黄瓜花叶病毒在甜瓜种子中的带毒检测及脱毒方法研究.pdf

<p>西 北 农 业 学 报，（）： 网络出版日期 ： &nbsp;：网络出版地址 ：黄瓜花叶病毒在甜瓜种子中的带毒检测及脱毒方法研究收稿日期 ： &nbsp;修回日期 ：基金项目 ：农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室开放基金 （）；国家级大学生创新创业训练计划（）。第一作者 ：韩剑 ，男 ，副教授 ，研究方向为农业微生物生物技术 。：通信作者 ：罗明 ，女 ，硕士生导师 ，教授 ，研究方向为植物病毒检测及防治 。：韩剑，肖力，罗明，潘亚南，宁轩（新疆农业大学 农学院，乌鲁木齐；新疆自治区高校农林有害生物监测与安全防控重点实验室，乌鲁木齐）摘要为明确甜瓜种子携带黄瓜花叶病毒 （ ，）状况 ，以个品种甜瓜种子为材料 ，采用实时荧光定量 技术检测甜瓜种子 、胚芽中 带毒率和带毒量 。结果表明 ，供试种子 、种胚带毒率分别为 和 ，带毒量分别为××拷贝 粒和 ××拷贝 粒 ；种苗传毒率为 ，不同品种之间存在差异 。种子的带毒率高而传毒率低 ，表明主要存在于甜瓜种子的种皮上 。试验比较了 种处理方法对带 甜瓜种子的脱毒效果 。干热 （）、湿热 （沸水 ）、温汤 （）、干热 湿热 （干热 沸水 ）、干热 （干热 ）处理甜瓜种子 ，均能降低种子带毒量 。干热 、湿热 、干热湿热和干热 处理后种子脱毒率可达 以上 ，显著优于温汤处理 （），并能促进种子发芽 。干热 处理甜瓜种子后的种苗中未检出病毒 ，对 的脱除效果最佳 。关键词甜瓜 ；黄瓜花叶病毒 ； ；传毒率 ；脱毒中图分类号 &nbsp; 文献标志码 &nbsp; &nbsp; 文章编号（）中国甜瓜种植面积和总产量居世界首位 。新疆是甜瓜 （厚皮甜瓜 ）的优势产区 ，其味甜色美 ，品质独特 ，素有 “瓜中之王 ”的美称 ，是享誉国内外的名优特产 。病毒病是当前新疆甜瓜生产中的首要病害 ，发生普遍 、流行严重 ，造成甜瓜含糖量降低 ，品质低劣 ，经济效益下降 ，很大程度上制约了甜瓜产业的发展 。国内外报道危害瓜类作物的病毒已达种之多，其中在中国危害严重的主要有小西葫芦黄 花 叶 病 毒 （ ，）、西瓜花叶病毒 （ ，）、甜瓜坏死斑点病毒 （ ，）、番 木 瓜 环 斑 病 毒（ ，）、南瓜花叶病毒（ ，）等。年潘亚南等对新疆吐鲁番 、鄯善 、昌吉哈密瓜产区病毒病 进 行 检 测 ，检 出、和，其 中是 优 势 毒 原 ，检 出 率 最 高。李继洋等运用多重技术检测新疆南 、北疆个地区 （市 ）哈密瓜主栽区的病毒病发生及分布 ，发现、 种病毒发生普遍 。古勤生发现 ，现在中国北方地区葫芦科作物病毒病样本中的检出率仅次于和，是危害葫芦科作物的主要病毒之一 。黄瓜花叶病毒 （）寄主广泛 ，能侵染科 、属 、 种以上的单 、双子叶植物 ，是目前世界范围内发生最普遍 、分布最广 、危害最严重的植物病毒之一 。是典型的种传病毒。携带病毒的种子不仅形成带毒幼苗作为病毒病害发生的初侵染源 ，再经昆虫媒介的二次传播形成发病中心 ，引发病毒病大面积爆发 。新疆是全国最大的西瓜和甜瓜制种基地 ，承担着多家大型跨国种业公司制种任务 ，带毒种子随种子调运和种质资源交流远距离传播扩散 ，对病毒病的发生 、传播影响极大 。因此 ，加强种子检测 、采取有效的种子脱毒处理措施 ，从源头杜绝病原是控制种传病毒病发生蔓延和安全防控的重要举措 ，具有事半功倍的成效 。