丽蚜小蜂糖转运蛋白基因克隆及其诱导表达_刘贻聪.pdf

34(2)247-253 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2018 年 4 月 收稿日期： 2017-11-20 基金项目： 国家重点研发计划（ 2017YFD0200400）；国家现代化农业产业技术体系（ CARS-25）；国家自然科学基金（ 31572014）；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室基金 作者简介： 刘贻聪，硕士研究生， E-mail： yicongliu0829163.com； *通信作者，研究员， E-mail： wangshaolicaas.cn。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.02.011 丽蚜小蜂糖转运蛋白基因克隆及其诱导表达 刘贻聪，张友军，吴青君，谢 文，王少丽 * （中国农业科学院蔬菜花卉研究所 ， 北京 100081） 摘要： 丽蚜小蜂 Encarsia formosa Gahan是粉虱类害虫的重要寄生性天敌昆虫，补充糖分等营养可以延长丽蚜小蜂寿命及增加其产卵量，但对其糖转运相关蛋白基因及其糖诱导表达尚不清楚。本研究克隆获得丽蚜小蜂的糖转运蛋白 EfST1基因，与其他寄生蜂的糖转运蛋白基因序列同源性达 65%以上；进一步采用实时荧光定量 qPCR 技术检测发现，饲喂不同浓度的葡萄糖溶液均可显著提高 EfST1 基因的表达量，且饲喂不同时间段（ 2 48 h）后，丽蚜小蜂 EfST1基因表达量均显著高于对照组， 2 h和 48 h处理组间差异不显著。综上， EfST1 基因可能与糖分补充及其转运密切相关，该基因诱导表达受糖分浓度影响小。研究结果为进一步研究寄生蜂生物防治过程中补充营养及其转运机制奠定基础。 关 键 词 ： 丽蚜小蜂； 烟 粉虱； CODEHOP；糖转运蛋白基因；表达分析 中图分类号 ： S476.3 文献标识码： A 文章编号： 1005-9261(2018)02-0247-07 Cloning and Induced Expression of Sugar Transporter Gene in Parasitoid, Encarsia formosa Gahan LIU Yicong, ZHANG Youjun, WU Qingjun, XIE Wen, WANG Shaoli* (Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China) Abstract: Encarsia formosa Gahan is a kind of endoparasitoid world widely used for control of pest whiteflies. Sugar supplement prolong longevity and/or increase their egg production; however, the sugar transporter gene and the induced expression in E. formosa was unclear. In this present study, the sugar transporter gene named EfST1 was cloned; sequence alignment and phylogenetic analysis revealed that EfST1 shared more than 65% homology with other parasitoids. Real-time PCR showed that EfST1 was significantly expressed by feeding different concentrations of glucose. After feeding sugar for different periods (2 48 h) on 10% glucose, EfST1 gene expression was found to be increased compared to the water control. Besides, there were no significant differences between the 2 h and 48 h feeding treatments. In conclusion, the EfST1 gene was probably related to sugar supplement and transportation; and the gene expression induced by different