甲基营养型芽胞杆菌WF-3微粉剂的研制及对黄瓜炭疽病的防治效果.pdf

34(5)722-728 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2018 年 10 月 收稿日期： 2018-03-23 基金项目：国家重点研发计划（ 2016YFD0201000 ） ；中国农业科学院科技创新工程（ CAAS-ASTIP-IVFCAAS） ；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目 作者简介： *共同第一作者，谢学文，博士，助理研究员， E-mail： xiexuewencaas.cn；揣红运，硕士研究生， E-mail： 805724482qq.com； *通信作者，研究员， E-mail： libaojucaas.cn。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.05.011 甲基营养型芽胞杆菌 WF-3微粉剂的研制及 对黄瓜炭疽病的防治效果 谢学文1*，揣红运1*，董瑞利1，杨 杰2，石延霞1，柴阿丽1，李宝聚1*（ 1. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081； 2. 西藏自治区农牧科学院，拉萨 850000） 摘要： 以甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 为研究对象，通过对载体、润湿剂、分散剂、保护剂的筛选，确定了甲基营养型芽胞杆菌微粉剂的最佳配方。其最佳配方为：白炭黑 10%，润湿剂 K12 2%，分散剂 NNO 2%，保护剂 CMC 0.5%，煅烧高岭土 85.5%。测定结果表明，甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂含菌量 2.07×1010 cfu/g，分散指数 83.31%，润湿时间 11.4 s， pH 6.8，杂菌率 2.6%，含水率 0.98%，细度通过率 98%（ 8.13 m），热贮分解率为 4.02%，产品各项指标均达到标准。盆栽条件下，甲基营养型芽胞杆菌 WF-3微粉剂对黄瓜炭疽病的保护效果优于治疗效果，防效分别为 77.38%和 72.69%。 关 键 词： 甲基营养型芽胞杆菌；微粉剂；黄瓜炭疽病；防治效果 中图分类号： S476 文献标识码 ： A 文章编号： 1005-9261(2018)05-0722-07 Preparation of Micropowder of Bacillus methylotrophicus WF-3 and Its Control Effect on Cucumber Anthracnose XIE Xuewen1*, CHUAI Hongyun1*, DONG Ruili1, YANG Jie2, SHI Yanxia1, CHAI Ali1, LI Baoju1*(1. Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2. Tibet Autonomous Regional Academy of Agricultural Sciences, Lasa 850000, China) Abstract: By screening the carriers, wetting agents, dispersing agents and protection agents for Bacillus methylotrophicus WF-3, the optimal formulation were confirmed as follows: the content of filler carbon-white and calcined kaolin, dispersing agent NNO, wetting agent K12 and UV protection agents CMC were 10.0, 85.5%, 2.0%, 2.0% and 0.5%, respectively. The quality detection showed that the spores content of B. methylotrophicus WF-3 micropowder could come up to 2.07× 1010cfu/g, the pH value was 6.8, the rate of heterozygous bacteria