短密木霉菌RT-PCR检测体系的建立及其在南瓜根际的动态分析.pdf
<p>34(4)574-581 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2018 年 8 月 收稿日期： 2017-12-25 基金项目：国家重点研发计划（ 2016YFD0201010、 2017YFD0201102） ；中国农业科学院科技创新工程（ CAAS-ASTIP-IVFCAAS） ；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目 作者简介： *共同第一作者，谢学文，博士，助理研究员， Email： xiexuewencaas.cn；程颖超，硕士研究生， Email： 761017740qq.com； *通信作者，博士，研究员， Email： Libaojucaas.cn。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.04.012 短密木霉菌 RTPCR检测体系的建立及其在 南瓜根际的动态分析 谢学文1*，程颖超1*，王 锟1，张红杰2，杨 杰3，石延霞1，柴阿丽1，李宝聚1*（ 1. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081； 2. 河北北方学院农林科技学院，张家口 075000； 3. 西藏自治区农牧科学院蔬菜研究所， 拉萨 850000） 摘要： 根据短密木霉菌 31636 ITS 基因序列设计特异性引物 TB51F/51R，建立其荧光定量 PCR（ RTPCR）检测体系。通过盆栽试验明确短密木霉菌 31636 对南瓜疫病的防治效果，并采用 RTPCR 检测技术监测短密木霉菌 31636 与辣椒疫霉菌 LJ12010805 在南瓜根际土中的动态变化。试验结果表明，利用该引物建立的 RTPCR 检测体系线性关系良好，灵敏度为 0.16 pg/µL，是普通 PCR 的 100 倍。采用拌土法接种短密木霉菌 31636 菌悬液 10 mL 育苗对南瓜疫病的防效最佳，定植后第 15、 30 d 时防治效果分别为 75.63%和46.82%。 RTPCR 检测结果显示基质土中短密木霉菌 31636 呈减 增 减的动态变化规律， 15 d 时菌量最大，拷贝数为 3.44× 106 copys/L；于定植后第 3、 15 d 辣椒疫霉菌 LJ12010805 菌量分别达到最大、最小值，拷贝数分别为 2.42× 106 copys/L 和 5.76× 102 copys/L。而对照的辣椒疫霉菌 LJ12010805 菌量持续增加，监测的第 30 d 拷贝数最大，为 8.42× 107 copys/L。 关 键 词 ：短密木霉菌；南瓜疫病；荧光定量 PCR；动态变化；防效 中图分类号： S476 文献标识码 ： A 文章编号： 1005-9261(2018)04-0574-08 Establishment of Real-time Fluorescent Quantitative PCR for Trichoderma brevicompactum and Its Dynamic Change in Pumpkin Rhizosphere XIE Xuewen1*, CHENG Yingchao1*, WANG Kun1, ZHANG Hongjie2, YANG Jie3, SHI Yanxia1, CHAI Ali1, LI Baoju1*(1. Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2. School of Agriculture and Forestry Science and Technology, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China; 3. Institute of Vegetable, Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences, Lasa 850000, China) Abstract: A real-time fluorescent quantitative PCR detection assay of Trichoderma brevicompactum 31636 was developed based on a specific primer pair TB51F/51R which were designedbased on the ITS gene. The pot experiment was conducted to determine the control effect of