采用干热处理 、温汤浸种 、辐射 、化学药剂等种子处理技术具有钝化 、脱除种子携带病毒的作用 ，是一种减轻病毒病害的经济有效的措施 。日本和韩国采用种子脱毒处理技术在有效控制瓜类检疫性种传病毒黄瓜绿斑驳花叶病毒（ ，）方面取得了良好的效果 。张竹青试验比较了种辣椒种子处理方式对、烟草花叶病毒 （ ，）的 防 治 效 果 。任琛荣等应用多重技术检测籽用西葫芦种子的、及带毒情况及热处理的脱毒效果 ，针对不同病毒 、不同种子采取的脱毒方法不同 ，脱毒效果各异 。对新疆甜瓜种子的带毒及有效脱除病毒的研究尚未见报道 。本研究采用实时荧光定量技术检测甜瓜种子中的带毒率 ，比较不同种子处理方法对种子携带的脱除效果 ，明确脱除种子携带的有效措施 ，为甜瓜病毒病害的安全 、高效防控提供科学基础和技术支持 。 材料与方法 材 料 供试甜瓜种子春潇号 优密号 欣丰密 楼兰号 春秋号 均采自新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所甜瓜试验地 ，春秋号 采自五家渠团病毒病发生病田 。将采集的不同品种甜瓜内的种子剖出 ，自然阴干后 ，保存于冰箱中 ，冷藏期个月 。 试剂总提取试剂 、第链合成试剂盒 、普通琼脂糖凝胶回收试剂盒 （ ）、质粒小提试剂盒 （ ）、氨苄青霉素 、等购于北京天根生化科技有限公司 。连接试剂盒与感受态细胞购于北京全式金生物科技有限公司 。限制性内切酶为公司产品 。 购于公司 。 方 法 的 定量检测体系利用已建立和优化的 检测体系 。正向引物序列 （）：，反向引物序列 （），目标片段。反应体系 （）： （×）；引物各（）；模板；补足至。反 应 条 件 为 ：预 热；预变性；变性，退火，延伸，共个循环 。 定量检测标准曲线的建立以构建的基因阳性克隆质粒 （质粒质量浓度测定为，相应的拷贝数为×拷贝 ）的×梯度稀释液 （）为模板进行 实时荧光定量反应扩增 ，观察其溶解曲线 。根据质粒拷贝数的对数和循环数 （值 ）之间的动力学曲线 ，得到定量检测的标准曲线方程 。对建立的标准曲线做重复性检测 。以基因阳性克隆质粒的稀释液为模板 ，进行次重复性试验扩增 ，根据值的变异系数来检验所建立体系的重复性和稳定性 。 甜瓜种子 、胚芽和种苗的带毒检测甜瓜种子 、胚芽和种苗总的提取和的合成 ：种子 ，各品种均取粒种子 ，无菌水浸泡过夜后带种皮提取总。胚芽 ，取待测甜瓜品种各粒浸泡后 ，置于灭菌培养皿中 （皿底铺有滤纸保湿 ，催芽 ，待胚芽长出时 ，取胚芽提取总。种苗 ，将甜瓜种子催芽后播种于装有高温灭菌土壤的花盆中 ，培养于防虫温室中 。幼苗生长至片真叶时 ，取叶片提取总。每个品种测定株幼苗 。采用试剂盒提取总。同时提取已检测感染和健康的甜瓜叶片总分别作为阳性和阴性对照 。利用 第链合成试剂盒对提取的总进行反转录获得。带毒率和带毒量检测 ：以提取的甜瓜种子反转录为模板 ，利用所建立的 实时荧光定量检测体系对甜瓜种子带毒情况进行检测 ，同时设置感病和健康甜瓜叶片样品分别为阳性和阴性对照 ，以超纯去离子水为空白对照 。统计带毒率 ：带毒率（检出病毒种子数 抽检种子总数 ）×将检出阳性样品的均值代入标准方程 ，计算种子带毒量 。 甜瓜种子脱毒处理对检测出携带··期 韩剑等 ：黄瓜花叶病毒在甜瓜种子中的带毒检测及脱毒方法研究的种子 ，分别通过以下种方法进行处理 （各处理粒种子 ），重复次 。