was 2.6%, the water content was 0.98%, the fineness rate was 98% ( 8.13 m), the spore dispersion index was 83.31%, dispersing time was 11.4 s, and thermal decomposition rate of storage was 4.02%, which came up to the formulation standard. Pot experiment demonstrated that the protective effects of B. methylotrophicus WF-3 micropowder on cucumber anthracnose was better than the therapeutic effect, and the efficacies were 77.38% and 72.69%, respectively. Key words: Bacillus methylotrophicus; micropowder; Colletrichum orbiculare; biocontrol effect 由半知菌亚门真菌， 葫芦科刺盘孢菌 Colletotrichum orbiculare sp.引起的黄瓜炭疽病是一种重要的真菌病害，植株染病后，被害叶片干枯，导致成熟期果实开裂，完全丧失商品价值，常造成减产 10% 20%，第 5 期 谢学文等：甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂的研制及对黄瓜炭疽病的防治效果 723 对黄瓜种植产业影响较大1。随着设施黄瓜的大量种植，棚室内温、湿度小气候环境十分有利于黄瓜炭疽病病菌的侵染与为害，使得炭疽病逐渐发展成为设施黄瓜生产的主要病害之一。目前，黄瓜炭疽病仍以化学防治为主，常用的杀菌剂包括嘧菌酯、三环唑、苯醚甲环唑等2，但由于该病原菌繁殖速度快，遗传变异大，突变菌田间适应能力强等原因，对上述杀菌剂已产生了不同程度的抗药性，使得化学药剂的防治效果不断下降，增加了黄瓜炭疽病的防治难度3-5。因此，研发一种高效、低毒、低残留，不污染环境的生物杀菌剂成为近年来的研究热点。 生防细菌能够在其生长发育过程中产生多种拮抗性的代谢产物，直接或间接的达到阻碍或杀死病原菌的效果6。甲基营养型芽胞杆菌 Bacillus methylotrophicus 是 2010 年在水稻根系土壤中首次分离得到，已有大量实践证明甲基营养型芽胞杆菌对黄瓜炭疽病、枯萎病、番茄青枯病、灰霉病、烟草黑胫病、香蕉枯萎病及水稻稻瘟病具有较强的抑制作用7-9，但在实用剂型方面研究较少。 微粉剂是在粉剂基础上发展起来的一种新剂型，含有原药、填料或载体、分散剂、润湿剂以及其他辅助助剂，经气流粉碎加工技术，使微粉剂粒径达到 10 m 以下的粉状制剂。市场上的微粉剂主要有“ DL（ Drift Less）”粉剂和“ FD（ Flow Dust）”粉剂10：即日本在 1979 年首次注册的一种农药新型微粉剂（ DL粉剂）和在温室中使用的一种专门的微粉剂（ FD 粉剂）。微粉剂施药不需兑水，不会增加棚室湿度，省工省时，安全环保，提高了农药利用率，且施药过程中，无高温引起的农药损失，可以实现生物农药微粉剂的常温施用。与生物农药可湿性粉剂、悬浮剂、水分散粒剂等相比，微粉剂粒径小，分散性强，加工工艺简单，操作方便且药剂喷出后通过静电吸附作用沉积在叶片正背面，提高了对病害的防治效果。关于生物农药菌剂，目前明亮等11、杨春平等12、赵彦兵等13分别对水分散粒剂、可湿性粉剂、悬浮剂配方进行了筛选， 尚无生物农药微粉剂配方筛选的相关报道， 更无甲基营养型芽胞杆菌微粉剂配方筛选的相关研究。甲基营养型芽胞杆菌微粉剂施用过程中不增加棚室湿度，可以扩大其对病害的防治效果14。本课题组在前期的研究工作中，已从黄瓜根系土样中分离得到一株对黄瓜炭疽病菌 C. orbiculare 具有较强拮抗活性的菌株 WF-3，并经分子生物学和 16S rDNA 分析鉴定为甲基营养型芽胞杆菌 B. methylotrophicus15。本试验以甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 为有效成分，通过对载体助剂的筛选，确定其微粉剂最佳配方，并测定其防治效果，为将其运用于黄瓜炭疽病的防治提供依据。 