T. brevicompactum 31636 on pumpkin Phytophthora blight, and the dynamic changes of population of T. brevicompactum 31636 and Phytophthora capsici Leonian LJ12010805 in pumpkin rhizosphere soil were monitored by RT-PCR. The result showed that the assay has a good liner relationship with a high sensitivity of 0.16 pg/L DNA, which is 100 times more than that of normal PCR. Inoculation with 10 mL T. brevicompactum 31636 bacterial suspension at sowing stage had a best control effect on pumpkin Phytophthora blight, with the efficacies of 73.11% and 46.82% on the 15th and 30th day, respectively. 第 4 期 谢学文等：短密木霉菌 RTPCR 检测体系的建立及其在南瓜根际的动态分析 575 RT-PCR results showed that dynamic change of T. brevicompactum 31636 in matrix after planting was appeared three distinct phases that were decrease, increase and decrease. The amount of bacteria was the largest on 15th day, with the copy number of 3.44× 106copys/L. On the 3rd after planting, the amount of P. capsici LJ12010805 reached the maximum, then decreased gradually and reached the lowest on 15th day, with the copy number of 2.42× 106copys/L and 5.76× 102 copys/L, respectively. However, P. c a p s i c i LJ12010805 of the control showed an increasing trend, with the highest copy number of 8.42× 107 copys/L on the 30th day. Key words: Trichoderma brevicompactum; pumpkin Phytophthora blight; real-time fluorescent quantitative PCR; dynamic change; control effect 南瓜疫病是由辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici Leonian 引起的一种世界性土传病害，在南瓜整个生育期均可感染，为害植物根、茎、叶、果实，是制约南瓜产业发展的主要因素之一1。随着蔬菜产业的发展加之农民栽培管理方式不当，疫病发生逐年加重，每年给全世界蔬菜产业造成的损失高达 10 亿美元2。在黑龙江省，由辣椒疫霉菌引起的南瓜疫病所致损失一般在 10% 30%，流行年份达 100%3。此外，近些年一些以南瓜为砧木的黄瓜和西瓜的生产栽培也受到影响，而 2012 年研究者对 19 份南瓜砧木进行抗病性鉴定及 RTqPCR 检测，发现仅 3 份对南瓜疫病具有抗性4，且目前没有真正意义上的抗疫病的南瓜品种。 目前，对于南瓜疫病的防治，主要是以化学防治为主，但容易使病原菌产生抗药性且造成环境污染等诸多负面影响，而生物防治方法较大程度地弥补了上述问题。木霉菌 Trichoderma spp.是目前研究最为广泛且深入的拮抗真菌。生产中的木霉制剂主要以活菌形式存在，在生产中极易受到温度、湿度、土壤pH 等外界因素的影响，导致其防效表现参差不齐，故深入研究土壤中生防菌与病原菌的互作消长动态对于木霉菌的田间应用及进一步提高其防治效果显得尤为重要。传统的量化生防菌与病原菌动态变化的方法主要包括寄主侵染法6、植物材料诱捕法7、植物残体分离法8、土壤团粒法9及平板稀释计数法10等，但这些方法相当繁琐，费时费力，重复性差11，且并未反映出生防菌与病原菌在同一时间内的变化情况，严重妨碍生防菌的推广应用。