率与润湿时间与其他处理相比差异显著，对芽胞存活率基本无影响（表 3）。综合考虑选择十二烷基苯磺酸钠为最佳润湿剂，木质素磺酸钠为最佳分散剂。 2.2.3 润湿剂和分散剂最佳比例和用量的筛选 润湿剂和分散剂的不同配比对可湿性粉剂的悬浮率和润湿时间都有一定影响，随着十二烷基苯磺酸钠浓度的增加，悬浮率逐渐升高；随着分散剂木质素磺酸钠浓度的降低，润湿时间逐渐提高，在 5:5 时悬浮率和润湿时间分别为 76.9%和 41 s，综合考虑确定十二烷基苯磺酸钠和木质素磺酸钠的最佳配比为 5:5。助剂用量为润湿剂和分散剂共占制剂的百分含量。随助剂含量的增加悬浮率也在逐渐增加， 润湿时间不断延长， 在 12%时悬浮率和润湿时间分别为 79%和 40 s， 在 14%时悬浮率和润湿时间分别为 79.2%和 44 s，虽然悬浮率有小幅度的提高但是润湿时间有大幅度的延长，综 742 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 表 1 载体对生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂的影响 Table 1 Effects of carrier on Ht-q6 WP 载体 Carrier 悬浮率 Suspension rate (%) 润湿时间 Wetting time (s) 吸附能力Absorption capacity (kg/L)14 d 芽胞存活率 Spore survival rate at 14 d (%) 白炭黑 Silica 53.4± 4.1 a 117± 1.5 a 3.91 a 85.8 a 滑石粉 Talcum power 47.5± 2.7 b 78± 3.1 d 1.19 c 86.3 a 高岭土 Kaolin 45.1± 2.7 b c 75± 2.2 e 1.17 c 87.1 a 轻质碳酸钙 Light calcium carbonate 42.3± 3.5 c 95± 3.0 b 1.05 d 84.1 a 膨润土 Bentonite 29.5± 3.8 d 89± 2.3 c 1.34 b 86.5 a 硅藻土 Diatomite 52.7± 1.8 a 72± 3.6 f 1.35 b 87.6 a 注：表中数据为平均值± SD，同列数据后不同小写字母表示经 Duncan 氏新复极差法检验在 0.05 水平间差异显著，下同。 Note: Data were means± SD; Different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 lever by Duncans multiple range test .The same below. 表 2 润湿剂对生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂的影响 Table 2 Effects of wetting agent on Ht-q6 WP 润湿剂 Wetting agent 悬浮率 Suspension rate (%) 润湿时间 Wetting time (s) 14 d 芽胞存活率 Spore survival rate at 14 d (%) 十二烷基苯磺酸钠 DBS 65.6± 1.8 a 28± 1.9 d 89.5 a 吐温- 80 Tween-80 60.8± 1.8 bc 30± 2.1 d 88.3 a 达润 D317 Da run D317 62.4± 1.9 b 33± 3.1 c 89.4 a 达润 DCM-82 Da run DCM-82 59.6± 1.6 c 45± 2.2 b 76.5 b 对照 CK 53.6± 1.3 d 70± 1.6 a 88.8 a 表 3 分散剂对生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂的影响 Table 3 Effects of dispersant agent on Ht-q6 WP 分散剂 Dispersant agent 悬浮率 Suspension rate (%) 润湿时间 Wetting time (s) 14 d 芽胞存活率 Spore survival rate at 14 d (%)三聚磷酸钠 Sodium tripolyphosphate 65.8± 1.7 b 55± 3.2 c 88.3 a 木质素磺酸钠 Sodium lignosulphonate 73.9± 1.3 a 32± 1.9 f 87.2 a 羧甲基纤维素钠 Sodium carboxymethyl cellulose 58.7± 0.9 d 75± 3.7 a 87.5 a 聚乙二醇 PEG8000 52.8± 1.3 e 45± 2.9 d 84.2 a 达润 DY6 Da run DY6 62.5± 1.7 c 63± 2.5 b 88.1 a 达润 D06 Da run D06 52.8± 1.4 e 39± 1.9 e 88.3 a 对照 CK 51.6± 1.6 e 72± 2.4 a 89.5 a 合考虑，确定 12%为最佳助剂用量（表 4）。 2.2.4 生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂稳定剂的筛选 KH2PO4的悬浮率和润湿时间分别为 77.6%和 41 s， K3PO4的悬浮率和润湿时间分别为 74.3%和 43 s（表 5）。