1 材料与方法 1.1 供试材料 供试菌株： 甲基营养型芽胞杆菌 B. methylotrophicus WF-3 为本课题组从连作多年的黄瓜根际土样中筛选得到16；黄瓜炭疽病菌 C. orbiculare（编号： HG10050502），经鉴定该病原菌具有较强致病力，保存于中国农业科学院蔬菜花卉研究所。 供试药剂： 25%咪鲜胺（ prochloraz）乳油，江苏辉丰生物农业股份有限公司。 供试载体：膨润土（ Bentonite）、白炭黑（ Silica）、煅烧高岭土（ Kaolin）、凹凸棒土（ Attapulgite）、滑石粉（ Talc）、硅藻土（ Diatomite），所有载体均由河北石家庄灵寿县天昊矿产品加工厂提供。 供试助剂： 十二烷基硫酸钠 （ Sodium dodecyl sulfate， K12） 、 烷基萘磺酸盐 （ Alkyl naphthalene sulfonate，Morwet EFW）、异丙醛萘磺酸钠（ Isopropyl aldehyde naphthalene sulfonate， Morwet IP）、酸性烷基硫酸盐（ Acid alkyl sulfate， W2001）、磺酸盐（ Sulfonate， W2002）、木质素磺酸盐（ Lignosulfonate， DM02）、烷基萘磺酸缩聚物 （ Alkylnaphthalene sulfonic acid polycondensate， Morwet D-425） 、 萘磺酸盐类 （ Naphthalene sulfonate， D10）、聚羧酸盐类（ Carboxylates， T36）、萘磺酸钠盐甲醛缩合物（ Formaldehyde condensates of sodium naphthalene sulfonate salt， NNO），所有助剂均由南京捷润科技有限公司提供。 保护剂：抗坏血酸（ Vitamin C， VC）、荧光素钠（ Fluorescein sodium）、羧甲基纤维素（ Carboxymethyl cellulose， CMC），所有保护剂均由南京捷润科技有限公司提供。 1.2 甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 发酵液的制备 种子液：将菌株 WF-3 活化后转接到 pH 为 7.0 的 NB（葡萄糖 10 g、牛肉膏 5 g、蛋白胨 10 g、 NaCl 15 g、蒸馏水 1000 m L， pH 7.0 7.2）液体培养基中，装液量为 125 mL/250 mL，置于 28 、 126 r/min 振荡培 724 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 养 24 h。 发酵液：取 5 mL 菌株 WF-3 种子液转接到装液量为 125 mL/250 mL NB 液体培养基中，置于 28 、126 r/min 振荡培养 48 h，制成芽胞含量为 5× 1010cfu/mL 发酵液。 1.3 指标测定 pH 测定参照 GB/T1601-1993 农药 pH 的测定方法进行； 细度测定参照 （ GB/T 16150-1995） 用 BT-9300Z型激光粒度分布仪测定甲基营养型芽胞杆菌微粉剂的粒径大小；含水量测定参照（ GB/T 1600-1989）。 参照中华人民共和国农业部标准 NY/T2293.1-2012（ 5.3），采用平板菌落计数法，测定制剂的活菌总数（或芽胞含量），同时称取 1 g 待测样品用 10 mL 无菌蒸馏水制成 10 倍稀释液，取 1.0 mL 稀释液放入水浴锅中 80 条件下水浴 15 min，之后冷却至室温，用无菌水梯度稀释至 106倍，取 50 L 涂布于NA 固体培养基 （葡萄糖 10 g、 牛肉膏 5 g、 蛋白胨 10 g、 琼脂粉 20 g、 NaCl 15 g、 蒸馏水 1000 mL， pH 7.07.2）上于 30 培养箱中培养 36 h 左右，观察菌落生长情况统计菌落数并按照公式：芽胞含量（ cfu/g）100× 20×平均每皿菌落数×稀释倍数 /10，计算母粉中芽胞含量。 杂菌率测定参照中华人民共和国农业部标准（ NY/T2293.1-2012）按照芽胞含量测定方法进行测定，选择 NA 培养基检测样品中的细菌杂菌，选择 PDA 培养基检测样品中的真菌杂菌，然后统计总的可见杂菌菌落数量并按照公式：杂菌率（ %）（细菌杂菌菌落数的总和真菌杂菌菌落数的总和） /（细菌杂菌菌落数的总和真菌杂菌菌落数的总和有效成分甲基营养性芽胞杆菌菌落数总和）× 100，计 算杂菌率。 热贮稳定性测定加速贮存实验（ GB/T 19136-2003）：将 5 g 微粉剂加入到洁净的安瓿瓶中，用酒精喷灯进行封口，封口后分别称重。