苏云金芽胞杆菌Vip3Aa11蛋白C端点突变对其杀虫活性的影响_雒国兴.pdf

34(1)79-85 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2018年 2 月 收稿日期： 2017-01-29 基金项目： 国家自然科学基金（ 31401812）；国家重点研发计划（ 2017YFD0201201）；黑龙江自然科学基金（ C2016025）；植物病虫害生物 学国家重点实验室开放基金（ SKLOF201705） 作者简介： 雒国兴， 硕士研究生 ， E-mail： 15765534169163.com； *通信作者，研究员， E-mail： jzhangippcaas.cn。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.01.009 苏云金芽胞杆菌 Vip3Aa11蛋白 C端点突变 对其杀虫活性的影响 雒国兴 1，刘荣梅 1，李海涛 1,2，张金波 1，高继国 1，张 杰 1,2* （ 1. 东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030； 2. 中国农业科学院植物保护研究所 /植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193） 摘要： 为 研究 Vip3Aa11 羧基 端对其杀虫活性和敏感性的影响，本研究利用定点突变技术构建了 Vip3Aa11的 3 个突变体 S543N、 D547E 和 T681V。经 SDSPAGE 分析证实 3 个 突变体蛋白均能在大肠杆菌中表达分子量约 88 kD 的目的蛋白，生物活性测定显示，与 Vip3Aa11 相比，突变体 S543N 对甜菜夜蛾 Helicoverpa armigera 的杀虫活性提高了 5 倍。突变体 D547E 对甜菜夜蛾杀虫活性 显著 降低。 突变体 S543N、 D547E和 T681V对棉铃虫 Spodoptera exigua 的杀虫活性无明显变化 。 说明 Vip3Aa11 C 端部分氨基酸的定点突变对其杀虫活性有影响，且对不同害虫的杀虫活性变化趋势不同。本研究 比较了 Vip3Aa11 蛋白与突变蛋白之间杀虫活性的差异，为研究 Vip3Aa 类蛋白的结构和机理奠定基础。 关 键 词： 苏云金芽胞杆菌；营养期杀虫蛋白；定点突变；活性分析 中图分类号： S476.12 文献标识码： A 文章编号： 1005-9261(2018)01-0079-07 The Influence of C-terminus Site-directed Mutation on the Toxicity of Bacillus thuringiensis Vip3Aa11 Protein LUO Guoxing1, LIU Rongmei1, LI Haitao1,2, ZHANG Jinbo1, GAO Jiguo1, ZHANG Jie1,2* (1. College of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests/Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China) Abstract: Vegetative insecticidal proteins (VIPs) of Bacillus thuringiensis show a wide insecticidal spectrum against a wide variety of lepidopteran pests. The insecticidal activity and specificity of the Vip3Aa protein derived from different Bt strains are highly different, although the similarities between these proteins are higher than 95%. To determine whether the residues from the Vip3Aa11 C-terminus contribute to the insecticidal activity, three mutants (S543N, D547E and T681V) of Vip3Aa11 were constructed by site directed mutagenesis. Through SDS-PAGE, the