而近年来，荧光定量 PCR 检测技术已广泛应用于土壤中微生物菌量的实时监测12-16。 基于此，本研究通过盆栽试验，明确短密木霉菌 T. brevicompactum 31636 对南瓜疫病的防治效果，并且采用荧光定量 PCR 检测技术，实时监测南瓜根际土中生防菌与病原菌的动态变化，以期为生防菌的田间应用以及新型生防制剂的开发提供理论支撑与技术指导。 1 材料与方法 1.1 供试作物及菌株 1.1.1 供试作物 南瓜，品种为“哈金龙”，其种子购自山东寿光丰农种业有限公司。 1.1.2 供试菌株 供试菌株共 11 株（表 1），其中木霉属菌株 4 株，均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，其他常见病害病原菌 7 株，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所菜病综防组分离保存。 1.2 短密木霉菌 31636 荧光定量 PCR 检测体系的建立 1.2.1 菌株培养与 DNA 的提取 供试疫霉菌及瓜果腐霉菌采用燕麦培养基进行活化， 3 d 后挑取适当大小的菌块于液体燕麦培养基培养，其他供试菌株于 PDA 培养基活化 3 d 后，挑取适当大小的菌块于 PD 培养基培养。 28 培养 5 d 至有菌丝球出现， 4 层纱布过滤去除菌液收集菌丝体后于真空冷冻干燥机冻干，采用改良 CTAB 法提取 DNA17。 1.2.2 引物设计 从 GenBank 中下载供试菌株的核糖体内转录间隔区（ ITS）基因部分序列（登录号分别为 EU330943.1， KR296850.1， MG266013.1， AF140045.1， FJ435116.1， HG934415.1， FJ867940.1， KC438411.1，GU258097.1， AY387702.1， AH015115.2），应用 MEGA 软件对短密木霉菌的 ITS 序列与其他供试菌株 ITS序列进行比对，利用 Primer 6.0 软件对其差异位点设计特异性荧光定量 PCR 引物。通过 Blast program（ http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对所设计的引物序列与其他生物种属之间的同源性。引物由北京博迈德基因公司合成后进行特异性筛选与评价。 576 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 表 1 供试菌株信息 Table 1 Isolates used in the test 序号 Number 菌株编号 Isolate code 病原菌 Pathogen 引起病害 Disease 1 31636 短密木霉菌 Trichoderma brevicompactum 生防菌 2 T22 哈茨木霉菌 Trichoderma harzianum 生防菌 3 31642 拟康宁木霉菌 Trichoderma koningiopsis 生防菌 4 Itr-2 绿色木霉菌 Trichoderma viride 生防菌 5 HG1601060103-4 灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 灰霉病 6 KXC151218030602 立枯丝核菌 Rhizoctonia solani 立枯病 7 FQ15051822 茄病镰刀菌 Fusarium solani 根腐病 8 XG11012402 瓜果腐霉菌 Pythium aphanidermatum 猝倒病 9 FQ09092001 致病疫霉菌 Phytophthora infestans 晚疫病 10 HG15060516 尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum 枯萎病 11 LJ12010802 辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici 疫病 1.2.3 普通 PCR 检测引物特异性 以短密木霉菌 31636 以及其他 10 种对照菌株基因组 DNA 为模板进行PCR 扩增。总体系为 20 L，其中 2× Taq PCR Master Mix 10 L，上下游引物各 0.2 L， DNA 模板 1 L，ddH2O 补足至 20 L。反应程序： 94 预变性 3 min； 94 变性 30 s， 58 退火 30 s， 72 延伸 30 s，共 35 个循环； 72 补充延伸 5 min。 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。 