称重后将封好的安瓿瓶置于 GH-500 型隔水式培养箱中，（ 54± 2）贮存， 14 d 后取出安瓿瓶，称重测量，并对菌含量进行测定。 载体分散性测定17：称取定量混合均匀的样品后过 500 目筛，铺平到分散器底部，接通电源并开始计时， 30 s 后停止，称取分散后残余粉体质量，按照公式分散指数（ %）（样品量残余样品量） /样品量× 100，试验重复 3 次。 浮游指数17：将混合均匀的样品在散粉箱内散粉 30 s 后，再将浮游在箱内的粗微粒子捕集到盛水的集尘管内，在波长 610 nm 处测定透光率，按照公式浮游指数 100透光率。 1.4 载体的筛选 分别称取膨润土、白炭黑、煅烧高岭土等载体 1 kg，每种载体中加入 3 L 芽胞含量为 5× 1010cfu/mL发酵液进行吸附，自然条件下晾干，制备好的各母粉室温贮藏。 14 d 后通过测定各制剂的菌落数，分散指数，浮游指数，密度等因素，确定最佳载体。试验设 3 次重复。 1.5 助剂及复配助剂配比筛选 在制备好的母粉中，分别添加 4%的 K12、 Morwet EFW 等助剂，即制得不同的制剂。测定各制剂的润湿时间，比较润湿性能的好坏：润湿时间越短，润湿性越好。测定分散性，比较各种制剂的分散效果：分散指数越高，分散性越好，根据试验结果选取最优分散剂和润湿剂。试验设 3 次重复。 将从助剂中筛选出的分散剂与润湿剂，分别按质量比 1:9、 2:8、 3:7、 4:6、 5:5、 6:4、 7:3、 8:2、 9:1 比例经研磨机混合均匀，测定分散指数和润湿时间，筛选出一种最佳助剂复配组合。 1.6 保护剂的筛选 将菌株 WF-3（菌含量为 5× 1010cfu/mL）的发酵液与筛选出的载体、助剂按优化后的配比吸附晾干，加入 0.5%的保护剂（荧光素钠、抗坏血酸、羧甲基纤维素）经研磨机混合均匀，稀释后涂布在 NA 平板上，置于 28 W 紫外灯下，距离 10 cm 处，照射 60 min 后计算芽胞含量18，以不加保护剂作为对照，试验设 3次重复。 1.7 微粉剂的加工与测定 按照优化筛选出的最佳配方配成甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 制剂，经气流粉碎机（ GYF-100，昆山密友粉碎设备有限公司）超微粉碎后制成微粉剂。采用平板菌落计数法记录菌落数，测定经超微粉碎后的WF-3 微粉剂对芽胞活性的影响。 第 5 期 谢学文等：甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂的研制及对黄瓜炭疽病的防治效果 725 1.8 甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂室内盆栽防效 2017 年 8 月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室进行盆栽防效测定试验。使用精量电动弥粉机19测定甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂对黄瓜炭疽病的防治效果。试验共设 4 个处理：甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂按施药剂量为 45 kg/hm2喷粉；对照药剂 25%咪鲜胺乳油按施药剂量为 112.5 L/hm2喷雾；清水对照。在喷药前，将喷粉处理的黄瓜苗放置到一个密闭的空间以防止微粉飘散，喷粉结束 4 h 后，将喷粉处理的黄瓜苗与喷雾处理的黄瓜苗放置一起，以保证整个环境条件一致。 将黄瓜炭疽病菌在 PDA 培养基（马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂 20 g、蒸馏水 1000 mL）上培养22 d，用毛刷将孢子刷下，用血球计数板调配，获得 1× 106孢子 /mL 悬浮液。待盆栽黄瓜苗长至 2 4 片真叶时进行药剂处理， 施药 2 h 后待叶片表面晾干后采用叶面喷雾的方式接种 1× 106孢子 /mL 黄瓜炭疽病菌孢子悬浮液。接菌后将黄瓜苗放在相对湿度为 95%，温度 25 30 保湿柜中保湿培养 24 h，之后转入正常育苗温室培养，每个处理 4 次重复，每次重复 10 株黄瓜苗。待清水对照充分发病后，参照 GB/T 17980.112-2004 进行黄瓜炭疽病病情调查。 黄瓜炭疽病病情分级标准： 0 级，无病； 1 级，病斑面积占整片叶面积的 5%以下； 3 级，病斑面积占整片叶面积的 6% 10%； 5 级，病斑面积占整片叶面积的 11% 25%； 7 级，病斑面积占整片叶面积的26% 50%； 9 级，病斑面积占整片叶面积的 50%以上。