mutants produced a 88 kD fusion protein, indicating that all mutants had successful expression in E. coli. Bioassay detection indicated that the insecticidal activity of the S543N mutant against Spodoptera exigua increased obviously, and the LC50 value was approximately 5-fold higher than that of the Vip3Aa11, while the activity of D547E mutant against S. exigua decreased obviously. The activities of all the mutants against Helicoverpa armigera had no obvious changes. The results indicated that the site directed mutagenesis of some amino acids from Vip3Aa11 C terminus had an effect on insecticidal activity, and the effect was not consistent against different Lepidopteran pests even in the same mutant. In this study, the differences of insecticidal activity between Vip3Aa11 and mutant proteins serve a guideline for the study of Vip3Aa protein structure and activity mechanism. Key words: Bacillus thuringiensis; vegetative insecticidal proteins; site directed mutation; activity 80 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 近年来，鳞翅目害虫的啃食导致农作物大量减产 1,2。且随着苏云金芽胞杆菌 Bacillus thuringiensis（简称 Bt） 内毒素 在 微生物 工程菌和转基因抗虫植物中的广泛应用，导致 一些 昆虫对 Bt 杀虫蛋白 产生耐药性以及抗性 3-5。营养期杀虫蛋白（ Vip）是由苏云金芽胞杆菌产生的一种新型杀虫蛋白，与目前研究较为深入的 Cry 蛋白相比， Vip3Aa 蛋白在营养生长期就开始分泌，且并不形成晶体；在氨基酸序列的进化上与 Cry 没有同源性；杀虫作用位点与 Cry 蛋白也无竞争关系； Vip3Aa 蛋白结构尚未解析，杀虫作 用机制的研究相对滞后 6-10。 近些年有关 Vip3Aa 蛋白的突变研究较多，且研究表明 Vip3Aa 蛋白上某些氨基酸区域与其杀虫活性及特异性有关。如 Selvapandiyan 等 11将 Vip3Aa 蛋白 N 端的 39 个氨基酸残基缺失，则显著降低了其对斜纹夜蛾 Spodoptera litura（ Fabricius） 的毒力，而 C 端的 154 个氨基酸残基缺失导致 Vip3Aa 蛋白对斜纹夜蛾完全丧失毒力，对蛀茎斑螟 Chilo Partellus 的毒性轻微下降。相比之下， Gayen 等 12研究表明 Vip3Aa N 端的 200 个氨基酸缺失，导致对棉铃虫 Helicoverpa armigera（ Hübner） 、海灰翅夜蛾 Spodoptera littoralis（ Boisduval） 、小地老虎 Agrotis ipsilon（ Hufnagel）和三化螟 Tryporyza incertulas（ Walker） 的杀虫活性增强了 2 3 倍，而 C 端的 200 个氨基酸缺失，则维持了对棉铃虫和小地老虎较低水平的杀虫活性。 Dong等 13用丝氨酸（ Ser）取代位于 Vip3Aa7 蛋白 62 kD 核心功能区 292、 507 和 401 位点的 3 个高度保守的半胱氨 酸（ Cys）残基， 3 个突变蛋白 C292S、 C401S 和 C507S 对小菜蛾 Plutella xylostella（ Linnaeus）的杀虫活性降低或者丧失。 