1.2.4 荧光定量 PCR 检测引物特异性 以短密木霉菌 31636 以及其他 10 种对照菌株基因组 DNA 为模板进行 RT-PCR 扩增。总体系为 20 L，其中 2× SuperReal PreMix Plus 10 L，上下游引物各 0.2 L， DNA模板 1 L， 50× ROX Reference Dye 0.4 L， ddH2O 补足至 20 L。反应程序： 95 预变性 10 min， 95 变性 15 s， 60 退火 32 s，共 40 个循环。在升温时收集荧光信号，检测引物特异性。 1.2.5 普通 PCR 与荧光定量 PCR 检测引物灵敏度 采用离心柱型琼脂糖凝胶回收试剂盒 （北京天根公司）对短密木霉菌 31636 特异性扩增的 180 bp 扩增产物进行凝胶回收，回收产物连接到载体 pMD18T Vector上后转入到 50 L TransT1 感受态细胞中， 37 ， 200 r/min 培养 2 h，涂 LB 平板过夜，提取阳性克隆质粒 DNA 后进行 PCR 扩增并送至北京博迈德公司进行测序。测得质粒 DNA 的初始浓度为 1.0× 104 pg/µL，按 10 倍梯度稀释 10 个浓度后分别进行普通 PCR 扩增和 RTPCR 扩增以检测引物灵敏度。 1.2.6 荧光定量 PCR 标准曲线的建立 阳性克隆质粒 DNA（浓度为 1.0× 104 pg/µL）以 10 倍梯度稀释 8 个浓度，以不同稀释倍数的 DNA 为模板，构建 RTPCR 标准曲线，每个反应 3 次重复。反应体系及程序同1.2.4。以模板 DNA 浓度对数值为横坐标，以反应循环数（ CT）值为纵坐标绘制标准曲线。 1.3 短密木霉菌 31636 与辣椒疫霉菌 LJ12010805 在南瓜根际的动态分析 1.3.1 南瓜催芽育苗 选取饱满的南瓜种子于 55 温水中浸泡 4 h，完成后，把种子放入底部铺有纱布的保湿盒中，置于 28 温箱中催芽，当胚根长至 1.0 cm 时采用 5 cm× 5 cm 的穴盘育苗。育苗时采用拌土法接种短密木霉菌 31636 菌悬液（浓度为 1× 108 cfu/mL），每穴分别接入 10 mL， 20 mL， 30 mL 菌悬液，3 次重复，每次重复 20 株。对照药剂采用 50%烯酰吗啉可湿性粉剂（ 250 ppm）。 1.3.2 辣椒疫霉菌扩繁与接种 参照许亚池等18的方法，将供试辣椒疫霉菌菌块转接于 5% V8 培养基上，黑暗培养 5 d 后，加入 10 mL 无菌水并进行光照处理 5 d，诱导孢子囊释放游动孢子并调至最适宜接种发病的浓度 1× 104 cfu/mL3备用。 1.3.3 南瓜疫病病指调查及防效计算 待南瓜长至适当株高后将其定植于装有已接种辣椒疫霉菌LJ12010805 菌土的营养钵中，于定植后 15 d， 30 d 分别调查各处理病情指数，计算防效。 病害调查采用南瓜疫病分级标准： 0 级：无病； 1 级：茎上出现些微水渍状的病斑； 2 级：茎上病斑扩展，但不超过株高 1/4，不萎蔫； 3 级：病部超过整株 1/4，向下延伸至根部不超过株高 3/4，茎基部轻微萎蔫； 4 级：病部超过整株或蔓延至全株，包括根和叶柄，茎基部严重溢缩，叶片枯萎，已死亡。采用 SPSS 第 4 期 谢学文等：短密木霉菌 RTPCR 检测体系的建立及其在南瓜根际的动态分析 577 18.0 进行差异显著分析， P 0.05。病情指数 （各级病株数×相应级别） /（调查总株数×最大级数）×100；防治效果（ %）（空白对照病情指数处理病情指数） /空白对照病情指数× 100。 1.3.4 荧光定量 PCR 检测体系检测生防菌与病原菌的动态变化 于定植后的 0、 1、 3、 5、 7、 15 和 30 d 分别取样。取样时距南瓜茎基部横向距离及纵向深度均为 2 cm，三点取样后混合为 1 份样品，而后用锡箔纸包裹快速冻干。称取 0.2 g 样品，采用离心柱型土壤基因组 DNA 提取试剂盒提取 DNA。分别利用已建立的RTPCR 检测体系检测土壤样品中短密木霉菌 31636 及辣椒疫霉菌 LJ12010805（ Y 41.026 3.7026X）19的动态变化。 根据以下公式分别计算供试菌株的平均分子质量和样品拷贝数20： M（ n× mw） /AN，其中， n 表示基因组包含的碱基数目（× 106bp）， mw 表示单个碱基的平均分子质量（ 660 g/mol）， AN 表示阿伏伽德罗常数（ 6.023× 1023molecules/mol）， M 表示基因组的平均分子质量。 N C/M，其中， N 表示样品的拷贝数， C 表示 DNA 浓度， M 表示基因组 DNA 的平均分子质量。 