病情指数 （各级病叶数×相对级数值） /（调查总叶数× 9）× 100；防治效果（ %）（ CK PT） /CK× 100；发病率（ %）发病叶片数 /调查总叶片数× 100。式中 CK：空白对照区施药后病情指数； PT：药剂处理区施药后病情指数20。 1.9 数据统计与分析 试验数据采用 SPSS 18.0 软件分析处理， LSD 法做多重比较分析（ P 0.05）。 2 结果与分析 2.1 载体的筛选 载体在制剂中占据较大比例，因此载体对制剂的理化性质影响很大。白炭黑制剂对甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 芽胞活性影响较小且分散指数，浮游指数分别为 96.78%， 64.11；膨润土、凹凸棒土和滑石粉制剂的芽胞含量较少， 分别为 0.88× 1010、 0.79× 1010和 0.94× 1010 cfu/g。 煅烧高岭土芽胞含量为 2.12× 1010cfu/g，浮游指数为 53.22%，透光率为 45.67（表 1）。综合考虑各制剂的分散性、漂浮性、密度及与菌株的生物相容性，确定最优载体为白炭黑和煅烧高岭土复配，白炭黑用量 10%，煅烧高岭土用量补足至 100%。 表 1 载体对甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 的影响 Table 1 Effects of filler on WF-3 处理 Treatment 分散指数 Dispersion (%) 浮游指数 Planktonic index (%) 透光率 Transmittance 芽胞含量 Spore content (× 1010cfu/g)凹凸棒土 Attapulgite 80.98± 0.88 c 28.55± 0.78 d 72.67± 0.30 a 0.79± 0.31 a 硅藻土 Diatomite 62.87± 1.10 d 41.88± 0.98 c 57.67± 0.31 b 2.63± 0.15 b 白炭黑 Silica 96.78± 0.48 a 64.11± 2.07 a 34.33± 0.33 d 2.07± 0.25 c 煅烧高岭土 Kaolin 92.75± 0.31 b 53.22± 1.63 b 45.67± 0.88 c 2.12± 0.37 c 膨润土 Bentonite 82.22± 0.30 c 31.88± 0.98 d 67.67± 0.32 e 0.88± 0.19 a 滑石粉 Talc 92.78± 1.14 b 35.67± 0.88 e 64.00± 1.53 e 0.94± 0.13 a 注：不同小写英文字母表示在 0.05 水平上有显著性差异，下同。 Note: Different small letters indicated significant difference at the 0.05 level. The same below. 2.2 助剂的筛选 由于大部分助剂具有双重作用，因此本试验同时筛选样品的润湿剂和分散剂。不同助剂对样品的润湿性和分散性影响较大， K12、 W2001 的润湿性较好，润湿时间都在 10 s 以下，而它们的分散指数较低，在60%以下； DM02、 D10、 NNO 的分散指数较高，而它们的润湿时间较长，都在 60 s 以上（表 2）。综合考虑，选择分散剂 NNO 与润湿剂 K12 复配。 NNO 和 K12 随着用量的变化而变化，当分散剂与润湿剂比726 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 例为 5:5 时，分散指数为 81.61%，润湿时间为 10 s，随着助剂用量的增加，润湿时间与分散指数在不断增加，确定最佳配比为 5:5（表 3）。 2.3 保护剂的筛选 当甲基营养型芽胞杆菌应用到田间时，阳光中的紫外线会削弱活菌体的防治效果，然而保护剂能将阳光中的大部分紫外线吸收掉，将吸收的能量转化为无害的能量散发到空气中21。当紫外照射 60 min 后，选用羧甲基纤维素作保护剂，含菌量均高于抗坏血酸和荧光素钠，为 1.27× 1010cfu/g，且分散指数，润湿时间基本无变化（表 4）。 