Liu 等 14利用定点突变技术，成功构建了 Vip3Aa11 的氨基端 9 个突变蛋白，获得了甜菜夜蛾杀虫活性提高的突变蛋白 1 个（ S193T）。对棉铃虫杀虫活性提高的突变蛋白 3 个（ S9N、S193T、 S194L）。 上述研究结果充分说明了 Vip3Aa 蛋白的 N 端和 C 端对于杀虫活性的发挥起到了举足轻重的作用。 基于 Vip3Aa11 和 Vip3Aa39 蛋白氨基酸序列之间仅 存在 39 个氨基酸差异，而 2 种蛋白的杀虫活性却存在很大的差异 14。本研究利用定点突变技术构建了 Vip3Aa11蛋白的 3个突变体 S543N、 D547E和 T681V，进 行了 3 个突变体 对 甜菜夜蛾和棉铃虫的生物活性测定，研究 Vip3Aa11 C 端单个氨基酸的改变对其杀虫活性的影响。 本文 为研究 Vip3 毒素的蛋白结构和功能的关系提供线索。 1 材料与方法 1.1 菌株和质粒 试 验所用菌株与质粒详见表 1。 表 1 菌株与质粒 Table 1 Strains and plasmids 菌株与质粒 Strains and plasmids 特点 Characteristics 大肠杆菌 Escherichia coli BL21 F-ompT hsdSB (RB- mB-) gal dcm DE3 (lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5) pLysSRARE (CamR) 质粒 Plasmids pET28a E. coli expression vector, KmR 质粒 Plasmids pET3Aa11 Vector pET28a carrying vip3Aa11 gene, KmR 1.2 引物 参考 GenBank 公布的已知 vip3Aa11 基因序列，设计全长引物 V3F/V3R。构建单点突变体引物 3 对如表 2。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.3 供试昆虫 供试昆虫甜菜夜蛾 Spodoptera exigua（ Hübner） 及棉铃虫 初孵幼虫及饲养生测饲料 均购自河南省济源白云实业有限公司。 供试昆虫在上海一恒科技有限公司生产的人工气候箱里进行饲养及生物活性测定。 1.4 酶与生化试剂 突变试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；质粒提取试剂盒 购自 Axygen 公司； DNA marker 购自北京康为世纪生物科技有限公司； Taq Mix 聚合酶和蛋白 Marker 均购自 TaKaRa 公司；抗生素购自纳川生物技术公司；其 他 试剂均为市售国产或者进口分析纯或电泳级纯化学试剂。 第 1 期 雒国兴 等 ： 苏云金芽胞杆菌 Vip3Aa11 蛋白 C 端点突变对其杀虫活性的影响 81 表 2 PCR 鉴定引物及突变引物序列 Table 2 PCR primers used for identification and mutation 引物编号 Primer number 序列 Sequence 53 V3F ATGAACAAGA ATAATACTAA ATTAAGC V3R CTACTTAATA GAGACATCGT AAAAATGTAC vip3Aa11S543NF ATTGTAGAGAACGGGAACATAGAAGAGG vip3Aa11S543NR TTCCCGTTCTCTACAATATTGCTAATAAA vip3Aa11D547EF GTCCATAGAAGAGGAAAATTTAGAGCC vip3Aa11D547ER TTCCTCTTCTATGGACCCGTTCTCTA vip3Aa11T681VF CCAGAATTAATTAATGTAAATAATTGG vip3Aa11T681VR ACATTAATTAATTCTGGACTTAATAAC 1.5 PCR 克隆突变体 以 携带 vip3Aa11 基因的 pET28a 载体的 Vip3Aa11 质粒为模板，利用 Fast Alteration DNA Polymerase进行 PCR 扩增，获得的带有缺口的突变质粒再用 Dpn1 消化掉甲基化的模板质粒，获得扩增得到的突变质粒，最后转入受体菌后突变质粒的缺口得以修复，从而进行复制。 1.6 序列测定及分析 将阳性克隆送往吉林省库美生物科 技有限公司进行全长测序， DNAMAN 软件分析测序结果正确后，对正确重组转化子进行诱导及蛋白的表达。 