番茄ShARPC5抗白粉病功能分析.pdf

中国农业科学 2020 53 1 65 73 Scientia Agricultura Sinica doi 10 3864 j issn 0578 1752 2020 01 006 收稿日期 2019 07 10 接受日期 2019 08 21 基金项目 国家自然科学基金 31571960 陕西省重点产业创新链项目 2019ZDLNY03 07 西 北 农 林 科 技 大 学 试 验 示 范 站 基 地 科 技创新与 成果 转化项目 2018 10 高等学校学科 创新引智计划 B07049 联系方式 冯婵婧 E mail fcj413 通信作 者王阳 E mail wangyang2006 通信作者马青 E mail maqing 开放科学 资源服务 标识码 OSID 番茄ShARPC5抗白粉病功能分析 冯婵婧 孙广正 王阳 马青 西北农林科技大学植物保护学院 旱区作物逆境生物学国家重点实验室 陕西杨凌 712100 摘要 目的 白粉病 powdery mildew 是番茄生产上的重要病害 严重影响番茄的产量 番茄基因组测 序工作的完成为抗病基因挖掘提供了重要的信息资源 ARP2 3 actin related protein 2 and 3 复合体是肌动 蛋白微丝骨架动力学的主要调控因子 能够参与包括响应外界胁迫等多种细胞学过程 本研究通过对番茄 ARPC5 actin related protein C5 进行克隆和抗病功能验证 为番茄基因组信息完善 抗病机制解析和分子育种等 方面打下基础 方法 从番茄LA1777 Solanum habrochaites cDNA中 PCR扩增ShARPC5 使用DNAMAN 6 0进 行多序列比对 MEGA 6 0构建系统发育树 应用在线工具ProtComp v 9 0进行亚细胞定位预测 利用实时荧光 定量PCR qRT PCR 比较接种白粉菌 Oidium neolycopersici On Lz 后高感品种Moneymaker MM 和高抗品 种 LA1777 中番茄 ARPC5 的表达特征 分析白粉菌侵染与 ARPC5 表达的相关性 应用病毒诱导的基因沉默 virus induced gene silencing VIGS 技术进一步验证该基因在番茄中的抗病功能 观察沉默株和野生型株 系接种后表型变化 利用台盼蓝和 DAB 染色法检测植株产生过敏性坏死和 H2O2的能力 并检测 ShARPC5 沉默后一 些与植物抗病相关标记基因的表达变化 采用农杆菌浸花法遗传转化拟南芥过表达 ShARPC5 植株 观察转基因和 野生型株系接种后表型变化 并统计单病斑分生孢子数 结果 从番茄品种LA1777 中克隆到ShARPC5 编码132 个氨基酸残基 包含一个保守的P16 Arc结构域 与番茄MM 白粉菌亲和互作相比 非亲和互作的番茄品种LA1777 在接种白粉菌后 ShARPC5显著上调表达 尤其在接种后18 h 在番茄上沉默ShARPC5能够增加植株对白粉菌On Lz 的敏感性 防卫反应基因 PR1b1 显著下调表达 组织学观察显示与对照植株相比 ShARPC5 沉默植株接种后诱导 产生过敏性坏死和活性氧减少 在烟草上瞬时过表达 ShARPC5 能够诱导产生坏死斑 相反 在拟南芥上过表达 ShARPC5能够增加植物的抗病性 结论 ShARPC5是番茄响应白粉菌侵染的重要基因 可减轻番茄白粉病的发病 程度 在番茄抗白粉病机理研究方面具有较大的应用价值 可作为番茄抗白粉病分子育种的一个候选基因 关键词 番茄白粉病 抗病性 肌动蛋白微丝骨架 ARP2 3复合体 ARPC5 Functional Analysis of Gene ShARPC5 Involved in Tomato Resistance to Powdery Mildew FENG ChanJing SUN GuangZheng WANG Yang MA Qing College of Plant Protection Northwest A F University State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas Yangling 712100 Shaanxi Abstract Objective Powdery mildew is an important disease in tomato production and seriously affects the yield of tomato Genome sequences of Solanum lycopersicum provide valuable information resources for disease resistant gene searching The actin related protein 2 and 3 complex ARP2 3 complex a key regulator of actin cytoskeletal