表 2 助剂对样品润湿时间和分散指数的影响 Table 2 Effect of additives on the wetting time and dispersion of the sample 处理 Treatment 润湿时间 Wetting time (s) 分散指数 Dispersion (%) 芽胞含量 Spore content (× 1010cfu/g)D10 65.00± 11.02 b 98.20± 0.31 a 1.38± 1.97 b DM02 68.20± 18.02 c 82.26± 0.88 b 1.69± 1.22 a K12 6.40± 5.13 i 54.08± 2.79 g 1.98± 0.48 a Morwet D-425 44.00± 13.66 a 76.56± 0.33 d 1.78± 0.66 a Morwet EFW 49.20± 3.27 f 49.48± 1.06 h 1.83± 0.39 a Morwet IP 17.00± 13.98 g 50.95± 0.85 h 1.98± 1.26 a NNO 71.60± 10.88 d 87.19± 0.30 c 2.17± 0.58 a T36 41.60± 22.36 a 77.60± 0.42 d 1.25± 1.38 b W2001 7.00± 6.78 h 58.81± 0.70 f 1.04± 1.39 c W2002 94.40± 8.82 e 66.89± 1.88 e 2.06± 0.48 a 表 3 助剂复配对样品润湿时间和分散指数的影响 Table 3 Effect of compound additives on the wetting time and dispersion of the sample 质量比 Mass ratio NNO:K12 细度 Fineness ( 10m, %) 润湿时间 Wetting time (s) 分散指数 Dispersion (%) 芽胞含量 Spore content (× 1010cfu/g) 1:9 100 4.10± 1.23 c 69.17± 0.89 b 1.98± 0.35 a 2:8 100 5.60± 1.93 c 72.06± 1.35 e 2.03± 0.21 a 3:7 100 7.00± 2.00 b 76.02± 0.67 a 2.06± 0.56 a 4:6 100 9.20± 1.63 b 77.04± 1.22 a 2.12± 0.13 a 5:5 100 10.00± 2.00 b 81.61± 0.92 d 2.05± 0.41 a 6:4 100 12.80± 1.36 b 83.10± 0.61 c 1.97± 0.24 a 7:3 100 15.40± 2.70 a 84.63± 0.42 c 1.93± 0.13 a 8:2 100 16.00± 2.85 a 85.31± 0.26 c 1.92± 0.04 a 9:1 100 17.80± 1.66 a 85.61± 0.93 c 1.91± 0.2 a 表 4 保护剂对样品的影响 Table 4 Effects of protective agent on the sample 照射 60 min 后 After 60 min of irradiation 处理 Treatment 照射前芽胞含量 Spore content (× 1010cfu/g) 润湿时间 Wetting time (s) 分散指数 Dispersion (%) 芽胞含量 Spore contend (× 1010cfu/g)抗坏血酸 Vitamin C 2.12± 0.13 a 22.00± 0.94 c 78.07± 1.21 b 0.68± 0.13 c 荧光素钠 Fluorescein sodium 2.04± 0.41 a 15.60± 1.33 b 85.86± 1.67 a 0.98± 1.12 b 羧甲基纤维素 Carboxymethyl cellulose 2.10± 0.19 a 11.40± 1.02 a 83.31± 0.96 a 1.27± 0.45 a 对照 Control 1.94± 0.28 d 30.00± 2.00 d 81.61± 0.92 a 0.32± 0.19 d 2.4 微粉剂的加工与测定 WF-3 制剂经气流粉碎机超微粉碎制成微粉剂后，细度通过率为 98%（ 8.13 m），采用平板菌落计数法测定其菌落数为 2.07× 1010cfu/g，未经粉碎的 WF-3 制剂平均菌落数为 2.10× 1010cfu/g，处理组和对照组相比无显著性差异22，甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 制剂经超微粉碎后孢子生物活性不受影响。 