1.7 vip3Aa11 及 突变体基因在大肠杆菌中表达 筛选出的阳性转化子转化到大肠杆菌 BL21（ DE3） 中进行 IPTG 诱导表达，收集诱导物，离心，弃上清，用 20 mmol/L TrisHCl（ pH 8.0） 缓冲液悬浮细胞并进行超声波破碎，取样，进行 SDSPAGE 分析。大肠杆菌质粒 DNA 提取、酶切、连接、转化， SDSPAGE 电泳检测方法参照文献 15。 1.8 生物活性测定 室内杀虫活性测定 ， 称取 30 g 人工饲料于培养皿中，与 3 mL 蛋白样品混合均匀，均匀的分装 24 孔板中，选取健康的、未经取食的初孵幼虫（孵化后 12 h 内）作供试虫，用软毛笔轻轻地将它们移入已有感染饲料的小孔内，每孔 1 头虫，每个处理重复 3 次，铺上湿润卫生纸后盖上塑料盖，用橡皮筋捆紧，竖立放入 30 （棉铃虫）或 25 （甜菜夜蛾）生化培养箱中，培养 7 d 后调查活虫数。 初筛饲料混合蛋白质浓度：甜菜夜蛾 20 µg/mL 和棉铃虫 40 µg/mL； LC50测定选用 6 个浓度梯度，至少 4 个浓度试虫死亡率小于100%。 光周期 14L:10D， 相对 湿度 65%。培养 7 d 后分别调查死、活虫数，计算死亡率，以及利用 SPSS 24软件分析 杀虫 蛋白的致死中浓度（ LC50） ，生物活性测试试验重复 3 次测试 。 1.9 Vip3Aa11 及 突变体蛋白对胰蛋白酶的敏感性分析 用 20 mmol/L 的 PBS（ pH 8）替代 20 mmol/L TrisHCl 重提蛋白。每个蛋白与 0.1 mg/mL 的胰蛋白酶按质量比 10:1（蛋白质 :胰蛋白酶）混匀， 37 水浴中孵育 30 min；孵育后每个反应体系加入相应体积的3× 上样缓冲液终止反应；用 8%分离胶分离蛋白样，以不经胰蛋白酶消化的 Vip3Aa11 蛋白样品做为对照，以上消化反应重复 3 次。 2 结果与分析 2.1 突变基因的鉴定与蛋白表达 以连有 pET28a 载体的 Vip3Aa11 质 粒 为 模 板 ， 利 用 突 变 引 物 vip3Aa11S543NF 和vip3Aa11S543NR，通过 PCR 扩增，将 Vip3Aa11 蛋白氨基酸序列中 543 位点的丝氨酸（ Ser）突变为天冬酰胺（ Asn）；同样利用突变引物 vip3Aa11D547EF 和 vip3Aa11D547ER，通过 PCR 扩增，将 Vip3Aa11蛋白氨基酸序列中 547 位点的天冬氨酸（ Asp）突 变为谷氨酸（ Glu）；利用突变引物 vip3Aa11T681VF和 vip3Aa11T681VR，通过 PCR 扩增，将 Vip3Aa11 蛋白氨基酸序列中 681 位点的苏氨酸（ Thr）突变为缬氨酸（ Val）。将扩增获得的突变质粒转入受体菌，利用全长引物 V3F 和 V3R 进行 PCR 突变基因的 82 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 鉴定， DNA 核酸电泳检测结果如图 1 所示。 鉴定结果显示 3 个突变体均可以检测到 2370 bp 的目的条带，说明阳性克隆子中含有 vip3Aa11 基因或其突变基因。利用 DNAMAN 对测序结果与原序列进行比对，结果显示已经成功构建了连 有载体的突变基因 ， 并将突变体分别命名为 S543N、 D547E 和 T681V。 突变体转入大肠杆菌 BL21（ DE3） 感受态细胞后，进行 IPTG 诱导表达，以 SDSPAGE 检测可溶性蛋白 （图 2） 。结果表明 Vip3Aa11 与 3 个突变体蛋白均只在大肠杆菌中正常表达分子量约为 88 kD 的可溶蛋白。 5 0 0 0b p3 0 0 02 0 0 01 0 0 07 5 05 0 02 5 01 0 01 M C K M C K 2 3 4BAM： DNA marker； 1： vip3Aa11； 2： S543N； 3： D547E； 4： T681V；CK： 阴性对照 Negative control 图 1 vip3Aa11（ A） 和突变基因 （ B） 的 PCR 鉴定图谱 Fig. 1 Identification results of vip3Aa11 (A) and mutation genes (B) by PCR 8 8 k D2 0 0k D1 1 69 7 . 26 6 . 42 9M 1 C K 2 3 4M： Protein marker； CK： pET28a-BL21； 1： Vip3Aa11； 2： S543N； 3：D547E； 4： T681V 图 2 vip3Aa11 和突变体基因在 BL21（ DE3） 中表达 Fig. 2 Expression of vip3Aa11 and mutant genes in the BL21 (DE3) 2.2 生物活性分析 利用棉铃虫和甜菜夜蛾 2 龄幼虫对 Vip3Aa11 和突变体蛋白进行初筛生物活性测定，其校正死亡率如表 3。 