sugar concentrations was not greatly fluctuated. The results will provide a basis for studying the nutrition supplement and transportation mechanism during the biological control of parasitoids. Key words: Encarsia formosa; Bemisa tabaci; CODEHOP; sugar transporter gene; expression analysis 丽蚜小蜂 Encarsia formosa Gahan 是粉虱类害虫的重要寄生性天敌昆虫，丽蚜小蜂除了可以取食烟粉虱 Bemisa tabaci 若虫外，还能以烟粉虱分泌的蜜露及花蜜作为食物来源。 2004 年，就有报道称粉虱分泌的蜜露可以延长丽蚜小蜂的寿命并促进卵子发育 1。研究表明，寄生蜂补充取食糖分之后其寿命及对靶标生物的寄生率等生物学特性也有提升 2， Williams 等 3测定了不同浓度和不同时间饲喂蔗糖后橄榄果蝇248 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 Bactrocera oleae 的寄生蜂 Psyttalia lounsburyi 寿命、糖分摄 入量和能量摄取，发现蔗糖浓度和喂饲时间对橄榄果蝇的寄生蜂的寿命有显著影响，糖分摄取量和能量摄取均可以显著增加。粉虱类害虫的另一个寄生蜂 桨角蚜小蜂 Eretmocerus eremicus，丽蚜小蜂和海氏桨角蚜小蜂 Er. hayati Zolnerowich Rose 也可以利用糖类来延长寿命和增加生殖率 4,5。 糖分等营养物质进入昆虫体内后，通过转运再被吸收利用。已经证明，刺吸式口器昆虫烟粉虱 Bemisia tabaci（ Gennadius） 以含有高浓度蔗糖的植株韧皮部汁液为营养物质，主要通过糖转 运蛋白使葡萄糖从肠道内进入细胞 6。褐飞虱 Nilaparvata lugens（ Stål） 体内糖转运基因 Nlst6 被干扰后，昆虫产卵前期显著性延长，卵期显著缩短，卵数量减少，虫体变小，脂肪体和卵巢的蛋白质含量和卵黄原蛋白基因表达量的减少，推测该 Nlst6 基因在褐飞虱生长发育、产卵等方面具有重要作用 7。糖转运蛋白不仅在糖的运转过程中起作用，在家蚕 Bombyx mori 中，发现它们还可作为家蚕核型多角体病毒 BmNPV 感染时的受体，因为糖转运蛋白只在易受感染的种群中被调节 8。进一步研究发现，豌豆蚜 Acyrthosiphon pisum（ Harris） 基因组中有 19 个糖转运基因，目前仅发现 ApST3 和 ApST4 基因承担着葡萄糖和果糖的运输 9；而褐飞虱种群中糖转运蛋白家族的 Nlst16 基因和 Nlst1 基因均在褐飞虱中肠中高表达，但 Nlst16 基因在褐飞虱取食 2 h 后被诱导表达升高，但 Nlst1 基因并未受到害虫取食的诱导而进行表达 10，说明生物体内有其特定的糖转运蛋白基因承担着糖分的吸收和运转。丽蚜小蜂种群繁育过程中需补充糖分提升其种群扩繁效率，但截止目前，尚无丽蚜小蜂糖转运蛋白基因及糖分摄入后的表达等 报道，限制了对丽蚜小蜂糖转运分子机理的深入研究，因此克隆丽蚜小蜂糖转运蛋白基因序列以及明确其在丽蚜小蜂体内的表达就成为重要基础。 本研究首先采用 CODEHOP（ Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers）在线软件 11，在线程序化设计简并引物，同源克隆丽蚜小蜂糖转运蛋白基因；然后利用实时荧光定量 PCR 技术研究该基因在不同浓度糖分及饲喂不同时间后在丽蚜小蜂成蜂体内的表达谱，研究结果将为进一步明确丽蚜小蜂对糖分吸收和转运机制提供坚实基础。 1 材料 与方法 1.1 供试丽蚜小蜂 丽 蚜小蜂蛹由山东省农业科学院植物保护研究所提供，在人工气候箱内烟粉虱若虫上繁育，烟粉虱若虫饲养在一品红 Euphorbia pulcherrima 上，培养条件为温度（ 26± 1） 、 相对湿度 60% 80%、 光周期 16L:8D。 1.2 软件与试剂 试验采用在线 CODEHOP（ http:/blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html/）和 Blockmaker 软件 （ Fred Hutchinson Cancer Research Center， USA） 。 感受态细胞（ Trans1-T1）和 T1 克隆载体（ pEASY-T1）均购自全式金生物技术有限公司。 