dynamics has been linked to multiple 6 6 中 国 农 业 科 学 5 3 卷 cellular processes including those associated with response to stress In this study tomato ARPC5 encoding a subunit protein of the ARP2 3 complex was cloned and identified for disease resistance The results will lay a foundation for upgrading tomato genomic information further studying the resistance mechanism and molecular breeding Method ShARPC5 was annotated from the genomic databases and cloned from tomato LA1777 S habrochaites DNAMAN 6 0 was used for multiple sequence alignment and MEGA 6 0 was used for constructing phylogenetic tree The prediction of protein subcellular localization was performed using ProtComp v 9 0 The qRT PCR was used to compare the expression of ARPC5 in the high sensitive variety Moneymaker MM and high resistant variety LA1777 induced by Oidium neolycopersici On Lz The correlation between On Lz infection and ARPC5 expression was analyzed The function of ShARPC5 involving in tomato resistance to On Lz was further verified by the technology of virus induced gene silencing VIGS The phenotypic changes of ShARPC5 silenced and wild type lines were observed Hypersensitive response HR and H 2 O 2 production were detected by trypan blue and DAB staining respectively and the expression of some marker genes related to plant disease resistance was assayed in ShARPC5 silenced plants Additionally genetic transformation of Arabidopsis thaliana was conducted by Agrobacterium mediated floral dip method The phenotypic changes of transgenic and wild type lines were observed and the number of conidia per lesion was also counted Result The S habrochaites ARPC5 was identified and characterized ShARPC5 encodes a 132 amino acid protein possessing a conserved P16 Arc domain Compared with the compatible interaction between tomato MM Moneymaker and On Lz the expression of ShARPC5 was significantly up regulated in incompatible interaction between tomato LA1777 and On Lz especially at 18 hpi Silencing of ShARPC5 in tomato could increase the susceptibility to the powdery mildew pathogen On Lz The expression of PR1b1 a maker gene related to signal