（）干热处理 ：在条件下 ，热风处理甜瓜种子；（）湿热处理 ：将待脱毒处理的甜瓜种子放在沸水 （）中 （沸水体积大约为种子体积的倍 ），快速振荡使其在沸水中冷却 ；（）温汤处理 ：用的温水浸种；（）干热湿热处理 ：先将甜瓜种子在条件下热风处理，之后将种子浸于倍于种子体积的沸水中 ，快速振荡使其冷却 ；（）干热处理 ：在条件下 ，热风处理种子，之后用的溶液浸种。 种子及种苗脱毒效果检测种子脱毒检测 ：不同处理种子总的提取及的合成方法同 “”。采用 实时荧光定量检测体系对处理种子进行带毒量检测 ，计算脱毒率 。以未经热处理及室温灭菌水浸泡的种子为对照 。脱毒率（处理后的带毒量 处理前种子带毒量 ）×。种子幼苗脱毒检测 ：对干热处理和干热处理后的种子幼苗进行脱毒效果检测 。将干热处理和干热处理后的种子先进行催芽 ，待出芽后分别播种于塑料育苗钵中 ，育苗基质为灭菌土 ，人工气候箱中常规培养 。幼苗生长至叶心时检测叶片带毒量 ，方法同 “”。 脱毒处理种子发芽试验处理后种子先用流水洗净 ，然后冷水浸泡，将种子取出放入培养皿中发芽 ，培养皿垫一层滤纸 ，加适量灭菌水 ，加盖放在恒温培养箱中发芽 ，发 芽 温 度 为，第天统计发芽数 ，计算发芽势 ，第天统计发芽数 ，计算发芽率 ，发芽的标准为种子露白 。不作处理的种子用冷水浸泡作为对照 。 数据分析试验数据用 和 软件分析 ，比较各处理间的差异显著性 。 结果与分析 定量检测标准曲线的建立以阳性重组质粒不同质量浓度所对应的拷贝数的对数值为横坐标 ，循环数 （值 ）为纵坐标构建 实时荧光定量标准曲线 （图）。由图可以看出 ，阳性质粒模板不同质量浓度对应的拷贝数的值与値之间具有良好的线性关系 ，得到标准曲 线 方 程 （ ），可用于对供试样品病毒含量的定量分析 。图 定量检测标准曲线 表 实时荧光定量 对样品的重复性检测 病毒同一模板 次重复的 值 &nbsp; &nbsp; 珚± &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;± &nbsp;对建立的标准曲线做重复性检测 （表），对基因阳性克隆质粒同一稀释液模板的次扩增值误差不到个循环 ，值变异系数（）为。结 果 表 明 ，本 研 究 所 建 立 的实时荧光定量检测体系的重复性较好 ，能够保证不同样品间检测结果的可靠性和稳定性 。 对甜瓜种子 、胚芽和种苗中带毒检测对供试甜瓜种子 、胚芽和种苗中带毒状况进行定量检测 ，结果见表。不同品种的甜瓜种子 、胚芽和种苗中带毒率 、带毒量差异较大 。种子带毒率为，带毒量为××拷贝 粒 。其中 优密号 楼 兰号 和 欣 丰 密 带 毒 率 均 高 达，春潇号 带毒率相对较低 ，但带毒量最·· 西北农业学报 卷高 。胚芽 带 毒 率 为，带 毒 量 为××拷贝 粒 。优密号 胚芽带毒率和带毒量均为最高 ，欣丰密 则为最低 。种苗带毒率，带毒量×拷贝 粒 ，春秋号 种苗带毒率和带毒量均为最高 ，而 优密号 种苗中未检出阳性株 。检测结果表明 ，在甜瓜种子 、胚芽和种苗中的带毒率和带毒量差异显著 。种子的带毒率 （均值）和带毒量 （均值×拷贝 粒 ）均 为 最 高 ，其 次 是 胚 芽 ，带 毒 率 （均 值）和带毒量 （均值×拷贝 粒 ）显著减少 ；种苗为最低 ，其带毒率 （传毒率 ）为（均值 ），带毒量为×拷贝 粒 （均值 ）。