2 结果与分析 2.1 短密木霉菌 31636 荧光定量 PCR 检测体系的建立 2.1.1 短密木霉菌 31636 PCR 引物设计及特异性验证 采用引物 TB51F/51R（其序列为 TB51F：5CTTCAAGTATGCGTGGGT3， TB51R： 5GCGTCTGCGTGAGGTT3）进行 PCR 扩增，仅短密木霉菌 31636 DNA 在 180 bp 处有特异性扩增，其他对照菌株和阴性对照均无扩增条带（图 1），表明引物特异性良好。且所用序列在 GeneBank 比对，与其他种属菌株均无同源性。 注： 1 2 为短密木霉菌 T. brevicompactum； 3：哈茨木霉菌 T. harzianum； 4：拟康宁木霉菌 T. koningiopsis； 5：绿色木霉菌 T. viride； 6：灰葡萄孢菌 B. cinerea； 7：立枯丝核菌 R. solani； 8：茄病镰刀菌 F. solani； 9：瓜果腐霉菌 P. aphanidermatum； 10：致病疫霉菌 P. infestans； 11：尖孢镰刀菌F. oxysporum； 12：辣椒疫霉菌 P. capsici； N：阴性对照 ddH2O Negative control ddH2O 图 1 短密木霉菌引物特异性普通 PCR 筛选结果 Fig. 1 The screening result of T. brevicompactum specific primer by normal PCR 2.1.2 荧光定量 PCR 检测短密木霉菌 31636 引物特异性 引物 TB51F/51R 对短密木霉菌 31636DNA 扩增良好（图 2），溶解曲线在 85 处有单一峰值（图 3），无非特异性扩增及引物二聚体现象。 2.1.3 普通 PCR 和荧光定量 PCR 检测引物灵敏度 将质粒 DNA 稀释为 1.6× 105 pg/L 1.6× 104 pg/L的浓度梯度，并分别进行普通 PCR 和 RTPCR 扩增。扩增结果表明， TB51F/51R 及所建立的 PCR 反应体系对 16pg/L 1.6× 104 pg/L 浓度范围的 DNA 有扩增，即普通 PCR 的灵敏性为 16 pg/L（图 4）；而RTPCR 对 0.16pg/L 1.6× 104 pg/L 浓度范围的 DNA 均有扩增，即 RTPCR 检测引物的灵敏性为0.16 pg/L（图 5）。 RTPCR 较普通 PCR 灵敏度高 100 倍。 2.1.4 短密木霉菌 31636 荧光定量 PCR 标准曲线建立 将重组质粒 DNA 以 10 倍梯度稀释制备标准品，稀释浓度分别为 1.6× 103 pg/L 1.6× 104 pg/L，以不同稀释倍数的 DNA 为模板，构建 RTPCR 标准曲线。以质粒 DNA 浓度的对数为横坐标，反应循环数（ CT）值为纵坐标绘制标准曲线（图 6）。得到该体系线性关系良好（ Y 3.5854X 35.608），相关系数 R2值 0.98，扩增效率 90.07%。 578 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 Rn图 2 荧光定量 PCR 检测引物特异性（扩增曲线） Fig. 2 Detection of primer-specific by RT-PCR (Amplification curve) 荧光强度变化-RnDerivative reporter0.050.100.150.400.200.250.300.35065 7075 8085 90 95温度 Temperature ( )短密木霉菌T. brevicompactum对照菌株Control (ddH2O)图 3 荧光定量 PCR 检测引物特异性（溶解曲线） Fig. 3 Detection of primer-specific by RT-PCR (Melt curve) N109 87 6543 21M250 bp100 bp注： M， BM 5000 DNA Marker，从右向左 1 4 分别为 1.6× 104 1.6× 10pg/µL，编号 5 10 及阴性对照无扩增现象。 Note: M, BM 5000 DNA Marker; From right to left, 1 4 concentrations were 1.6× 104pg/L to 16 pg/L, with no amplification of numbers 5 10 and negative control. 图 4 普通 PCR 检测引物灵敏性 Fig. 4 Sensitivity of normal PCR using the TB51F/51R primer pair Rn注：从左向右 1 6 分别为浓度 1.6× 104 1.6× 101 pg/µL， 7 10 及阴性对照无扩增现象。 Note: From left to right, 1 6 concentrations were 1.6× 104 1.6× 101 pg/µL, with no amplification of numbers 7 10 and negative control. 