第 5 期 谢学文等：甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂的研制及对黄瓜炭疽病的防治效果 727 2.5 性能测定 参照中华人民共和国农药粉剂及凌世海17农药剂型加工相关检测方法进行测定，结果显示制备的甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂芽胞含量、 pH、杂菌率、粒径、含水率、分散指数、润湿时间、热贮分解率均符合标准（表 5）。 表 5 甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂主要性能指标 Table 5 Main performance index of B. methylotrophicus WF-3 micropowder 性能指标 Performance 微粉剂标准 Micropowder standard 测定结果 The measurement results 菌量 Amount of bacteria (cfu/g) - 2.07× 1010粒径 Particle size (D98, m) 10 8.13 含水率 Water content (%) 1.5 0.98 分散指数 Dispersion (%) 20 83.31 润湿时间 Wetting time (s) 120 11.4 pH 5.5 7.0 6.8 杂菌率 Miscellaneous rate (%) 3 2.6 分解率 Decomposition rate (%) 5 4.02 2.6 甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂室内盆栽防效 甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂（ 2.07× 1010cfu/g）按施药剂量为 45 kg/hm2时，喷粉对黄瓜炭疽病的治疗效果和保护效果分别为 72.69%和 77.38%；对照药剂 25%咪鲜胺乳油按施药剂量为 112.5 L/hm2时，喷雾对黄瓜炭疽病的治疗效果和保护效果分别为 87.04%和 81.73%。 WF-3 微粉剂在室内盆栽试验中对黄瓜炭疽病的保护效果和治疗效果均超过 70%，且保护效果优于治疗效果（表 6）。 表 6 甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂对黄瓜炭疽病盆栽防治效果 Table 6 Control effect of B. methylotrophicus WF-3 micropowder against C. orbiculare in pot experiment 治疗作用 Protective effect 保护作用 Curative effect 处理 Treatment 浓度 Concentration处理方式 Processing method 病情指数 Disease index防治效果 Control efficacy (%)病情指数 Disease index 防治效果 Control efficacy (%)甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂 B. methylotrophicus powder 2.0× 1010cfu/g 45 kg/hm2喷粉 14.24 72.69± 2.45 a 12.67 77.38± 1.54 a 25%咪鲜胺乳油 prochloraz EC 112.5 L/hm2喷雾 7.26 87.04± 3.12 b 11.16 81.73± 2.12 a 清水对照 Control - - 61.08 - 56.01 - 3 讨论 早在 20 世纪，日本就开始研究农药微粉剂，微粉剂以其施药不需兑水，不会增加棚室湿度的独特优势，在生产上得到了广泛的应用23；甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 作用方式直接，生物活性强，防治效果好，具有较强的促生长作用，且从 1995 年发现至今，尚未有对人畜有害的报道24，与其他芽胞杆菌相比，虽然都具有耐高温、抗辐射等特点，但甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 因其代谢产物的多样性、对外界环境因子的多抗逆性和无污染无毒害等优点，被广泛应用于蔬菜病害防治。