Vip3Aa11 蛋白对甜菜夜蛾具有高的杀虫活性，而相比于 Vip3Aa11 蛋白突变体蛋白 S543N 对甜菜夜蛾的杀虫活性有显著的提高， D547E 蛋白活性有所降低，活性降低 57.7%， T681V 蛋白的杀虫活性没有改变。 3 个突变体蛋白对棉铃虫的杀虫活性与 Vip3Aa11 蛋白相比没有显著的变化 （ 表 3） 。 进一步配制 5、 10、 15、 23.5、 30、 40 g/mL的 Vip3Aa11 蛋白液；配制 1.35、 2.5、 5、 10 和 20 g/mL的 S543N 蛋白液；对 Vip3Aa11 蛋白和突变体蛋白 S543N 进行甜菜夜蛾的致死中浓度 LC50 的测定。Vip3Aa11 蛋白对甜菜夜蛾具有高的杀虫活性，其 LC50为 18.399 g/mL，而突变体蛋白 S543N 的 LC50为 3.614 g/mL，其 LC50 降低了 5 倍，说明突变体蛋白 S543N 对甜菜夜蛾的杀虫活性有了显著的提高（ 表 4） 。 表 3 Vip3Aa11 和突变体蛋白对甜菜夜蛾和棉 铃虫的生物活性 （ 7 d） Table 3 Bioassay results of Vip3Aa11 and mutant proteins against H. armigera and S. exigua (7 d) 蛋白 Protein 校正死亡率 Corrected mortality rate (%) 甜菜夜蛾 S. exigua (20 µ g/mL) 棉铃虫 H. armigera (40 µ g/mL) Vip3Aa11 74.25 38.55 S543N 100* 37.12 D547E 31.41* 35.69 T681V 74.25 37.12 注： *表示数值与 Vip3Aa11 原蛋白之间有显著差异， P 0.05。下同。 Note: * there is significant differences between the mutant proteins and Vip3Aa11 protein, P 0.05. The same below. 第 1 期 雒国兴 等 ： 苏云金芽胞杆菌 Vip3Aa11 蛋白 C 端点突变对其杀虫活性的影响 83 表 4 Vip3Aa11 和突变体蛋白对甜菜夜蛾的致死中浓度 Table 4 Further bioassay results (at 7 d) of Vip3Aa11 and S543N protoxin against S. exigua 蛋白样品 Samples LC50 (g/mL) 95%置信限 Confidence limits Vip3Aa11 18.399 14.7 22.1 S543N 3.614* 2.123 4.974 2.3 Vip3Aa11 及 突变体蛋白对胰蛋白酶的敏感性分析 将经超声波破碎处理后的 S543N、 3D547E、 4T681V和 Vip3Aa11 蛋白样品与 0.1 mg/mL 的 胰蛋白酶 按质量比 10:1（蛋白质 :胰蛋白酶）的比例反应，并对原毒素和消化产物进行 SDSPAGE 电泳检测 （ 图3） 。 SDSPAGE 结果显示， Vip3Aa11 和突变体蛋白经胰蛋白酶消化后均可形成大小约 62 kD 的抗性多肽。 8 8 k D6 2 k D2 0 0k D1 1 69 7 . 26 6 . 44 4 . 3M 1 2 M 3 4 M 5 6 M 7 8M： Protein marker； 1： Vip3Aa11 protoxin； 2： Vip3Aa11 toxin； 3： S543N protoxin； 4： S543N toxin； 5： D547E protoxin； 6： D547E toxin； 7： T681V protoxin； 8： T681V toxin 图 3 SDSPAGE分析 胰蛋白酶 消化 Vip3Aa11 和突变体蛋白结果 Fig. 3 SDSPAGE analysis of the trypsin digestion products of the Vip3Aa11 and mutant proteins 3 讨论 Vip 杀虫蛋白是由 Estruch 等 17从苏云金芽胞杆菌 AB88 上清液中发现的，该类蛋白已被证明对多种鳞翅目害虫具有杀虫活性 18,19。而对于 Vip3A 蛋白的杀虫机制的研究甚少。有 研究显示， Vip3 的 N 端片段是高度保守的，而 C 末端具有可变性 20。