regulation was significantly down regulated after silencing of ShARPC5 The histological observation showed that the induction of hypersensitive cell death and the generation of reactive oxygen were reduced in silenced ShARPC5 tomato plants compared with wild types Transient over expression of ShARPC5 in tobacco could rapidly produce necrotic spots Conversely over expression of ShARPC5 in A thaliana followed by inoculation with On Lz showed enhanced resistance Conclusion ShARPC5 is an important gene which can reduce the incidence of tomato powdery mildew and has a great application value in the mechanism study of tomato resistance to powdery mildew At the same time it can be used as a candidate gene for molecular breeding of tomato powdery mildew resistance Key words tomato powdery mildew resistance actin cytoskeleton ARP2 3 complex ARPC5 0 引言 研究意 义 番茄白粉 菌 Oidium neolycopersici 是一种活体营养寄生菌 能在番茄叶表面 背面 叶 柄和花萼上产生白粉病斑 但不侵染果实 它通过影 响植物的叶片使叶片失去生长活力 能导致产量 果 实 损失 高 达 50 1 目 前 在温 室和 大田中对 番茄 白粉病的控制主要依赖于化学农药 然而 化学药剂 不仅增加病原菌抗药性 也通过果实中农药的残留对 环境和人体造成危害 2 大多数栽培番茄易受白粉菌 侵染 控制番茄白粉病的有效策略是培育抗性品种 前人研究进展 目前 野生番茄品种中一些抗性基 因已经被鉴定并转入栽培番茄 包括 5 个显性基因 Ol 1 Ol 3 Ol 4 Ol 5 Ol 6 1 个 隐性基 因 ol 2 和 3 个多 基 因抗性数 量性 状基因座 quantitative trait locus QTLs 3 研 究发 现抗性基 因介 导的对番 茄白 粉病的抗 病性 与过敏性 坏死 hypersensitive response HR 有 关 3 当细胞 产 生 HR 时 未 受感染的 邻近 细 胞显示肌动蛋白微丝 actin filaments AFs 聚集现 象 4 AFs 是 形成肌动 蛋白 细胞骨架 的主 要结构元 件 既能将质膜和细胞壁上的物质通过囊泡的靶向输送转 运到生长位点 也能特异性的转运防卫相关物质形成 抵御病原 菌侵 入的屏障 5 6 肌动蛋白 组成 的关键步 骤 是肌动蛋白成核 而肌动蛋白成核在很大程度上受 ARP2 3 actin related protein 2 and 3 复合 体的活性 调 节 这能 确保 AFs 正确形 成 7 ARP2 3 复 合 体包含 7 个亚基 分 别 为 ARP2 ARP3 ARPC1 ARPC5 该 复 合体是一种高度保守的肌动蛋白调节剂 能核化与质膜 区域相关的分支状的肌动蛋白网络 也能促进特定细胞 器和细胞骨架的耦合 在核内和细胞质间提供某种形式 的物理连续性 8 ARP2 3 复合体不同亚基在发育过程 中起着不同的作用 例如 ARP2 对膜结合是必不可少 的 9 ARP3 在体内定位于肌动蛋白成核部位 10 ARPC1 或 ARPC2 的缺 失导 致酿酒酵 母的 致死性和 生 存能力严 重下 降 拟南 芥 Arabidopsis thaliana ARP3 或 ARPC5 的功能丧失导致根毛短小且弯曲 11 12 ARPC4 是控制 ARP2 3 复合体组装和稳定性的最关 键亚基 9 ARPC4 和 ARPC5 在介导与 ABA 和 H 2 O 2 诱导的保卫细胞肌动蛋白动力学中起关键作用 13 本研究切入点 ARP2 3 复合体的亚基除了能够参 1 期 冯婵婧等 番茄 ShARPC5 抗白粉病功能分析 67 与植物生长发育和结构组成 较少的研究证实其参 与植物的抗病性 14 西北农林科技大学植物保护学 院 植 物 病害综合治理团队发现白粉菌 On Lz 与番 茄 Moneymaker MM Solanum lycopersicum 形 成 亲和互作 