表 实时荧光定量 对甜瓜种子 、胚芽和种苗中 病毒的检测结果 ， 品种检测样品检测数 阳性样品数 值均值 带毒量 （拷贝 粒 ） 带 （传 ）毒率 春潇 号 种子 &nbsp; &nbsp; &nbsp;× &nbsp;胚芽 &nbsp; &nbsp; &nbsp;× &nbsp;种苗 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;× &nbsp;楼兰 号 种子 &nbsp; &nbsp; &nbsp;× &nbsp;胚芽 &nbsp; &nbsp; &nbsp;× &nbsp;种苗 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;× &nbsp;优密 号 种子 &nbsp; &nbsp; &nbsp;× &nbsp;胚芽 &nbsp; &nbsp; &nbsp;× &nbsp;种苗 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 欣丰密 种子 &nbsp; &nbsp; &nbsp;× &nbsp;胚芽 &nbsp; &nbsp; &nbsp;× &nbsp;种苗 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;× &nbsp;春秋 号 种子 &nbsp; &nbsp; &nbsp;× &nbsp; 胚芽 &nbsp; &nbsp; &nbsp;× &nbsp;种苗 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;× &nbsp;总样品数 种子 &nbsp; &nbsp; &nbsp;× &nbsp; 胚芽 &nbsp; &nbsp; &nbsp;× &nbsp;种苗 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;× &nbsp;注 ：同列不同字母表示经 检验在 水平差异显著 ，下同 。： ， 对甜瓜种子中的脱除效果分别采用干热 、湿热 、温汤 、干热湿热及干热处理带毒量较高的 春潇号 甜瓜种子 。由表可见 ，各处理方法均能在一 定 程 度 上 降 低 种 子 带 毒 量 ，脱 毒 率 为，不同处理的脱毒效果差异较大 。干 热 、湿 热 、干 热湿 热 和 干 热处理甜瓜种子的效果较好 ，脱毒率均达到了以上 ，显著优于温汤处理 （），干热处理可达，脱毒效果最佳 。温汤处理的脱毒效果最差 ，脱毒率仅为。干热和干热处理后的种子脱毒率均可达以上 （表）。进一步检测其种子处理后对种苗的脱毒率 ，结果见表，未经处理的种苗带毒率为，但干热处理其幼苗传毒率可达，带毒量×鲜质量 ，而种子经干热处理后 ，其幼苗中检测不出病毒 ，可完全脱除病毒 。 脱毒处理对种子发芽率和发芽势的影响对脱毒处理后的甜瓜种子 ，测定其发芽率和发芽势的变化 ，结果如图所示 。除温汤处理外 ，其他处理的种子发芽率和发芽势均高于对照组 ，对种子发芽有一定的促进作用 。干热湿热和干热处理能明显提高种子的发芽··期 韩剑等 ：黄瓜花叶病毒在甜瓜种子中的带毒检测及脱毒方法研究率 ，对种子的发芽势影响不大 。温汤处理对种子发芽有一定的抑制作用 ，降低了种子的发芽率和发芽势 。表 不同处理对甜瓜种子中 脱毒效果的影响 处理方法均值 种子带毒量 （拷贝 粒 ） 种子脱毒率 干热处理 &nbsp;± &nbsp;×± ±湿热处理 &nbsp;± &nbsp;×± ±温汤处理 &nbsp;± &nbsp;×± ±干热 湿热处理 &nbsp;± &nbsp;×± ±干热 处理 ± &nbsp;×± ±对照 &nbsp;± &nbsp;×± ±注 ：数据为 次重复试验的 “平均数 ±标准差 ”。