甲基营养型芽胞杆菌微粉剂具有较强的空中悬浮效果和叶片附着性，从而对设施蔬菜病害有更好的防治效果。 生防菌的芽胞存活力是决定其最终防效的因素之一，选择适合的载体和助剂是衡量生物农药微粉剂最佳配方的首要因素。本试验所研制的甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂芽胞含量为 2.07× 1010 cfu/g，符合芽胞杆菌粉剂含胞量行业标准（ NY/T2293.1-2012，含胞量指标 1.0× 1010cfu/g）。张金凤等25将白炭黑和高岭土复配作为解淀粉芽胞杆菌 41B-1 可湿性粉剂的载体。刘振华等26在载体筛选中，将白炭黑和高岭土复配作为最终多粘类芽胞杆菌可湿性粉剂的载体；助剂复配使用不仅能提高制剂的分散性，润湿性，而且能够增强其防治效果。李学红等27采用正交试验设计对甲基营养型芽胞杆菌可湿性粉剂的助剂进行筛728 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 选，确定其最佳配方，且防治效果达到了 75%以上。然而有关制备生物农药微粉剂的载体和助剂的研究较少，本研究通过单因素试验，确定了甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂的最佳载体和助剂，即配方为白炭黑 10%、高岭土 85.5%、十二烷基硫酸钠（ K12） 2%、萘磺酸钠盐甲醛缩合物（ NNO） 2%，羧甲基纤维素（ CMC） 0.5%，研究结果与前人结论一致。 在室内盆栽试验中，甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂对黄瓜炭疽病的保护作用优于治疗作用，防效分别为 77.38%和 72.69%，虽然略低于对照药剂咪鲜胺的防效，但无显著性差异，且长期采用化学农药防治，容易产生抗药性，增加农药残留量，污染环境；采用生物农药可湿性粉剂、悬浮剂、水分散粒剂喷雾防治，容易增加棚室湿度，促使病害发生，导致防治难度进一步加大；采用甲基营养型芽胞杆菌微粉剂喷粉防治不增加棚室湿度，不利于病害的发生与流行，不污染环境，对黄瓜炭疽病具有较好的防治效果。因此，甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂可作为防治黄瓜炭疽病的有效药剂，这也表明甲基营养型芽胞杆菌 WF-3 微粉剂在黄瓜炭疽病防治方面具有较广的应用前景。 参 考 文 献 1 李春藻 . 农抗 120 防治黄瓜炭疽病和枯萎病 J. 中国生物防治 , 1990, 6(2): 63. 2 韩秀英 , 张小风 , 王文桥 , 等 . 不同杀菌剂对黄瓜炭疽病菌的抑制作用 C/中国植物病害化学防治学术研讨会 , 2006. 3 张舒亚 . 嘧菌酯对植物病原真菌的生物活性及抗药性研究 D. 南京 : 南京农业大学 , 2002. 4 张传清 , 周明国 . 间接作用化合物三环唑防治黄瓜炭疽病的作用机制 J. 中国农业大学学报 , 2009, 14(3): 49-53. 5 伏波 , 姚娟妮 , 高小宁 ,等 . 植物内生枯草芽孢杆菌 Em7 菌株对葡萄灰霉病菌的抑菌活性 J. 农药学学报 , 2016, 18(4): 465-471. 6 李长松 . 拮抗性细菌生物防治植物土传病害的研究进展 J. 中国生物防治学报 , 1992, 8(4):168-172. 7 冯云利 , 奚家勤 , 马莉 , 等 . 烤烟品种 NC297 内生细菌中拮抗烟草黑胫病的生防菌筛选及种群组成分析 J. 云南大学学报 (自然科学版 ), 2011, 33(4): 488-496. 8 黄霄 , 陈波 , 周登博 , 等 . 菌株 BM-24 的分离鉴定及对香蕉枯萎病菌的抑菌活性 J. 植物保护学报 , 2013, 40(2): 121-127. 9 Shan H, Zhao M, Chen D, et al. Biocontrol of rice blast by the phenaminomethylacetic acid producer of Bacillus methylotrophicus strain BC79J. Crop Protection, 2013, 44(1): 29-37. 10 小林羲明 , 蒋忠锦 . 农药新型 “DL 粉剂 ”和 “FD 粉剂 ”J. 精细化工中间体 , 1983(4): 54-57. 11 明亮 , 刘程程 , 杨晓云 , 等 . 生物杀菌剂解淀粉芽孢杆菌 B1619 水分散粒剂配方及助剂筛选 J. 中国生物防治学报 , 2015, 31(4):