而与番茄 LA1777 S habrochaites 非 亲 和互作 在非亲和互作体系中番茄 ARPC5 受白粉菌 诱导显著上调表达 推测其可能参与抗白粉菌侵染 的过程 拟解决的关键问题 通过对 ShARPC5 进 行克隆 生物信息学分析 差异性诱导表达 VIGS 分析 烟草瞬时表达 拟南芥过量表达以及酵母突 变体异源互补等方面的研究 为进一步揭示其抗病 机制打下基础 1 材料与方法 试验于 2016 2018 年在 西北农林科技大学植物 保护学院 植物 病害综合 治理 实验室完 成 1 1 试验材料 番茄白粉 菌菌 株 On Lz 采 自 甘肃省兰 州市 分离 保存在栽 培番 茄 Moneymaker MM 上 生长温 度 20 3 相对湿度 70 5 16 h 光照 8 h 黑 暗 番茄 MM 和 On Lz 构成亲 和互作体 系 LA1777 和 On Lz 构 成 非亲和互 作体 系 番 茄种子 消毒后 在 25 95 相 对湿度 和 3 500 lx 光照 下生 长 15 生态 型拟南 芥 Columbia 0 Col 0 购自 拟南 芥生物资 源中 心 Ohio 按 照 WU 等 16 的方法对 拟 南芥种子 进行 消毒和催 芽 发芽和生 长分 别在 21 和 19 生 长室 8 h 光照 16 h 黑暗 相 对湿 度为 70 1 2 生物信息学分析 以拟南 芥 ARPC5 序列号 NP 567216 1 氨 基 酸序列作 为指 示查询序 列在SGN Tomato Combined 数 据库 TBLASTN 程 序 GenBank 的 BLASTN http blast ncbi nlm nih gov blast cgi 程序搜索 同源 序列 利用 NCBI http www ncbi nlm nih gov gorf gorf html 的 BLAST 程序 和基因开 放式 阅读框 ORF 分 析 ShARPC5 的 cDNA 序列 使 用 DNAMAN6 0 进行多序 列比 对 用 MEGA 6 0 软 件的邻 近法进行 系统 发育分析 蛋 白质结构 域预 测使用 RCSB PDB 蛋白 质 数据库 https www rcsb org 利用 ProtComp 程序 v 9 0 http linux1 softberry com berry phtml 预测 ShARPC5 蛋 白亚 细胞定位 1 3 烟草瞬时过表达 利用 ShARPC5 TF 5 AGCATCGATTCCCGGG TCGACATGGCTGAGATTGTCGAAGCAGATA 3 下划线为 载体 同源臂 和 ShARPC5 TR 5 AACCGT TCATCGGCGGTCGACTCACACAGTATTCACAGT GTCAGCA 3 下划 线为载 体同源臂 扩 增 ShARPC5 的 ORF 将 扩增产物 同源 重组到 PGR106 载体的 SalI 酶切位点 由 CaMV35S 启动子驱 动 参照 LU 等 17 的方法将 重组 质粒 pGR106 ShARPC5 或 pGR106 GFP 阴性对 照 电转至根 癌农 杆菌 GV3101 中 将转 化 子处理后 在黑 暗中培 养 2 3 h 然后 注射 到烟草叶 片 接种后 5 7 d 对 表型进 行 观察 1 4 病毒诱导基因沉默 利用 ShARPC5 VF 5 AGAAGGCCTCCATGGG GATCCCGAAGGCATAATCACAAGAATCG 3 下划 线为载体 同源 臂 和 ShARPC5 VR 5 CGTGAGCTC GGTACCGGATCCCAGCAAGACAACGCAGTATGC A 3 下划线 为载体同 源臂 扩增 ShARPC5 基 因片段 重组 TRV2 ShARPC5 质粒 参照 LIU 等 18 的方法 将 TRV1 和 TRV2 ShARPC5 农 杆菌混合 菌液 注射到番 茄 LA1777 植 株 叶片 TRV2 ShPDS ShPDS 序列登录 号 NM 001247166 作 为阳性 对照 接 种病 毒 30 d 观 察 沉默 ShPDS 植株的光 漂白 症状 在叶片 上接种 On Lz 7 dpi days post inoculation 观察 叶片侵 染表型 参照 SUN 等 19 的 方法在 7 14 dpi 统计 病害 严重度 计算 病情指数 DI 病情指 数 DI 某一病害严 重度的发 病植 物叶片数 病 害严重度 调查总植 株 叶片数 最高病级 100 利用 THORDAL CHRISTENSEN 等 20 的方法 对植物叶 片进 行 3 3 二氨 基联苯胺 DAB 和台 盼 蓝染色 分别 于 6 18 24 48 72 hpi hours post inoculation 在 分 生孢子侵 染点 处检测植 物产 生 HR 和 H 2 O 2 的形成率 形成率 HR 或 H 2 O 2 在侵 染点处形 成个 数 总侵染点 数 100 1 5 拟南芥过量表达 利用 ShARPC5 AF 5 GTCCATGGTACCCGGG