： “±”表 不同处理对种苗中 病毒脱除效果的影响 处理方法总样品数 阳性样品数 种苗带 （传 ）毒率 种苗带毒量 （拷贝 鲜质量 ） 种苗脱毒率 干热 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;× 干热 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;对照 &nbsp; &nbsp; &nbsp; 图上不同字母表示差异显著 （） （）图 不同处理种子的发芽率和发芽势 讨 论 甜瓜种子中的带毒率和传毒率本研究采用 技术对甜瓜种子的携带情况进行定量检测 ，结果表明 ，供试甜瓜种子均能检出，其带毒率 （均值）和带毒量 （均值×拷贝 粒 ）均较高 ，不同品种有一定差异 。携带病毒的种子能否形成感染病毒的幼苗造成病毒在田间传播的初侵染源受多种因素的影响 。研究认为 ，种子传播病毒不仅受病毒本身 、带毒量 、带毒部位的影响 ，还与作物品种 、感病时间 、环境条件以及病毒植物互作有关。等试验发现 ，侵染辣椒后检测辣椒种子表皮带毒率为，而生长试验检测传毒率平均为，种子表皮带毒率比种子传毒率高很多 ，主要以种皮带毒为主 。·· 西北农业学报 卷研究表明 ，大多数病毒在种皮或胚乳带毒通常不能通过种子传毒 ，只有病毒在母株幼苗期和授粉前侵染进入种胚 ，产生的带毒种子才具有种传特性，因此将种胚与种皮分开后进行检测 ，方能获得准确的种传率 。本研究通过检测甜瓜整粒种子 、发芽种子的胚芽和种苗的带毒状况 ，发现胚芽的带毒率 （均值）、带毒量 （×拷贝 粒 ）都远低于种子 ，表明主要存在于甜瓜种子的种皮上 。供试的甜瓜种苗传毒率为（均值），其胚芽带毒率 、带毒量与种苗传毒率具有一定的相关性 。但也有例外 ，如优 密号 的 胚 芽 带 毒 率 （）、带 毒 量（×拷贝 粒 ）均为最高 ，但在种苗中却并未检出带毒病株 。据报道 ，黑眼豇豆花叶病毒唯有当其侵染寄主胚轴组织时 ，才能导致种子传毒。同一病毒在植物的不同品种中的传毒情况也不同 ，能通过野生黄瓜种子传毒 ，却不能通过栽培品种的黄瓜种子传毒，可见病毒的侵染 、存在部位与种传率的关系较为复杂 。在本研究中 ，主要是通过甜瓜种子的胚芽 、胚轴或其他部位传毒 ，可否通过甜瓜种皮传毒 ，优密号 是否能种传等均需经反复试验证实 。不少研究表明 ，大多数种传病毒的传毒率不高 。本研究测定的个品种的甜瓜种子对的平均传毒率为，不同品种种子的传毒率存在差异 。任琛荣等检测籽用西葫芦种子幼苗的传毒率 ，个品种种子的的平均传毒率为，绿丰号 （）最高 ，而 粒丰号 最低 （），远高于甜瓜种子的传毒率 。这种差异可能是由于感染寄主时期不同从而引起种子感染病毒的程度和部位的不同 ，也可能与毒株的株系不同有关 。此外 ，有试验发现 ，感染黄瓜种子收获后个月检测种传率为，但种子保存个月后种传率降低到。本研究中的甜瓜种子保存已近，可能也会影响其传毒率改变 。研究结果均说明不同寄主对同种病毒的传毒率不同 ，同一病毒的不同分离物对同种寄主传毒率也会改变 。 甜瓜种子中的脱毒方法及效果评价种子处理方式主要包括温汤浸种 、微波处理 、干热空气处理和化学药剂处理等。