相对于母粉对照 KH2PO4显著提高了悬浮率，缩短了湿润时间，综合考虑芽胞存活率，选择 KH2PO4为最佳润湿剂。 2.2.5 生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂保护剂的筛选 由表 6 可知，抗坏血酸和羧甲基纤维素的悬浮率最高，分别为 76.2%和 72.5%，与其他保护剂相比差异显著，两者的润湿时间分别为 37 和 41 s。但紫外保护剂主要考虑对芽胞的保护效果，且添加抗坏血酸后芽胞含量在 24 h 内变化不大。所以综合考虑，确定最佳紫外保护剂为抗坏血酸。 2.3 生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂质量检测结果 生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂的芽胞含量为 2.28× 1010 cfu/g，杂菌率为 0.5%， pH 为 5.8，细度为 93.5%，干燥减量为 2.5%，润湿时间为 45 s，悬浮率为 85.6%，符合国家标准值， Ht-q6 可湿性粉剂质量合格（表 7）。 2.4 生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂安全性评价结果 生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂对番茄植株的安全性测定结果表明，番茄叶片和茎干的接种针穿刺接种（图 第 5 期 李磊等：生防菌解淀粉芽胞杆菌 Ht-q6 可湿性粉剂的研制及对番茄病害的田间防效 743 表 4 润湿剂和分散剂的比例及用量对生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂的影响 Table 4 Effects of proportion of wetting agent and dispersant agent on Ht-q6 WP 十二烷基苯磺酸钠:木质素磺酸钠 SDBS:Sodium lignosulphonate 悬浮率 Suspension rate (%)润湿时间 Wetting time (s) 助剂量 Adjuvant dosage (%)悬浮率 Suspension rate (%) 润湿时间 Wetting time (s) 1:9 68.4± 2.3 d 39± 1.8 c 2 69.8± 0.9 f 37± 1.6 c 2:8 68.8± 2.4 d 40± 1.8 c 4 72.2± 1.3 e 37± 1.0 c 3:7 69.1± 1.5 d 40± 1.5 c 6 74.5± 3.3d 38± 1.6 bc 4:6 74.9± 2.1 c 41± 1.4 c 8 75.7± 1.9 cd 39± 2.4 bc 5:5 76.9± 1.6 bc 41± 1.3 c 10 76.9± 1.4 bc 39± 2.0 bc 6:4 77.1± 2.1 bc 45± 2.2 b 12 79± 1.5 ab 40± 1.6 b 7:3 77.5± 1.9 bc 46± 1.6 ab 14 79.2± 1.5 ab 44± 1.6 a 8:2 77.9± 1.8 b 47± 2.1 ab 16 79.5± 0.6 a 45± 1.5 a 9:1 80.5± 1.0 a 48± 1.9 a 表 5 稳定剂对生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂的影响 Table 5 Effects of stabilizer on Ht-q6 WP 稳定剂 Stabilizer agent 悬浮率 Suspension rate (%) 润湿时间 Wetting time (s) 14 d 芽胞存活率 Spore survival rate (%) 碳酸钙 CaCO358.7± 2.4 c 49± 2.6 b 80.2 a 磷酸钾 K3PO474.3± 1.5 b 43± 1.9 c 89.2 a 磷酸二氢钾 KH2PO477.6± 1.9 a 41± 1.5 c 89.1 a 羧甲基纤素钠 Sodium carboxymethyl cellulose 60.9± 2.3 c 48± 1.9 b 86.5 a 对照 CK 51.5± 1.7 d 70± 2.6 a 89.7 a 表 6 紫外保护剂对生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂的影响 Table 6 Effects of ultraviolet protectant on Ht-q6 WP 芽胞存活率 Spore survival rate (%) 紫外保护剂 UV protective agent 悬浮率 Suspension rate (%)润湿时间 Wetting time (s) 0 h 6 h 12 h 24 h 抗坏血酸 Acid ascorbic 76.2± 1.2 a 37± 1.8 d 100 98.2 96.1 95.2 羧甲基纤维素 Carboxymethyl cellulose 72.5± 1.5 b 41± 1.1 c 100 97.1 93.6 90.7 糊精 Dextrin 60.5± 1.3 c 44± 1.6 b 100 99.3 92.1 89.8 荧光增白剂 Fluorescer 58.6± 1.6 c 42± 1.6 bc 100 98.5 90.6 90.1 对照 CK 51.0± 2.0 d 69± 1.6 a 100 95.2 85.5 74.7 表 7 生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂质量检测结果 Table 7 Results of quality inspection of Ht-q6 WP 指标 Index 国家标准值 National standards 实际测定值 Actual value 杂菌率 Rate of mixed bacteria (%) 3 0.5 pH 5.0 8.0 5.8 细度 Fineness (%) 90 93.5 干燥减量 Loss on drying (%) 6 2.