图 5 荧光定量 PCR 检测引物灵敏性 Fig. 5 Sensitivity of RTPCR using the TB51F/51R primer pair 2.2 短密木霉菌 31636 与辣椒疫霉菌在南瓜根际的动态分析 2.2.1 短密木霉菌 31636 对南瓜疫病的防治效果 采用短密木霉菌 31636 菌悬液 10 mL 拌土育苗对南瓜疫病的防效最好（表 2）。定植后第 15 d、 30 d 时防治效果分别为 75.63%和 46.82%，且均显著优于其他处理（ P 0.05）。 第 4 期 谢学文等：短密木霉菌 RTPCR 检测体系的建立及其在南瓜根际的动态分析 579 Y = -3.5854X+35.608R2= 0.982805101520253035-6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1DNA浓度对数 LogDNA循环数CT图 6 短密木霉菌 31636 荧光定量 PCR 标准曲线 Fig. 6 Real-time fluorescence quantitative standard curve of T. brevicompactum 31636 表 2 短密木霉菌 31636 防治南瓜疫病的盆栽试验结果 Table 2 The result of the pot experiment that using T. brevicompactum 31636 to control pumpkin Phytophthora blight 防治效果 Control effect (%) 编号 Number 处理 Treatment 浓度 Concentration 第 15 d The 15th day 第 30 d The 30th day 1 短密木霉菌 T. brevicompactum 10 mL 1× 108 cfu/mL 75.63 a 46.82 A 2 短密木霉菌 T. brevicompactum 20 mL 1× 108 cfu/mL 50.42 b 8.09 D 3 短密木霉菌 T. brevicompactum 30 mL 1× 108 cfu/mL 49.58 c 8.67 C 4 50%烯酰吗啉 dimethomorph WP 250 ppm 50.42 b 27.17 B 注：同列不同字母表示经 LSD 法检验在 0.05 水平差异显著。 Note: Different letters in the same column indicated significant difference at 0.05 levels by LSD test. 2.2.2 荧光定量 PCR 检测体系检测生防菌与病原菌的动态分析 南瓜育苗时采用拌土法接种短密木霉菌31636 菌悬液，待南瓜长至适当株高后将其定植于装有已接种辣椒疫霉菌 LJ12010805 菌土的营养钵中，于定植后的 0、 1、 3、 5、 7、 15 和 30 d 分别取样，检测土壤中短密木霉菌 31636 及辣椒疫霉菌 LJ12010805菌量的动态变化。结果表明，南瓜定植时短密木霉菌 31636 及辣椒疫霉菌 LJ12010805 的起始拷贝数分别为 1.36× 104 copys/L 和 9.98× 103copys/L，此后短密木霉菌 31636 菌量呈现减 增 减的动态变化趋势，第 15 d 时菌量最大，拷贝数为 3.44× 106 copys/L；处理组辣椒疫霉菌 LJ12010805 第 3 d 菌量最大，拷贝数为 2.42× 106 copys/L，第 15 d 时达到最低，拷贝数相应地减小到 5.76× 102 copys/L。而对照的辣椒疫霉菌 LJ12010805 菌量则呈一直增加的趋势，监测的第 30 d 拷贝数最大，为 8.42× 107 copys/L（图 7）。 拷贝数对数值log copy number图 7 RTPCR 监测南瓜根际土中短密木霉菌 31636 与辣椒疫霉菌 LJ12010805 动态变化 Fig. 7 The dynamic changes of population of T. brevicompactum 31636 and P. capsici LJ12010805 in pumpkin rhizosphere soil monitored by RTPCR 580 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 3 讨论 木霉菌属半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科，其具有较高的几丁质酶活性、生长繁殖能力强、适应性强。