等利用热空气处理 、干热处理 、磷酸钠处理带有辣椒花叶病毒 （ ，）的辣椒种子 ，处理并贮存个月后 ，可有效灭活种子中的病毒 ，但严重影响种子萌发 。用热空气处理 （处理或处理）番茄种子 ，消除其携带的柏平缕瓜花叶病毒 （ ，），能基本灭活病毒 ，而在钝化病毒的同时 ，也影响到了种子萌发。因此 ，在种子脱毒处理中 ，如何确定钝化病毒的技术指标 ，做到既能最大限度地钝化病毒 ，又不降低种子的发芽活力是一个关键问题 。目前 ，常用的种子脱毒效果的检测方法主要有种植幼苗症状观察 、再对显症幼苗结合检测验证等 ，较费时耗力 ，还容易受季节 、培养条件的限制 ，也还不能排除一些带毒种子不形成显症幼苗的假阴性现象 ，存在稳定性差 、只能定性检测及灵敏度有限等缺点 ，不能对处理后的种子中的病毒进行精确定量 ，因此 ，无法精准确定钝化病毒的技术指标 。本研究采用种方法对甜瓜种子进行脱毒处理 ，利用 实 时 荧 光 定 量检测技术对处理后的甜瓜种子中病毒进行定量检测 。结果表明 ，各种处理方法均能在一 定 程 度 上 降 低 种 子 带 毒 量 ，脱 毒 率 为，不同处理的脱毒效果有较大差异 。干热 、干热湿热和干热处理都可达到以上的脱毒率 ，且都能明显提高种子的发芽率 ，对发芽势影响不大 。其中干热处理效果最佳 。温汤处理不仅脱毒效果较差 ，还对种子发芽有一定的抑制作用 。任琛荣通过相对定量法测定了不同温度条件下湿热和干热处理对西葫芦种子携带病毒的钝化效果 ，试验结果表明湿热处理、干热处理条件下脱除效果最好 （），但种子的发芽率和发芽势降低 。本试验脱毒效果最佳的干热处理条件 （，）与任琛荣不同 ，其结果各异 。可见 ，针对不同种的葫芦科种子携带相同种类病毒的试验处理条件存在较大差异 ，其最佳脱除处理条件均需经过严格的试验才能确定 。降低种传病毒危害的关键是减低种苗的传毒率 ，以减少病毒初侵染源 。本研究发现 ，干热处理后的甜瓜种子幼苗传毒率可达，而干热处理的种子幼苗中检测不出病毒 ，表明该方法能更有效去除种胚内的病毒 ，降低幼苗传毒率 ，具有最佳的脱毒效果 。参考文献：林石明 ，廖富荣 ，陈青 ，等 葫芦科作物种传病毒及其检疫··期 韩剑等 ：黄瓜花叶病毒在甜瓜种子中的带毒检测及脱毒方法研究重要性 植物检疫 ，（）： ， ， ， ，（）：古勤生 葫芦科作物主要病毒病防治研究进展 中国西瓜甜瓜 ，（）： ，（）：潘 亚 南 ，韩剑 ，吴 海 波 ，等 新疆哈密瓜病毒的 检测和分子鉴定园艺学报，（）： ， ， ， ，（）：李继洋 ，杨渡 ，韩盛 ，等 基于多重 技术检测新疆甜瓜主栽 区 种病毒病及其分布 西 北 农 业 学 报 ，（）： ， ， ， ，（）：彭斌 ，汪丽刚 ，古勤生 甜瓜种子中种传病毒的 检测 中国瓜菜 ，（）： ， ， ，（）：张竹青 辣椒病毒病研究 长沙 ：湖南农业大学 ， ： ，任琛荣 ，周登攀 ，都业娟 ，等 多重 检测籽用西葫芦种子带毒及热处理脱毒效果 植物保护 ，（）： ， ， ， ，（）：李莉 ，王锡锋 ，郝宏京 ，等 甘蔗花叶病毒在玉米种子中的分布及其与种子传毒的关系 植物病理学报 ，（）： ， ， ， ，（）： ， ，（）：杨洪一 ，张娜娜 ，郭世辉 ，等 植物病毒种传机制研究进展黑龙江农业科学，（）： ， ， ， ，（）： ， ，（）：裘维蕃 植物病毒学 北京 ：科学出版社 ， ： ， ， ： ，（）： ，（）： ， ，（）： ， ， ， ，（）：·· 西北农业学报 卷 </p>