GATCCATGGCTGAGATTGTCGAAGCA 3 下划线 为载体同 源臂 和 ShARPC5 AR 5 ACGGGGGACT CTAGAGGATCCTCACACAGTATTCACAGTGTCA GCA 3 下划 线为载体 同源 臂 扩增 ShARPC5 的 ORF 区段 重 组到 双元载 体 pCAMBIA3301 的 BamHI 限制 酶 Promega 位点 由 CaMV35S 启动子驱动 将 pCAMBIA3301 ShARPC5 转化到农 杆 菌 GV3101 然 后通过浸 花法 将其导入 Col 0 野生 型拟南 芥中 21 转 基因 T 1 代 植 株用含卡 那霉 素 25 g mL 1 的 0 5 MS 培养基 1 琼 脂进行阳 性筛 选 催芽 2 周后 将 抗卡 6 8 中 国 农 业 科 学 5 3 卷 那霉素幼 苗移 栽到土壤 中 从自交 的 T 1 株系中获 得卡 那霉素抗 性 的 T 2 代 植株 T 2 代植 株生 长 90 d 每个 处 理 3 4 株 然后 测定转 基因株系 对 On Lz 的抗 性 同时 上述 T 2 代植株通 过使 用特异性 引物 LP CGGTT CTCCAAATGAAGACTT RP AATTGAGACTTTTC AAAGGTAATA PCR 检 测确认为 转基 因植株 为 了 量化病原 菌生 长状况 在 7 dpi 统计 每个病 斑的分生 孢 子数 1 6 实时荧光定量PCR qRT PCR 分析 为了评估 在番 茄 MM 和 LA1777 上接 种病菌后 ARPC5 表达 量的变化 在 0 12 18 24 36 48 72 和 96 hpi 采样 提 取 RNA 反 转 为 cDNA 然 后 进 行 qRT PCR VIGS 试 验 中 在 0 24 48 和 72 hpi 检测沉默效率以及 PR1b1 PR1 和 Glucanase A PR2 Chitinase 3 PR3 表 达量 GAPDH 作为 内参基因 拟南芥转基因植物在 0 24 48 72 hpi 取样进 行 qRT PCR 以 UBQ10 为 内 参基因 表 1 使用 Biozol 总 RNA 提取 试剂盒提 取 总 RNA Qubit 2 0 Fluorometer 计算 RNA 浓度 使 用单链 cDNA 合成试剂 盒 和 oligo dT 18 引物将总 RNA 1 g 用 于 第一链 cDNA 合成 采用 IQ TM 5 real time PCR 系统 进 行 qRT PCR 扩增 在 qRT PCR 反应中 将 2 L 总 cDNA 添 加到含 有 10 L 2 SYBR 混合 液的 20 L PCR 反 应 液中 上 下 游 引物各 0 4 L 10 mol L 1 dH 2 O 7 2 L qRT PCR 反应条件 在 95 预 变性 10 min 随后在 95 变 性 15 s 40 个周 期 55 退 火 30 s 72 延 伸 30 s 定 量 结果通 过 2 CT 法计算 试 验 进行 3 次 生物 学重复 表1 qRT PCR 反应中的基因及引物 Table 1 Genes and primers in qRT PCR reaction 引物序列 Primer sequence 基因 Gene 正向引物 Forward primer sequence 5 3 反向引物 Reverse primer sequence 5 3 ShARPC5 SlARPC5 CGAAGGCATAATCACAAGA CAGCAAGACAACGCAGTA PR1b1 CATCCCGAGCACAAAAC TGAAGTCACCACCACCCT Glucanase A CTTTTACTTGTTGGGCTTCT ACTTCCTTTGAGGGCATT Chitinase 3 ACGCCATCCCCTAAAGA TGGACCCATCCCACATT GAPDH Control CTGGTGCTGACTTCGTTGTTG GCTCTGGCTTGTATTCATTCTCG AtARPC5 CGGAATGCTCAATGCTCT CGGTCCCCAGTAGAAAGTC UBQ10 Control AGAAGTTCAATGTTTCGTTTCATGTAA TTACGAATCCGAGGGAGCCATTG 1 7 数据分析 采用 SPSS 19 0 软件对 数据 进行统计 分析 应用 Duncan 氏 新复极 差法进行差异 显著性检验 P 0 05 表示两组 处理 间差异显 著 2 结果 2 1 番茄ARPC5鉴定和序列分析 利用拟南芥 ARPC5 作为探索基因 从番茄 LA1777 中克 隆到 767 个核 苷酸的基 因片 段 ShARPC5 Solyc01g090450 3 的开 放阅读框 399 bp 编码 132 个氨基酸 分 子量约 为 15 kD ShARPC5 与 AtARPC5 和 NtARPC5 具有高度 的序 列相似性 图 1 其同 源 性分别为 86 36 和 97 73 SMART 和 RCSB PDB 