RNA 提取试剂盒 TRIzol 购自 Invitrogen 公司；反转录试剂盒 PrimeScript II 和 LA Taq 聚合酶购自于北京六合通经贸有限公司（ TaKaRa）； PCR 产物纯化试剂盒购自北京康为世纪公司；荧光定量 PCR 试剂盒为天根生化科技 （ 北京 ） 有限公司生产的荧光定量预混试剂增强版 ； DNA Marker 购自于北京天根生化生物科技有限公司；葡萄糖购自于北京化工厂。 引物合成和序列测定委托北京擎科生物技术有限公 司进行。 1.3 简并引物设计 利用 CODEHOP（ Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers）软件设计简并引物。 以丽蝇蛹集金小蜂 Nasonia vitripennis（ Accession No: XP_008203106）为递交序列，再从 NCBI 数据库中选取 3 个代表性的昆虫糖转运蛋白基因序列作为引物设计的模板，它们分别是短管赤眼蜂 Trichogramma pretiosum Riley（ Accession No: XP_014233934）、普 通麦茎蜂 Cephus cinctus（ Accession No: XP_015604651）和传粉榕小蜂 Ceratosolen solmsi marchali（ Accession No: XP_011495920）。以 blockmaker12对这些序列进行块状比对，找出 14 块无间隙高度保守的氨基酸序列，最后将比对结果递交到 CodeHop 服务器进行运算 13，检索出几条昆虫糖转运蛋白基因的简并引物。检索主要设定参数为 最大核心简并度 （ Maximum core degeneracy） ：128；目标夹板区温度 （ Target clamp temperature） ： 60.0 ，密码子使用表 （ Codon usage table） : Apis mellifera。依据简并引物简并度尽可能小、 Tm 值尽可能高、上下游引物之距离尽可能大等原则选择引物。 第 2 期 刘贻聪 等 ： 丽蚜小蜂糖转运蛋白基因克隆及其诱导表达 249 1.4 丽蚜小蜂糖转运蛋白基因克隆 用 TRIzol 法提取丽蚜小蜂总 RNA，并以 Oligo dT 为引物反转录 cDNA，以上述设计的简并引物进行PCR 扩增。随后 PCR 扩增反应选用 Touch-down PCR 法进行：首先在 95 条件下预变性 5 min；然后 94 变性 30 s，从 65 下降到 50 退火 30 s，每个循环降低 1 ， 72 延伸 1 min，共 5 个循环；随后再94 变性 30 s， 55 退火 1 min， 72 延伸 1 min，共进行 25 个循环；最后在 72 延伸 10 min。 PCR 产物在 1.5%的琼脂糖凝胶上电泳检测。回收目的条带后与 pEASY-T1 载体连接过夜，转化感受态细胞， 37 条件下培养过夜，挑选白斑。经 M13 通用引物进行菌液 PCR 扩增，鉴定阳性克隆。取阳性克隆送交北京擎科生物技术有限公司测序，采用通用引物 M13 进行序列测定，测序结果输 GenBank 进行blastx 同源性比较。 1.5 丽蚜小蜂 EfST1 基因 系统进化分析 利用 GenBank 数据库已有的昆虫糖转运蛋白基因的氨基酸序列：黄翅菜叶蜂 Athalia rosae（ XP_012266479.1）；普通麦茎蜂（ XP_015604651）；红火蚁 Solenopsis invicta（ XP_011169177.1）；中华蜜蜂 Apis cerana（ XP_016910856.1） ；黄蜂 （ XP_015178798.1） ；苹果实蝇茧蜂 Diachasma alloeum（ XP_015108434.1） ；传粉 榕小蜂 （ XP_011495920.1） ；丽蝇蛹集金小蜂 N. vitripennis（ XP_008203106.1） ；短管赤眼蜂 （ XP_014233934.1） ， 采用 Clustalw 2.0 软件比较不同物种的 ST 氨基酸序列，并计算它们之间序列的相似性， 采用 MEGA 6.0 软件的邻接法（ Neighbour-Joining）构建了丽蚜小蜂 EfST1 序列与其他相近昆虫 ST 之间的系统进化树。 1.6 丽蚜小蜂 EfST1 基因的诱导表达 采集初羽化（ 24 h）的丽蚜小蜂雌蜂进行葡萄糖饲喂处理。第一，不同时间处理组，饲喂 10%葡萄糖2、 12、 24、 48 h； 第二，不同 浓度 处理组，小蜂分别饲喂 2 h，饲喂浓度依次为 1%、 5%、 10%、 15%、 20%；清水处理作为对照 。 丽蚜小蜂 EfST1 基因的 mRNA 表达采用荧光定量 PCR 反应测定，该 PCR 反应中所采用引物序列如下：正向： 5-CTTCATCTTCTGCGTGGCTA-3，反向： 5-TCTGTTCGTTCATGCGACGTT-3。