据部分资料统计，其寄生范围至少涵盖植物病原菌的 18 个属中的 29 个种21，对黄瓜枯萎病、立枯病22、水稻纹枯病23，中药材根腐病24、马铃薯晚疫病25等防效很好。目前国内外学者对拮抗木霉菌的研究，大多集中在哈茨木霉菌、绿色木霉菌等少数种，且大田应用中效果极不稳定，而本研究中报道的短密木霉菌26对南瓜疫病的防治效果在 15 d 和 30 d 时分别高达 75.63%和 46.82%， 可以进一步应用于农业生产上南瓜疫病的防治。 众所周知，深入研究土壤中生防菌和病原菌的互作及种群生态学变化，对发展植病生防理论和进一步提高生防菌的防效具有重要意义27。然而，长期以来，由于缺乏快速、灵敏、准确的定量测定方法，这方面的研究始终受到阻碍，且不能及时反映出植物根际土中病原菌与生防菌的同期数量变化。近年来，荧光定量 PCR 检测技术已广泛应用于土壤中生防菌与病原菌的动态监测28-30。本研究中，通过设计并筛选出短密木霉菌 31636 特异性引物 TB51F/51R， 首次建立其荧光定量 PCR 检测体系， 且检测下限低至 0.16 pg/µL，较普通 PCR 而言灵敏度提高了 100 倍， 可实现土壤中短密木霉菌 31636 的快速、 特异、 准确且定量的检测，为后期其动态变化监测提供技术支撑。 利用所建立的 RTPCR 检测体系监测土壤中生防菌与病原菌的动态变化，分析表明 30 d 内南瓜根际基质土中的短密木霉菌 31636 菌量呈现减 增 减的动态变化过程，且第 15 d 时菌量达到最大值，这与这与张衡宇31关于哈茨木霉菌（菌株编号为 FJAT9295）接种后 4 d 开始在土壤中定殖，从第 16 d 起其优势力逐渐降低，数量逐渐减少的报道相一致。结合盆栽试验，短密木霉菌 31636 与辣椒疫霉菌 LJ12010805 菌量分别达到最大、最小值时防效为 75.63%，而后随着短密木霉菌 31636 与辣椒疫霉菌 LJ12010805 的互作消长变化，防效也逐渐削弱至第 30 d 的 46.82%，这与之前关于哈茨木霉菌 SH2303 防治玉米小斑病的持效期仅为 15 d32，哈茨木霉菌 PSn86 防治人参灰霉病第 14 d 时防效最高33，后逐渐降低的研究结果相吻合。因此可以利用荧光定量 PCR 检测体系测得土壤中生防菌与病原菌的 DNA 拷贝数后推测生防菌的防效，从而为其田间应用提供理论参考。 参 考 文 献 1 Elmer W H. Fusarium fruit rot of pumpkin in ConnecticutJ. Plant Disease, 1996, 80(2): 131. 2 Lamour K H, Stam R, Jupe J, et al. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsiciJ. Molecular Plant Pathology, 2012(13): 329-337. 3 刘学敏 , 刘昌洲 . 接种体和接种部位对南瓜疫病接种效果的影响 J. 植物保护学报 . 1999, 26(1): 95-96. 4 Kousik C S, Donahoo R S, Hassell R. Resistance in watermelon rootstocks to crown rot caused by Phytophthora capsiciJ. Crop Protection, 2012, 39(5): 18-25. 5 Hagn A, Wallisch S, Radl V, et al. A new cultivation independent approach to detect and monitor common Trichoderma species in soilsJ. Journal of Microbiological Methods, 2007, 69(1): 86-92. 6 Davey C B, Papavizas G C. Comparison of methods for isolating Rhizoctonia from soilJ. Canadian Journal of Microbiology, 1962, 8(6): 847-853. 7 Papavizas G C. Ecology and epidemiology of Rhizoctonia solani in soilJ. Phytopathology, 1975, 65(8): 871-877. 8 Ahc V B, Ameson P A. Quantitative recovery of Rhizoctonia solani form soilJ. 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