润湿时间 Wetting time (s) 180 45 悬浮率 Suspension rate (%) 70 85.6 2A）培养 3 d 后，和对照组（图 2B）比较无明显差异，番茄植株经可湿性粉剂 100×稀释液浸根处理，移栽后正常生长，无发病状况（图 2C）与对照组（图 2D）无明显差异。 2.5 生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂毒理学测定结果 急性经口毒性试验结果表明，对大鼠予经口灌胃之后，没有出现死亡和明显的中毒症状。存活动物体重 3 d 恢复或增重。试验结束后处死试验大鼠，据检无异常情况。 Ht-q6 可湿性粉剂对雌、雄大鼠急性经口 LD50 3000 mg/kg，属于低毒性。 744 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 ABCDA： Ht-q6 茎、叶 Stem and leaf； B： CK 茎、叶 Stem and leaf； C： Ht-q6 根 Root； D： CK 根部 Root 图 2 生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂对番茄植株的安全性评价 Fig. 2 Safe evaluation of stain Ht-q6 wettable powder on tomato plant 急性经皮毒性试验结果表明，给大鼠涂抹试剂之后，没有出现死亡和明显的中毒症状。存活动物体重3 d 恢复或增重。试验结束后处死试验大鼠，据检无异常情况。 Ht-q6 可湿性粉剂对雌、雄大鼠急性经皮LD50（ 4 h） 2000 mg/kg，属于低毒性。 急性皮肤刺激试验结果表明：在试验周期内，试验兔的皮肤涂抹部位未出现红斑、水肿，积分均值为0，按国家“皮肤刺激强度分级”标准评定，可湿性粉剂对试验兔的皮肤没有刺激性。 2.6 生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂田间防效试验结果 由表 8 可知，在利用生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂对番茄叶霉病和灰霉病的防治中，稀释 200×的防效最好，分别为 74.3%和 77.1%，与各自对照药剂百菌清 72.4%和 69.9%的防效相比，叶霉病防治效果差异不显著而灰霉病防治效果差异显著。为了减少化学药剂的使用，建议在生产实践中使用稀释倍数为 200×的可湿性粉剂来预防和控制叶霉病与灰霉病的发生。 表 8 生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂对番茄叶霉病和灰霉病的防治效果 Table 8 Efficiency of Ht-q6 wettable powder on tomato grey mold and leaf mold 药剂 Fungicides 稀释倍数 Treatment times 叶霉病病情指数 Disease index 叶霉病防治效果 Control effect (%) 灰霉病病情指数 Disease index 灰霉病防治效果 Control effect (%) 200× 3.5± 0.12 c 74.3± 1.6 a 2.5± 0.32 d 77.1± 2.6 a 400× 6.1± 0.15 b 54.6± 2.4 b 4.1± 0.12 b 61.5± 1.5 c Ht-q6 800× 7.4± 0.15 a 45.5± 0.5 c 6.4± 0.2 a 40.4± 1.3 d 75%百菌清可湿性粉剂 Chlorothalonil WP 500× 3.7± 0.25 c 72.4± 1.3 a 3.2± 0.15 c 69.9± 1.6 b 空白对照 CK 13.5 10.7 3 讨论 通过对载体、湿润剂、分散剂、稳定剂和紫外保护剂的筛选，本文确定了生防菌 Ht-q6 可湿性粉剂的 第 5 期 李磊等：生防菌解淀粉芽胞杆菌 Ht-q6 可湿性粉剂的研制及对番茄病害的田间防效 745 最佳配方。质量检测结果符合国家标准值，质量合格。本文在解淀粉芽胞杆菌菌剂的剂型上选择了生物农药中主流剂型可湿性粉剂，相比于液体制剂更易运输和贮存，与其他固体制剂如粉剂和颗粒剂相比，颗粒直径、湿润性、有效成分等多方面都有提高，防治病害范围更广。可湿性粉剂中载体所占比 例最大，对制剂的影响也最大，所以筛选最佳载体是研制可湿性粉剂中最为关键的一步。王剑等20制备生防菌 B99-2 可湿性粉剂时，以硅藻土为载体，钱一鑫等21研制解淀粉芽胞杆菌 X17 可湿性粉剂也是以硅藻土为载体，与本文在载体筛选上的结果一致。综合来看本试验研制的 H