PCR 反应体系为 5.0 L qPCR Mix， 5 mol/L 正反向引物各 0.5 L， 2.0 L cDNA 模板，用超纯水补到 10 L。实 时荧光定量 PCR 程序如下： 95 预变性 3 min； 95 20 s， 60 30 s， 72 35 s， 40 个循环。 选择丽蚜小蜂的 18S rRNA 作为参照基因，引物序列为：正向： 5-ATTCCATGCACACAGTATT CAGG-3，反向： 5-CGGCCCAACTAATATCCCGTC-3。 PCR 反应后进行熔解曲线分析，以排除非特异性 PCR 产物的污染。每个试验至少进行 4 个生物学重复， 4 个技术性重复。对所克隆的丽蚜小蜂糖转运蛋白基因的 mRNA 荧光定量表达结果用 ABI 7500 SDS v 1.4 软件（ Applied Biosystems， USA），采用 2 Ct方法进行数据记录和分析。 2 结果与分析 2.1 简并引物设计及其 PCR 扩增 根据 CODEHOP 程序运行结果，分别选取 3 条上游引物（ ST1-F、 ST2-F 和 ST3-F）和 3 条下游引物（ ST1-R、 ST2-R 和 ST3-R）进行配对及 PCR扩增，最后筛选出一对能够成功扩增出预期基因片段的简并引物。上游引物： 5-TGAGTCCACTGGTT GG ATTCttyg tna cnc c-3；下游引物： 5-AATACA GA CTATAACAAACATGTGCCatyc arc arm a-3。 简并引物 PCR 扩增后，得到一条高度特异性的PCR 产物，产物大小为 824 bp，与预期扩增产物大小一致（图 1）。 2.2 EfST1 基因的 序列 比对及进化树分析 PCR 产物的测序结果进行 blast 同源性比较， 800 bpM 1 2 3M： DNA Marker ； 12：丽蚜小蜂 RTPCR 扩增 RTPCR amplification of E. formosa； 3：空白对照 Negative control 图 1 简并引物 RT-PCR 扩增丽蚜小蜂的糖转运蛋白基因 Fig. 1 Sugar transporter gene in E. formosa by RT-PCR using degenerate primers 250 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 发现所 克隆的丽蚜小蜂 cDNA 序列所编码的氨基酸序列与 GenBank 上其他糖转运蛋白基因具有高度相似性 ，特别是与其他寄生性天敌昆虫比较结果表明该基因存在膜翅目昆虫糖转运蛋白基因的保守序列 （图 2），证明 所克隆的 cDNA 序列为丽蚜小蜂糖转运蛋白基因的表达序列，命名为 EfST1 基因。 通过与其 他昆虫之间构建系统进化树，发现不同昆虫糖转运基因在进化上保守性强，相比其他物种而言，丽蚜小蜂 EfST1 序列在系统进化上与同属于膜翅目的短管赤眼蜂的遗传距离更近，且同源性 高达 84%（图 3） 。 C. cinctus (XP_015604651) FFVTPILGSVSDRCRLKQGRRRPFILLLAVGVLIGLILVPNGEGMGYAFGDVPSVTNVTV C. solmsi marchali (XP_011495920.1) FFVTPILGSVSDRCRLKQGRRRPFILLLAIGVLVGLILVPNGESIGYAFGDTS-SNFTM N. vitripennis (XP_008203106.1) FFVTPILGSVSDRCRLKQGRRRPFILLLAIGVLMGLLLVPNGESMGYAFGDTR-MNFTA T. pretiosum (XP_014233934.1) FFVTPLLGSLSDRCRLKQGRRRPFIALLAIGVLMGLILVPNGEGMGYAFGDIQG NYTA E. formosa (EfST1) -VLMGLILVPNGEDLGYSFGDTKS-NFSA C. cinctus (XP_015604651) PHGHRTTATSS-KDDAPMTSSVS-SHSWGIFFTILGTVLLDFDADACQS C. solmsi marchali (XP_011495920.1) GMLHRTTAKTM-GNDSLPPIPPS-SHSWGIIFTILGTVLLDFDADACQS N. vitripennis (XP_008203106.1) ALGHRISGKTA-HNETLPPPPPS-SHSWGIFFTILGTVLLDFDADACQS T. pretiosum (XP_014233934.1) SFIHRITGKTAKVI-SDNATMTTATTTIEPPLVQPSHSWGIFFTILGTVLLDFDADACQS E. formosa (EfST1) RFIHRTTGKATTVIPLNATVAPPPPS-THSWGIFFTILGTVLLDFDADACQS