程序分析显示 ShARPC5 具有保守的 Pfam P16 Arc 结构域 氨基酸 2 131 其遗传关系与 AtARPC5 和 NtARPC5 密切相关 ProtComp 9 0 程序预测 ShARPC5 蛋 白具有不 同的 细胞定位 包 括质膜 胞外 细胞质 线粒体 内质网 过氧化物酶体 高尔基体 和叶绿体 2 2 ARPC5 差异性诱导表达 为了确定 ARPC5 的 表 达量 用 qRT PCR 检测番 茄与病原 菌互 作时 ARPC5 的 mRNA 表 达量 在 非亲 和互作中 与 0 hpi 相比 ARPC5 在 18 36 hpi 显著 上调表达 P 0 05 在 18 hpi 的表达 量达到峰 值 图 2 为对照 的 6 倍 此 外 在亲和互作中 ARPC5 表达量 在 18 hpi 显著 高于对 照 0 hpi 12 hpi 以及 36 96 hpi 表 达量显著 低于 对照 P 0 05 2 3 沉默 ShARPC5 对番茄抗病性的影响 为了确 定 ShARPC5 在病原 菌侵染番 茄中 的作用 利用烟草 脆裂 病毒 Tobacco rattle virus TRV 诱 导 沉默 ShARPC5 验证基 因功 能 接种 TRV2 ShPDS 的 叶片在接 种 后 30 d 出现 光漂白的 表型 图 3 A 证 1 期 冯婵婧等 番茄 ShARPC5 抗白粉病功能分析 69 Nicotiana sylvestris XM 009773667 NsARPC4 Arabidopsis thaliana AT4G14147 AtARPC4 Saccharomyces cerevisiae NM 001179579 ScARC19 Arabidopsis thaliana AT2G33385 AtARPC2 Solanum habrochaites Solyc09g090550 ShARPC2 Nicotiana sylvestris XM 009791646 NsARPC2 Solanum habrochaites Solyc05g006470 ShARPC1 Arabidopsis thaliana AT2G30910 AtARPC1 Saccharomyces cerevisiae NM 001178582 ScARC40 Arabidopsis thaliana AT4G01710 AtARPC5 Solanum habrochaites Solyc01g090450 ShARPC5 Nicotiana sylvestris XM 009765961 NsARPC5 Saccharomyces cerevisiae NM 001182259 ScARC18 Saccharomyces cerevisiae NM 001179412 ScARC15 Saccharomyces cerevisiae NM 001183212 ScARC35 Solanum habrochaites Solyc07g007630 ShARPC3 Nicotiana tomentosiformis XM 009610279 NtARPC3 Arabidopsis thaliana AT1G60430 AtARPC3 Arabidopsis thaliana AT3G27000 AtARP2 Saccharomyces cerevisiae NM 001180088 ScARP2 Saccharomyces cerevisiae NM 001181723 ScARP3 78 83 100 79 100 99 100 45 100 88 98 44 73 96 71 55 25 24 26 0 2 Solanum habrochaites Solyc12g098430 ShARPC4 B 66 66 66 66 66 66 66 66 131 131 131 131 131 131 131 131 ShARPCS AtARPCS StARPCS NtARPCS CaARPCS DhARPCS CaARPCS SiARPCS ShARPCS AtARPCS StARPCS NtARPCS CaARPCS DhARPCS CaARPCS SiARPCS Consensus Consensus Pfam P16 Arc domain amino acids 2 131 A A ShARPC5 的多重氨基酸序列比对以及氨基酸序列的特征 氨基酸序列中黑色部分表示同源性达到 100 粉色表示同源性 75 青色表示同源 性 50 Multiple protein sequence alignment of ShARPC5 and characterized members of ARPC5 proteins Black boxes indicate regions of 100 homology pink boxes indicate 75 homology level and cyan boxes highlight 50 homology level