虽然 Vip3A 类蛋白同源性很高，然而他们有不同的杀虫谱。例如 Vip3Aa11 和 Vip3Aa39 仅有 39 个氨基酸的差异，然而其杀虫活性存在很大差异 ， 用两种蛋白的表达产物分别进行了对小地老虎、小菜蛾、棉铃虫和甜菜夜蛾的杀虫活性测定，结果表明 Vip3Aa39 对小地老虎有较高的杀虫活性， LC50为 5.43 g/mL，而 Vip3Aa11 的 LC50为 73.62 g/mL； Vip3Aa39 对小菜蛾也具有一定的杀虫活性， LC50为 140.64 g/mL，而 Vip3Aa11 对小菜蛾杀虫活性几乎没有； Vip3Aa11 对棉铃虫具有一定的杀虫活性， LC50为 35.18 g/mL，而 Vip3Aa39 的 LC50仅为 286.99 g/mL； Vip3Aa39 和 Vip3Aa11均对甜菜夜蛾具有相近的高毒力， LC50分别为 2.0 和 2.04 g/mL14。研究表明，在 Vip3Aa 蛋白的 C 端氨基酸突变显著影响蛋白对不同鳞翅目害虫的杀虫活性 。 因此，随机从 Vip3Aa11 羧基端挑选了 3 个不同的氨基酸残基（ Ser543、 Asp547 和 Thr681），并利用定点突变技术， 将这些氨基酸分别突变为 Vip3Aa39 对应位点上的氨基酸（ Asn543、 Glu547和 Val681）。最后通过观察突变体杀虫活性的变化，研究这些氨基酸的改变对其杀虫活性的影响。 与 Vip3Aa11 蛋白相比，同一突变体蛋白对不同试虫的毒力变化趋势不尽相同。突变体 S543N 对甜菜夜蛾的杀虫活性明显增加，而对棉铃虫的毒性稍有降低。这表明， Vip3Aa11 对甜菜夜蛾和棉铃虫的杀虫机理可能不同，同时也表明 Vip3Aa11 的第 543 位氨基酸可能是该蛋白对这试虫产生杀虫活性改变的关键位点。 Ser543Asn 543 的改变仅 将丝氨酸 CH2OH 侧链变成了 CH2CONH2 侧链，且丝氨酸和天冬酰胺均属于极性不带电的中性氨基酸。 然而这一改变却导致其对甜菜夜蛾的毒杀能力显著增强，说明该位点的84 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 丝氨酸（ Ser）的改变可能是导致活性发生变化的主要原因。 Dong 等 13研究表明 Vip3Aa7 蛋白活性区的半胱氨酸（ Cys） 被 丝氨酸（ Ser）取代 后 ， 会导致其对小菜蛾的毒性降低 。因此在研究 Vip3Aa 蛋白结构和杀虫机理中，丝氨酸可能起到至关重要的作用。而对于本研究中的 D547E 突变体蛋白对甜菜夜蛾的杀虫活性降低现象也表明： Vip3Aa11 蛋白的第 547 位氨基酸可能也是该蛋白对甜菜夜蛾产生杀虫活性的一个关键氨基 酸。而 T681V 蛋白对甜菜夜蛾的杀虫活性与 Vip3Aa11 蛋白相比没有改变 ， 说明该位点可能不是该蛋白对该试虫产生活性关键位点。同 时 研究发现 S543N、 D547E 和 T681V 3 种蛋白对棉铃虫的杀虫活性与 Vip3Aa11 蛋白相比并没有显著的变化，说明这 3 个突变位点可能不参与 Vip3Aa11 蛋白对棉铃虫的杀虫活性。 研 究表明， Vip3Aa经不同的鳞翅目昆虫中肠液处理主要产生 4种片段，大小分别为 22、 33、 45和 66 kD2 1。且 进一步的研究发现， 62 kD 的片段是原毒素被消化后的主要产物，因而该片段被视为原毒素的活性形式 22,23。 此外另一项研究显示，只有 62 kD 的片段可与棉铃虫的 BBMV 特异结合 25。本研究中 Vip3Aa11和突变体蛋白经胰蛋白酶消化后均可被活化形成大小约 62 kD 的核心多肽（图 3）。因此， 62 kD 片段的形 成可能是保证 Vip3Aa 蛋白杀虫活性的必要条件。 蛋白质的杀虫活性受许多不同的因素影响，如蛋白质的氨基酸序列 、 温度 、 pH26以及不同昆虫体内微生物和酶的数量和多样性等因素 27。 本研究中的 3 个 突变体蛋白在不同供试昆虫中的杀虫活性的不同说明Vip3Aa11 蛋白蛋白在甜菜夜蛾和棉铃虫中的作用方式以及受体可能不同， 且由于 Vip3Aa 蛋白结构尚未解析，因此， 3 个突变体杀虫活性改变的具体原因尚不清楚有待进一步研究。本研究筛选获得的对甜菜夜蛾具有高毒力的突变体 S543N，为进一步研究 Vip3A 蛋白的杀虫机理提供了一定理论基础， 为构建工程菌和转基植物提供遗传材料，同时也为对抗 Bt 产生耐性和抗性提供了菌株资源 。 参 考 文 献 1 Fitt G P. 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