C. cinctus (XP_015604651) PARAYLLDVTVPEDHARGLSTFTIMAGLGGFMGYGLGGINWDATTIGVMLGGHLHATFTL C. solmsi marchali (XP_011495920.1) PARAYLLDVTLPEDHARGLSTFTIMAGLGGFMGYGLGGINWDATSIGIALGGHLHATFTL N. vitripennis (XP_008203106.1) PARAYLLDVTIPEDHAKGLSTFTIMAGLGGFMGYGLGGINWDATAIGVALGGHLHATFTL T. pretiosum (XP_014233934.1) PARAYLLDVTIPEDHARGLSTFTIMAGLGGFMGYGLGGINWDATRIGVALGGHLHAVFTL E. formosa (EfST1) PARAYLLDVTLPEDHARGLSTFTIMAGLGGFMGYGLGGINWDATAIGVALGGHLHATFTL C. cinctus (XP_015604651) ITIIFVICVALTITSFKEIPLEVLERDQYQQLQNQKIAEEQDKDDEREKIANDECTSYGA C. solmsi marchali (XP_011495920.1) ITFIFIICVASTLTSFKEIPLDFIESNEYKQQLQQKLENEQ-RDNEQEKITEEDSITYET N. vitripennis (XP_008203106.1) ITIIFIICVASTLTSFKEIPLDFLESDDCKEQLQRKLEEER-KQNEAEKMIPDESATYGT T. pretiosum (XP_014233934.1) ITFIFIFCVASTLTSFKEIPLVFLESEECQQQLREMAEDKR-RQSESGKIAAEESVTYGT E. formosa (EfST1) ITIIFIFCVASTLTSFKEIPLDFLESEECQKQLQIKIEQER-RMNEQMKPAADGSGTYGT C. cinctus (XP_015604651) LGHESETN-IGKTDDFVLKPLPVEEPVKR-LGAVPMVPDVPAPP-D C. solmsi marchali (XP_011495920.1) GGNESEINSIDNTQEFQMKELS-NEPCK-LGTAPIFPDVQSSV-N N. vitripennis (XP_008203106.1) IGNEQEVDNDVNPEEIPMKPIEQPPPAPRKPGTVPMIPDVQPAP-R T. pretiosum (XP_014233934.1) LGNEQEME-NGEELPMKELP-PQRK-AGAVPMIPDVKSPPPPRPKPPPPAAAGEAS E. formosa (EfST1) LGNDSEIE-AEDIPMKKMP-EKAGVVPIVPEVPLAP- C. cinctus (XP_015604651) CEGSYVNYGFDENP-DANPRATLQEYLFSILYMPHSMRMVCLTNLFCWMAHVCYSLYFTD C. solmsi marchali (XP_011495920.1) LDSRIIESIDDAN-VDPKATIREYLLSILYMPHSMRMVCLTNLCCWMAHVCYSLYFTD N. vitripennis (XP_008203106.1) PADEYTHLGAPASESAPNPKATLQEYLYSILYMPHSMRMVCLTNLCCWMAHVCYSLYFTD T. pretiosum (XP_014233934.1) ADAAEAVILDSDDAAAANPKATLQEYLYSILYMPHSMRMVCLTNLCCWMAHVCYSLYFTD E. formosa (EfST1) -PTTTGEDPE-ANPKASLQEYLYSILYMPH- 注： 相同氨基酸用黑色阴影表示，保守氨基酸替换用灰色阴影表示。 Note: Identical amino acids are shaded in black, and conservative substitutions are shaded in grey. 图 2 丽蚜小蜂 EfST1 基因与 GenBank 其他昆虫 ST 基因的氨基酸序列比较 Fig. 2 Comparisons of deduced amino sequences of EfST1 gene in E. formosa and the ST genes in other insects from GenBank 2.3 丽蚜小蜂 EfST1 基因 的 表达分析 以分别取食不同浓度葡萄糖的丽蚜小蜂及取食 10%葡萄糖不同时间的丽蚜小蜂 cDNA 为模板，以 18S rRNA 为内参基因，采用 qPCR 方法进行丽蚜小蜂 EfST1 基因表达差异分析。