B ShARPC5 系统进 化分析 在不同的基因名称后显示各基 因登录号 Evolutionary analysis of ShARPC5 Accession numbers are shown after the gene names 图1 番茄ARP2 3复合体亚基ShARPC5的序列分析 Fig 1 Sequence analysis of tomato actin related protein 2 and 3 ARP2 3 complex subunit 5 ShARPC5 0 1 2 3 4 5 6 7 01 21 82 43 64 87 29 6 时间 Time hpi 相对表 达量 Relative expression 亲和 互作Compatible interaction 非亲 和互作Incompatible interaction 图2 qRT PCR 分析番茄叶片ARPC5表达量 Fig 2 ARPC5 expression in tomato leaves analyzed by qRT PCR 7 0 中 国 农 业 科 学 5 3 卷 TRV2 ShPDS TRV2 ShARPC5 CK A 0 2 4 6 8 10 12 14 16 71 4 时间 Time dpi 病 情指数 Disease index CK TRV2 ShARPC5 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 1 4 CK ShARPC5 PR1b1 Glucanase A Chitinase 3 相对 表达量 Relative expression 1 0 BC A 不同处理 对照株 沉默 ShPDS 植株 沉默 ShARPC5 植株 接种 白粉菌 7 d 后的表型观察 Infection phenotypes of CK TRV2 TRV2 ShPDS TRV2 ShARPC5 tomato leaves at 7 dpi B 对照株和沉默 ShARPC5 植株在接种白粉菌后 7 和 14 d 的病情指 数 Disease indexes of CK and TRV2 ShARPC5 plants at 7 and 14 dpi respectively C 对照株和沉默株接种白粉菌后 24 h ShARPC5 和 PRs 基 因表达量变化 Relative mRNA transcript levels of ShARPC5 and PRs at 24 hpi determined by qRT PCR 图3 在番茄上沉默ShARPC5 对On Lz菌株侵染能力的影响 Fig 3 Effect of silencing of ShARPC5 in tomato LA1777 plants on the infection ability of On Lz strain 实 TRV VIGS 沉默系统的稳定性 与对照相比 沉 默 ShARPC5 植株显示出明显的白粉病病斑 沉默株 的病情指数更高 在 7 和 14 dpi 分别达到 6 0 和 13 1 图 3 B 在 24 hpi ShARPC5 的沉默效率达到 78 图 3 C 且沉默株中 PR1b1 显著下调表达 P 0 05 2 4 沉默 ShARPC5 对番茄防卫反应的影响 通过显微观察病原菌侵染番茄叶片后植物上产生 的 HR 和 H 2 O 2 变化进一步 研究 ShARPC5 如何 参与番 茄抗病性 在 48 和72 hpi 沉默 ShARPC5 的植 株上 HR 形成率显著低于对照 分别为 26 和 36 图 4 A 在 72 hpi 沉默株 上的 H 2 O 2 形 成率显著 低于 对照 P 0 05 仅为 34 图 4 B 2 5 烟草瞬时表达ShARPC5 分析 为了进一 步检 测 ShARPC5 的功能 基 于 PVX 瞬 时植物表 达系 统 使 用本氏 烟 Nicotiana benthamiana 评估 ShARPC5 是否诱导植物细胞坏死 用表达 PGR106 GFP 的农杆菌 侵染 烟草叶片 不能 诱导产生 细 胞坏死 但是 用转 PGR106 ShARPC5 的 农杆菌侵 染烟 草叶片产生明显的细胞坏死 图 5 同 样 用表达 PGR106 BAX 的农杆菌 侵染 叶片也能 产生 坏死 2 6 过表达 ShARPC5 对拟南芥抗病性的影响 为了检 测 ARPC5 在拟南芥上的抗病性 分别在野 生型 Col 0 拟南芥和野生型 Col 0 转化 pCAMBIA3301 ShARPC5 植 株上接 种 On Lz 过表 达 over expression OE ShARPC5 拟南芥植株抗病性增强 植株叶片上 几乎未发 现白 粉病病斑 图 6 A 显 微观察发 现 与对照相比 在野生型 Col 0 转化 pCAMBIA3301 ShARPC5 植株上单个病斑分生孢子数显著减少 图 6 B P 0 05 3 讨论 通过核苷 酸和 氨基酸序 列比 对 表明番 茄 ARPC5 与拟