发现饲喂不同浓度葡萄糖的丽蚜小蜂处理组，其 EfST1 基因的表达量均受到显著诱导，高于对照组小蜂的 EfST1 基因表达量。饲喂 15%和 20%浓度的葡萄糖后，丽蚜小蜂 EfST1 基因的表达量明显高于饲喂 1%、 5%和 10%的处理组，但在不同处理组间差异不显著（图 4a）。 同时发现，以不饲喂葡萄糖的丽蚜小蜂的表达量作为对照，饲喂 2、 12、 24、 48 h 葡萄糖后丽蚜小蜂糖转运蛋白 EfST1 基因的表达量均高于不饲喂葡萄糖的对照组，从饲喂 2 h 持续升高至 48 h，说明糖分饲喂可诱导该糖转运蛋白基因的表达，且该诱导作用至少可持续 2 d（图 4b）。 第 2 期 刘贻聪 等 ： 丽蚜小蜂糖转运蛋白基因克隆及其诱导表达 251 A t h a l i a r o s a e ( X P _ 0 1 2 2 6 6 4 7 9 . 1 )C e p h u s c i n c t u s ( X P _ 0 1 5 6 0 4 6 5 1 . 1 )S o l e n o p s i s i n v i c t a ( X P _ 0 1 1 1 6 9 1 7 7 . 1 )A p i s c e r a n a ( X P _ 0 1 6 9 1 0 8 5 6 . 1 )P o l i s t e s d o m i n u l a ( X P _ 0 1 5 1 7 8 7 9 8 . 1 )D i a c h a s m a a l l o e u m ( X P _ 0 1 5 1 0 8 4 3 4 . 1 )C e r a t o s o l e n s o l m s i m a r c h a l i ( X P _ 0 1 1 4 9 5 9 2 0 . 1 )N a s o n i a v i t r i p e n n i s ( X P _ 0 0 8 2 0 3 1 0 6 . 1 )T r i c h o g r a m m a p r e t i o s u m ( X P _ 0 1 4 2 3 3 9 3 4 . 1 )E n c a r s i a f o r m o s a ( E f S T 1 )0 . 0 58 46 11 0 06 14 27 27 1图 3 丽蚜小蜂 EfST1 基因与其他昆虫的系统 进化分析 Fig. 3 Phylogenetic analysis based on EfST1 gene from E. formosa with other insect STs 2 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h0 h0 . 00 . 51 . 01 . 52 . 0a baa bab相对表达量Relativegeneexpression饲 喂 葡 萄 糖 时 间 F e e d i n g p e r i o d饲 喂 葡 萄 糖 浓 度 G l u c o s e c o n c e n t r a t i o n1 % 5 % 1 0 % 1 5 % 2 0 %清 水 C K0 . 00 . 51 . 01 . 52 . 02 . 5aa ba baabb相对表达量Relativegeneexpressiona注：图中数据为平均值 ± 标准误；不同小写字母表示经 Tukeys HSD 法检验在 0.05 水平差异显著。 Note: Data are mean± SE. Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level by Tukeys HSD test. 图 4 饲喂葡萄糖不同浓度 （ a） 及不同时间 （ b） 后丽蚜小蜂 EfST1 基因的相对表达量 Fig. 4 Relative expression of EfST1 gene in E. formosa after feeding glucose in different concentrations (a) and different periods (b) 3 讨论 本文利用 CODEHOP 软件设计丽蚜小蜂的糖转运蛋白基因的扩增引物， 其 3和 5端分别为核心简并区和非简并性夹板结构，这样设计的优点既减少了引物的简并度，又提高了退火温度，保障了最终 RT-PCR扩增的成功率及扩增 产物的特异性 14。因此通过 CODEHOP 设计简并引物，可 通过 PCR 快速准确地扩增出靶标物种中预期的同源基因， 这在 苛求 芽 胞 杆菌 Bacillus fastidious 尿酸酶 以及其他多个未知基因克隆中也成功应用过 15,16，因此在 生物学信息较少、基因同源性低的其他物种未知基因的克隆和获取 中具有明显优势，并且会继续发挥作用 17。 本研究克隆获得了一个 824 bp 的丽蚜小蜂糖转运蛋白基因片段，与其他已报道的寄生蜂的序列相似性在 67%以上，而家蚕中糖转运蛋白 BmST5 基因编码区全长序列为 1527 bp，该基因与其他害虫的 同源蛋白序列相似性 也 在 50%以上 18， 与此相比， 丽蚜小蜂 EfST1 基因功能区序列与其他寄生蜂 序列 相似性 和 其他昆虫之间的相似性差异不大 。 家蚕糖转运蛋白基因 BmST3 克隆后，依据 家蚕基因组精细图谱被定位在 27号染 色体上 19；而丽蚜小蜂该基因的 全长序列 有待于进一步研究 获得 ， 将 有助于解析基因结构和典型结构域（例如 Sugar_tr、其他跨膜结构域等） ，为 研究该基因的功能奠定基础。 研究发现，田间给寄生蜂补充糖分可以提高寄生蜂的寄生率及其对靶标害虫的生物防治效能。以往研 252 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 究发现，采用 5%、 10%和 20%的不同浓度糖分饲喂后，海氏桨角蚜小蜂的寿命高于 不饲喂的 对照组，饲喂 10%葡萄糖后小蜂寿命高于对照 5.9 倍，据此认为 10%是寄生蜂室内饲养时糖分补充时的适宜浓度 5。更高浓度的糖分补充时，寄生蜂存活率升高，但其取食时间也会延长 3。综合考虑糖分浓度和取食糖分的时间，发现橄榄果蝇的寄生蜂 P. lounsburyi 羽化后 2 3 d 补充糖分，小蜂则会获得更多的能量 3，但其取食后对糖转运蛋白的 表达 影响尚不明确。本研究中，不同浓度葡萄糖饲喂丽蚜小蜂 2 h 后，糖转运蛋白表达量均升高，显著高于对照组，该糖转运蛋白 EfST1 基因对葡萄糖分补充反应敏感，且该种诱导反应至少能持续 2 d，这种短期诱导响应与褐飞虱取食 2 h 后， Nlst16 基因被明显诱导表达的结果一致 10，由此推测该基因可能与丽蚜小蜂体内糖吸收和转运有关。 糖转运基因是一个基因家族，例如褐飞虱 推断 有 18 个糖转运基因（ NlST1-18），或在其中肠中高表达，或在胚胎时期高表达，利用爪蟾卵母细胞表达研究发现NlST6 与 NlST1 基因 作用方式 类似，都是介导褐飞虱从外界吸取糖分的葡萄糖转运基因 20；而 家蚕 糖转运BmST3 基因的表达具有组织特异性，在马氏管中大量表达，推测其可能在马氏管细胞膜内外物质的跨膜转运中发挥作用 19。而丽蚜小蜂中的糖转运基因的数目及在糖转运中的关键基因尚不明确。 利用基因芯片数据研究果蝇 Drosophila 糖转运相关蛋白基因 CG1208，发现在果蝇组织中该基因表达与碳水化合物营养密切相关，在碳饥饿时表达增加，碳过量时则又减少 21；这与本研究中丽蚜小 蜂 10%浓度处理 与其他 浓度 处理组差异不显 著 的结果不一致 ， 可能与供试不同昆虫的种类差异、生理状态等不同有关，具体原因有待于进一步研究。 另外 ，该糖转运蛋白的表达量升高与昆虫的寿命延长及产卵量升高的关系、被诱导高表达的内在机制等问题尚需进一步研究。另外，鉴于丽蚜小蜂体内糖代谢通路相关基因的相互作用，我们还需通过抑制糖转运蛋白基因的表达水平（如 RNA 干扰等），从而明确丽蚜小蜂体内糖转运蛋白基因的功能。 参 考 文 献 1 Burger J, Hemerik L, Lenteren J C, et al. Reproduction now or later: optimal host-handling strategies in the whitefly parasitoid Encarsia formosaJ. Oikos, 2004, 106(1): 117-130. 2 王伟 , 刘万学 , 程立生 , 等 . 取食不同糖分对卵育型寄生蜂潜蝇姬小蜂雌蜂寿命和卵子发生的影响 J. 昆虫学报 , 2012, 55(8): 964-970. 3 Williams III L, Deschodt P, Pointurier O, et al. Sugar concentration and timing of feeding characteristics and survival of a parasitic waspJ. Journal of Insect Physiology, 2015, 79(1): 10-18. 4 Hirose Y, Mitsunaga T, Yano E, et al. Effects of sugars on the longevity of adult females of Eretmocerus eremicus and Encarsia formosa (Hymenoptera: Aphelinidae), parasitoids of Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum (Hemiptera: Alye